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Resumo

As culturas primárias de Müller glia obtidas a partir de retinas de camundongos representam uma ferramenta muito robusta e confiável para estudar a conversão gliaial em células progenitoras de retina após o tratamento de microRNA. Moléculas ou combinações únicas podem ser testadas antes de sua subsequente aplicação de abordagens in vivo .

Resumo

Müller glia (MG) é a glia predominante na retina neural e pode funcionar como fonte regenerativa para neurônios da retina. Em vertebrados inferiores, como peixes, a regeneração orientada por MG ocorre naturalmente; em mamíferos, no entanto, é necessária estimulação com certos fatores ou manipulação genética/epigenética. Como a MG compreende apenas 5% da população de células da retina, há necessidade de sistemas de modelo que permitam o estudo dessa população celular exclusivamente. Um desses sistemas de modelo são culturas primárias de MG que são reprodutíveis e podem ser usadas para uma variedade de aplicações, incluindo triagem e identificação de moléculas/fatores, testes de compostos ou fatores, monitoramento celular e/ou testes funcionais. Este modelo é usado para estudar o potencial de mamão murina para converter em neurônios de retina após suplementação ou inibição de microRNAs (miRNAs) via transfecção de miRNAs artificiais ou seus inibidores. O uso de camundongos repórteres específicos de MG em combinação com rotulagem imunofluorescente e sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) confirmou que 80%-90% das células encontradas nessas culturas são MG. Usando este modelo, descobriu-se que miRNAs podem reprogramar MG em células progenitoras de retina (RPCs), que posteriormente se diferenciam em células neuronais. As vantagens dessa técnica são que os candidatos do miRNA podem ser testados para sua eficiência e resultado antes de seu uso em aplicações in vivo .

Introdução

A glia Müller (MG) é a glia predominante na retina neural. Eles têm funções semelhantes em comparação com outras glia em outras partes do sistema nervoso central, como manter a água e a homeostase de íon, nutrir neurônios e proteger o tecido. Mg tem outra característica fascinante: embora sejam glia maduras, elas ainda expressam muitos genes expressos em células progenitoras de retina (RPCs) durante o desenvolvimento tardio 1,2. Essa semelhança é considerada a razão para a regeneração neuronal baseada em MG na retina do peixe após danos na retina 3,4. Durante esse processo, a MG reentra no ciclo celular e se desfastou em RPCs que, em seguida, se diferenciam em todos os seis tipos de neurônios da retina. Embora este fenômeno ocorra naturalmente em peixes, os mamíferos MG não se convertem em neurônios 5,6. Eles podem, no entanto, ser reprogramados. Uma variedade de fatores tem sido mostrado para reprogramar MG em RPCs/neurônios; entre esses fatores está o fator básico de transcrição helix-loop-helix (bHLH) que está envolvido na regeneração de peixes 7,8. Em camundongos, Ascl1 só é expresso em RPCs durante a retinogênese, mas está ausente em MG maduro ou neurônios de retina9.

A reprogramação de células diretamente in vivo não só é metodologicamente desafiadora, mas também requer a aprovação de um comitê institucional de cuidados e uso de animais. Para receber aprovação, são necessários dados preliminares sobre os fatores usados ou alterados, concentrações, efeitos fora do alvo, mecanismos subjacentes, toxicidade e eficiência. Os sistemas de cultura celular permitem testes para esses critérios antes do uso em modelos in vivo. Além disso, como MG compreende apenas cerca de 5% de toda a população de células da retina10, as culturas de MG permitem o estudo de sua função11, bem como seu comportamento, incluindo migração12,13, proliferação14, reação de estresse a lesões/danos15,16, sua interação com outros tipos celulares como microglia17 ou células de gânglios de retina (RGCs)18, ou seu potencial neurogênico 19,20,21. Muitos pesquisadores usam linhas celulares imortalizadas para seus estudos, pois têm um potencial proliferativo ilimitado e podem ser facilmente mantidas e transfetizadas. As células primárias, no entanto, são preferíveis para ensaios biologicamente relevantes do que células imortalizadas, pois possuem características celulares verdadeiras (expressão genética e proteica) e, mais importante, representam um certo estágio no desenvolvimento e, portanto, têm uma "idade". A idade de um animal (e consequentemente das células obtidas de um animal) é um fator especialmente crucial na reprogramação celular, uma vez que a plasticidade celular reduz com o estágio de desenvolvimentoprogredido 22.

Este protocolo descreve em detalhes como reprogramar MG primário com miRNAs como um método in vitro atual para estudar a regeneração. Este modelo de cultura primária de MG foi criado em 2012 para avaliar as características de proliferação celular de MG em camundongos knock-out P53 (trp53-/- camundongos)23. Mostrou-se que mg cultivados mantêm suas características gliais (ou seja, expressão de proteínas S100β, Pax6 e Sox2 avaliadas via rotulagem imunofluorescente), e que se assemelham a in vivo MG (microarray de FACS-purificado MG)23. Pouco depois, mRNA glial e expressão proteica foram validados e confirmados em uma abordagem diferente utilizando vetores virais20. Alguns anos depois, foi confirmado que a grande maioria das células encontradas nessas culturas são MG usando o Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl reporter mouse24. Além disso, a quantificação do conjunto de miRNAs tanto em MG purificada facs quanto em MG primária cultivada mostrou que os níveis de MG miRNAs (mGLiomiRs) não variam muito em MG cultivada durante a fase de crescimento. Períodos de cultura alongados, no entanto, causam alterações nos níveis de miRNA e, consequentemente, nos níveis de mRNA e expressão proteica, uma vez que os miRNAs são reguladores translacionais25.

Em 2013, este modelo de cultura mg foi utilizado para testar uma variedade de fatores de transcrição no que diz respeito à sua capacidade de reprogramar MG em neurôniosretinais 20. O Ascl1 foi considerado um fator de reprogramação muito robusto e confiável. A superexpressão de Ascl1 através de vetores virais induziu alterações morfológicas, expressão de marcadores neuronais e aquisição de propriedades eletrofisiológicas neuronais. Mais importante, os insights e resultados obtidos a partir desses primeiros experimentos in vitro foram transferidos com sucesso para aplicações in vivo 22,26 demonstrando que as culturas primárias de MG representam uma ferramenta sólida e confiável para triagens iniciais de fatores e avaliação de recursos gliais antes da implementação in vivo.

Alguns anos atrás, foi mostrado que o miRNA miR-124 enriquecido pelo cérebro, que também é altamente expresso em neurônios da retina, pode induzir a expressão Ascl1 em MG21 cultivada. A expressão ascl1 em células vivas foi visualizada através de um rato repórter Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Um rato repórter é um rato geneticamente modificado que tem um gene repórter inserido em seu DNA. Este gene repórter codifica uma proteína repórter, que está neste estudo tdTomato, uma proteína fluorescente vermelha. Esta proteína repórter relata a expressão de um gene de interesse, neste caso, Ascl1. Em outras palavras, as células que expressam Ascl1 ficarão vermelhas. Uma vez que o Ascl1 é expresso apenas em RPCs9, este rato Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl permite o rastreamento da conversão de MG em RPCs expressos ascl1 , o que significa que as células de conversão expressarão proteína de repórter tdTomato fluorescente vermelho. Esta é uma rotulagem irreversível, já que o DNA dessas células é alterado. Consequentemente, qualquer diferenciação neuronal subsequente será visualizada porque o rótulo tdTomato permanece em células diferenciadoras. Se ascl1 expressando RPCs derivados de MG (com rótulo tdTomato) se diferenciarem em neurônios, esses neurônios ainda terão seu rótulo vermelho. Este mouse, portanto, permite não apenas a rotulagem de RPCs derivados de MG para imagens de células vivas, mas também permite mapeamento de destino e rastreamento de linhagem desses RPCs derivados de MG (vermelho). Mais recentemente, o conjunto de miRNAs em RPCs foi identificado e as culturas mg de ratos Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter foram usadas para tela e teste o efeito desses miRNAs na capacidade de reprogramação e eficiência27. Um candidato, o RPC-miRNA miR-25, foi encontrado capaz de reprogramar MG cultivado em células expressantes Ascl1 (Ascl1-Tomate+). Essas células reprogramadas adotam características neuronais ao longo do tempo, incluindo morfologia neuronal (pequeno somata e processos finos curtos ou longos), expressão de transcrições neuronais medidas via scRNA-Seq, bem como expressão de proteínas neuronais validadas via rotulagem imunofluorescente27.

Aqui, o protocolo detalha como crescer e transfectar MG a partir de camundongos P12 adaptados do trabalho anterior 21,24,27. Escolhido para este protocolo é o miRNA miR-25 acima mencionado, um miRNA altamente expresso em RPCs, com baixos níveis de expressão em MG ou neurônios de retina. Para superexpressar o miR-25, são utilizadas mímicas de murine miR-25, ou seja, moléculas artificiais de miRNA. Como controle, são escolhidas imitações de um miRNA de caenorhabditis elegans, que não têm função em células de mamíferos. A visualização da conversão de MG em RPCs foi realizada através do mouse repórter RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), um mouse com fundo misto (cepas C57BL/6, S129 e ICR). Essa cultura pode, no entanto, ser realizada com todas as cepas de camundongos, incluindo cepas do tipo selvagem. Nos últimos anos, o protocolo original foi modificado para reduzir a duração da fase de crescimento e o período de cultura geral e garantir um status celular glia mais robusto e minimizar o grau de degeneração celular, que ocorre em períodos de cultura prolongada. O horário regular de transfecção também foi estendido de 3h para 2 dias. Como mencionado anteriormente, embora o protocolo atual descreva as culturas de MG como uma ferramenta para estudos de regeneração, o método não é apenas útil para testar fatores de reprogramação, mas também pode ser adaptado para outras aplicações, incluindo estudos sobre comportamento migratório ou proliferativo de MG, paradigmas relacionados a lesões/danos celulares e/ou a identificação de mecanismos e caminhos subjacentes.

Protocolo

Os procedimentos envolvendo matérias animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade suny de Optometria.

NOTA: Este protocolo de cultura consiste em três fases: crescimento, transfecção e fase de conversão. Um resumo do protocolo geral com o cronograma é dado na Figura 1.

1. Preparação de mídia e todos os reagentes necessários

NOTA: Todas as etapas precisam ser realizadas em um gabinete de biossegurança A2 ou B2 (BSC). Durante a fase de crescimento, é utilizado um meio de crescimento de alto soro que consiste em um meio neuronal basal complementado com fator de crescimento epidérmico (EGF). Para a fase de conversão, um meio basal neurofisiológico de baixo soro suplementado com suplementos neuronais é usado para garantir a diferenciação neuronal e a sobrevivência.

  1. Prepare o meio de crescimento (utilizado durante a fase de crescimento) suplementando 200 mL de meio neuronal basal com 20 mL de soro bovino fetal (FBS, 10%), 1 mL de L-glutamina de 200 mM (0,5%), 2 mL de penicilina/estreptomicina (1%) e 2 mL de suplemento N2 (1%). Realizar filtragem estéril (unidades de filtro com tamanho de poros de 0,22 μm). Pré-aqueça o meio em banho de contas metálicas de 37 °C antes de usar.
  2. Prepare o meio neuronal (usado durante a fase de conversão) seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais) suplementando 100 mL de meio basal neurofisiológico sem soro com 2 mL de suplemento neuronal B27 (2%), 1 mL de suplemento N2 (1%), 20 μL de 100 ng/mL fator neurotrópico derivado do cérebro (BDNF, reconstituído em 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) em soro tamponado fosfato (PBS, concentração final 20 ng/mL), 20 μL de 100 ng/mL fator neurotrófico derivado de células glia (GDNF, reconstituído em solução de sal balanceado estéril hanks [HBSS], concentração final 20 ng/mL), 500 μL de 100 mg/mL Dibutyryl-cAMP (reconstituto em DMSO), 70 μL de ácido ascoróbico ng/mL (reconstituto em PBS estéril) e 1,5 mL de penicilina/estreptomicina. Realizar filtragem estéril (unidades de filtro com tamanho de poros de 0,22 μm). Meio pré-aquecido em banho de contas metálicas de 37 °C antes de usar.
    NOTA: Estas mídias podem ser armazenadas a 4 °C, durante 1 mês.
  3. Reconstituir os reagentes Papain, DNase I e Ovomucoid necessários para dissociação da retina seguindo o protocolo do fabricante. Aliquot 750 μL de Papain em tubos estéreis de 1,5 mL, 75 μL de DNase I em tubos estéreis de 0,6 mL, e 750 μL de inibidor de protease Ovomucoid em tubos de 2 mL. Congele papain e DNase I alíquotas a -20 °C e mantenha as alíquotas ovomucoid a 4 °C para evitar a degradação dos reagentes. Descongele à temperatura ambiente antes do uso.
    NOTA: Papain, DNase I e Ovomucoid são encontrados em um kit chamado Sistema de Dissociação papain (ver Tabela de Materiais).
  4. Reconstituir poli-L-ornithine (Poly-O) e Laminin para revestimento de deslizamento de cobertura se a rotulagem imunofluorescente for realizada seguindo as instruções da folha de dados (Poly-O: 0,1 mg/mL em água estéril; Laminina: diluir 1,2 mg/mL à 1:50 em DMEM). Aliquot Poly-O e Laminin (2,5 mL) e alíquotas de congelamento a -20 °C. Descongele à temperatura ambiente antes do uso.
    NOTA: Passo 1.4. só é necessária se a rotulagem imunofluorescente e a microscopia de varredura a laser forem realizadas.

2. Extração de camundongos e tecidos

NOTA: Para esses estudos de reprogramação, o mouse Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl foi criado cruzando um mouse Ascl1CreERT (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) com um tdTomatoSTOPfl/fl mouse (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914). Este mouse tem um fundo misto (C57BL/6, S129 e cepa ICR). O genótipo deste mouse é mostrado na Figura 1A. Todas as cepas podem ser usadas para este protocolo.

  1. Use luvas e higienize o espaço de trabalho, incluindo microscópio de dissecção e todas as ferramentas finas (Dumont #5 fino e Dumont #7 fórceps curvos, tesoura fina e tesoura Vannas) com 70% de etanol. Higienize um prato de dissecção preto revestido de silicone de 10 cm expondo-o à luz UV por 20 min.
  2. Preparação de pratos e pratos para extração de tecidos
    1. Prepare uma placa de 24 poços para coleta de olhos e separação de amostras (dois olhos por mouse em um bem, rotulado com IDs do mouse) com ~1 mL de HBSS frio (4 °C) por poço. Coloque a placa de 24 poços no gelo.
    2. Encha uma placa de Petri estéril de 10 cm (para lavar) e a placa de dissecção revestida de silicone higienizada com vários mL de HBSS frio (4 °C) para garantir que o tecido esteja totalmente coberto com HBSS.
    3. Prepare um tubo estéril de 1,5 mL com 1 mL de 70% de etanol.
    4. Prepare uma placa de cultura de 12 poços rotulando a placa com número de cultura, data, tensão e todas as informações necessárias.
  3. Eutanize ratos P12 usando qualquer método aprovado.
  4. Remoção ocular
    1. Segure suavemente a cabeça do rato com o polegar e o dedo indicador ao redor do olho.
    2. Usando as fórceps curvas Dumont #7, vá suavemente atrás do globo ocular e corte o nervo óptico. Tire cuidadosamente o olho.
      NOTA: Se forem usados camundongos adultos, não utilize fórceps curvos e não puxe o olho. Em vez disso, corte cuidadosamente ao redor do globo ocular usando uma tesoura fina; cortar o nervo óptico, mas não cortar o olho em si. Use fórceps para remover cuidadosamente o globo ocular.
  5. Limpeza de globos oculares
    1. Mergulhe o globo ocular brevemente em um tubo contendo etanol para evitar o transporte de bactérias do animal.
    2. Lave o globo ocular brevemente na placa de Petri de 10 cm antes de colocá-lo na placa de 24 poços no gelo.
  6. Repita os passos 2.4 e 2.5 para os outros olhos. Mantenha a placa do poço no gelo durante o processo. Coloque dois olhos de um animal na folha de dissecção colocada sob um microscópio de dissecção com uma fonte de luz.
  7. Extração de retina
    1. Fixar um globo ocular agarrando o nervo óptico e o tecido conjuntivo circundante ao redor da esclera com as fórceps finos Dumont #5 e pressione-o cuidadosamente contra o prato de dissecção (córnea para cima).
    2. Faça um buraco no centro da córnea usando uma agulha de 30 G para permitir um acesso mais fácil para a tesoura Vannas.
    3. Disseca a córnea ao redor do corpo ciliar usando a tesoura Vannas e remova córnea, lente, íris e corpo vítreo cuidadosamente com fórceps finos Dumont #5. A Figura 2A ilustra um copo ocular com a retina dentro.
    4. Disseque a esclera com a tesoura Vannas até que o nervo óptico seja atingido. Corte o nervo óptico e extraia cuidadosamente a retina usando fórceps finos Dumont #5.
    5. Use um segundo par de fórceps finos Dumont #5 para empurrar contra a retina e permitir a remoção completa do corpo vítreo. A Figura 2B ilustra duas retinas extraídas.
  8. Transferência e lavagem
    1. Corte cerca de 2,5 cm da ponta de uma pipeta de transferência estéril para ampliar o diâmetro. Usando esta dica, pegue (chupe) retinas inteiras sem danificar o tecido.
    2. Transfira as retinas para uma nova placa de Petri estéril com HBSS frio (4 °C) e balance o prato (para frente e para trás, esquerda e direita).
    3. Usando a ponta de pipeta de transferência, empurre cuidadosamente as retinas ao redor para lavar as células epiteliais do pigmento da retina (RPE).
      NOTA: Alternativamente, toda a retina com lente e corpo vítreo pode ser removida do copo ocular. Em seguida, a lente e o corpo vítreo podem ser removidos da retina extraída. Se a retina estiver rasgada, certifique-se de coletar todas as peças para dissociação; caso contrário, haverá quantidades insuficientes de tecido para crescer camadas celulares confluentes.
  9. Coloque imediatamente a retina isolada em um novo poço limpo da placa de 24 poços preenchida com 1 mL de HBSS. Mantenha a placa de 24 poços no gelo durante o processo de dissecção.
  10. Repita as etapas 2.7-2.9 para isolar a segunda retina.

3. Dissociação da retina

NOTA: Todas as etapas a seguir (até a colheita celular) precisam ser realizadas em um gabinete de biossegurança A2 ou B2 (BSC).

  1. Prepare a mistura de dissociação Papain/DNase I da seguinte forma.
    1. Para seis retinas, adicione 75 μL de DNase I no tubo contendo 750 μL de Papain (a partir do passo 1.3) e misture cuidadosamente (mistura de dissociação).
    2. Para a preparação individual da amostra necessária para este protocolo, divida o volume total de 825 μL em três alíquotas: 275 μL da mistura em um tubo de 1,5 mL por rato (duas retinas). Calcule as quantidades necessárias de DNase I e Papain em conformidade.
      NOTA: Até seis retinas podem ser dissociadas em um tubo de mistura Papan/DNase I. No entanto, a preparação individual da amostra resulta em menos aglomerados e melhor crescimento celular do que em amostras combinadas.
  2. Transfira duas retinas para a mistura de dissociação Papain/DNase I. Use uma pipeta de transferência com diâmetro de ponta aumentada (etapa 2.8.1), pegue as retinas, espere até que as retinas se acomodem na parte inferior da ponta e, em seguida, solte as retinas sem HBSS excessivo no tubo contendo mistura Papain/DNase I.
  3. Coloque em um nutador e incuba-o por 10 minutos em uma incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO2).
  4. Dissociar as células ao encanar cuidadosamente para cima e para baixo (cerca de 20-30 vezes) com uma pipeta de 1 mL. Depois que as células forem dissociadas (ou seja, resultando em uma solução homogênea sem pedaços), adicione 275 μL de inibidor de protease Ovomucoid do Kit de Dissociação do Papain para neutralizar o Papain. Misture suavemente por pipetting para cima e para baixo.
    NOTA: Se seis retinas foram dissociadas em 825 μL de mistura De Papain/DNase I, 825 μL de Ovomucoid é necessário.
  5. Centrifugar a mistura a 300 x g por 10 min a 4 °C.
  6. Adicione o fator de crescimento epidérmico (EGF, 1 μL por 1 mL do meio de crescimento, reconstituído a 200 μg/mL em PBS) ao volume calculado de meio de crescimento (1 mL por mouse) pré-aquecido a 37 °C.
    NOTA: Dependendo do design experimental, o marcador de proliferação 5-ethynyl-2'-deoxyuridina (EdU), bem como 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) ou outros fatores necessários podem ser adicionados no início do período cultural.
  7. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga. Não toque na pelota na parte inferior do tubo.
  8. Remova o supernatante com cuidado e completamente. Resuspende a pelota celular com 500 μL de meio de crescimento suplementado por EGF.
  9. Transfira a suspensão da célula para um poço da placa de 12 poços (Figura 2C). Enxágüe o tubo com mais 500 μL do meio de crescimento suplementado pelo EGF e adicione-o ao poço (volume total de 1 mL por poço).
  10. Repita as etapas 3.8 e 3.9 com todas as outras amostras.
  11. Balance a placa do poço três vezes com cuidado (para frente e para trás; esquerda e direita). Coloque a placa na incubadora (37 °C, CO2).
    NOTA: Se forem utilizados camundongos transgênicos, realize a genotipagem para cada animal (Figura 2D). Identifique cre recombinase camundongos positivos e negativos e rotule a placa em conformidade. Para este protocolo, apenas células de Cre recombinase repórteres positivos foram usadas para os próximos passos. As células dos espécimes negativos de Cre são congeladas e usadas para outras aplicações.

4. Fase de crescimento

NOTA: A fase de crescimento tem duração de cerca de 4-5 dias (Figura 1B). Para adicionar líquidos a poços que contenham células, a pipeta precisa apontar para a parede do poço e o líquido precisa ser liberado lentamente para evitar o descolamento celular. Não encolé-lo diretamente em cima das células.

  1. Um dia após a dissociação, remova o meio e adicione 1 mL de meio de crescimento fresco complementado por EGF.
  2. No dia 3, remova o meio e adicione 1 mL de HBSS (temperatura ambiente) para remover detritos celulares. Rock suavemente para frente e para trás da esquerda para a direita. Remova o HBSS, repita a etapa de lavagem e adicione 1 mL de meio de crescimento pré-aquecido complementado pelo EGF.
  3. Monitore as células todos os dias e avalie seu estado de crescimento até que as células atinjam 90%-100% de confluência. A Figura 3 mostra um exemplo de bom crescimento de MG ao longo do tempo. Verifique se há possível contaminação ou morte celular (Figura Suplementar 1). Descarte culturas contaminadas.
    NOTA: Para monitorar e registrar o estado celular, tire imagens em várias ampliações usando um microscópio de luz com uma câmera conectada e objetivos de 4x, 10x ou 20x. Neste estudo, é utilizado um microscópio de fluorescência.

5. Preparação de tampas com poli-L-ornithine (Poly-O) e casaco laminin

NOTA: Esta etapa só é necessária se a rotulagem imunofluorescente e a microscopia de varredura a laser confocal forem realizadas. As tampas de vidro redondo (12 mm de diâmetro) são necessárias para uma imagem adequada. O protocolo de revestimento também pode ser encontrado na folha de dados média neuronal (ver Tabela de Materiais).

  1. Coloque tampas estéreis cuidadosamente no centro de cada poço de uma placa de 24 poços usando fórceps Dumont #2AP estéreis.
    NOTA: Coloque as tampas no centro do poço. Colocar tampas perto da parede de um poço causará problemas de tensão superficial para as etapas seguintes.
  2. Descongele uma alíquota de 2,5 mL poly-O à temperatura ambiente e coloque 100 μL dele no centro de cada deslizamento de cobertura.
  3. Incubar a placa do poço por 30 min em uma incubadora de 37 °C.
  4. Remova o Poly-O e lave o poço com o deslizamento de tampa três vezes com ~1 mL de água estéril.
  5. Deixe a placa do poço secar durante a noite no BSC. Descongele 2,5 mL de Laminin a 4 °C durante a noite.
  6. Na manhã seguinte, adicione 100 μL de Laminin no centro de cada deslizamento de cobertura e incubar por 4h em uma incubadora de 37 °C.
  7. Remova o Laminin com cuidado e completamente.
  8. Mantenha a placa a 4 °C se a passagem não puder ser realizada imediatamente.
    NOTA: As tampas revestidas nas placas preparadas podem ser mantidas por alguns dias a 4 °C.

6. Passagem celular para remover sobreviventes neuronais

NOTA: A passagem celular é necessária para remover células neuronais, não para aumentar a população celular. Glia se divide apenas algumas vezes e não crescerá mais após a passagem. Não diluir as suspensões celulares. As células de um poço confluente de uma placa de 12 poços podem ser distribuídas em um poço de uma placa de 12 poços ou dois poços de uma placa de 24 poços. Quando as tampas revestidas são usadas, apenas cerca de um terço do deslizamento de tampa é revestido. Portanto, seis tampas sentadas em uma placa de 24 poços, com células confluentes (~80%-90%) podem ser obtidas de um poço de células confluentes de uma placa de 12 poços. Outras proporções podem ser escolhidas também para aumentar ou diminuir a densidade celular. Para este protocolo, é utilizado um mouse repórter Cre+ [um experimento, dois tratamentos: miR-25 ou control-miR; análise técnica n = 3 (três tampas por tratamento), réplica biológica n = 1]. O número de réplicas técnicas e biológicas pode ser definido de forma diferente, dependendo do desenho experimental.

  1. Verifique se as células são 90%-100% confluentes (também na margem do poço; Figura 3e,f).
  2. Retire o meio e adicione 1 mL de HBSS (temperatura ambiente) para lavar. Balance suavemente a placa (para frente e para trás, esquerda e direita). Remova completamente o HBSS.
  3. Adicione 500 μL de uma solução pré-aquecida contendo trippsina (pré-aquecida a 37 °C em um banho de contas metálicas) para separar as células do poço. Bata suavemente (para frente e para trás, da esquerda para a direita) e incubar por 2 min em uma incubadora de 37 °C.
  4. Mova a placa da incubadora para bsc. Ao inclinar, aspire a solução contendo trippsina e disperse-a cuidadosamente e lentamente sobre o poço várias vezes até que as células se desprendem completamente. Segure a placa contra a luz e certifique-se de que não restam células na parte inferior.
  5. Transfira esta suspensão celular para um tubo estéril de 1,5 mL. Centrifugar a 300 x g por 8 min a 4 °C.
  6. Remova o supernasce e ressuspenque cuidadosamente a pelota celular adicionando 600 μL (100 μL por poço para 6 poços/tampas) de meio de crescimento pré-aquecido (complementado com EGF; 1:1000). e pipetting para cima e para baixo ~30-40 vezes.
    NOTA: As células podem ser congeladas neste momento a -80 °C ou em nitrogênio líquido e descongeladas seguindo protocolos padrão para descongelamento de linhas celulares. Se as células forem congeladas, elas não serão resuspengiadas em meio suplementado por EGF (meio de crescimento). Eles serão resuspengiados em meio básico (sem EGF) e solução de congelamento (proporção 1/1). As etapas 6.1.1 a 6.6.2 descrevem os passos para congelar as células. Se nenhuma célula estiver congelada, continue com o passo 6.7.
    1. Prepare a solução de congelamento misturando 100 μL de DMSO e 400 μL de FBS (volume total de 500 μL por poço/amostra).
    2. Resuspenda a pelota celular em 500 μL de meio de crescimento pré-aquecido. Adicione a suspensão da célula a 500 μL de solução de congelamento DMSO/FBS (volume total de 1 mL). Mantenha tubos no gelo até que todas as amostras sejam processadas. Congele as células a -20 °C por 1h e, em seguida, armazene a -80 °C.
  7. Células de sementes colocando 100 μL da suspensão de célula/mídia de 600 μL (etapa 6.6) no centro de seis tampas revestidas (ver passo 5) da placa de 24 poços. Coloque a placa cuidadosamente na incubadora e deixe as células se acomodarem.
    NOTA: 100 μL da suspensão celular de 600 μL (colhida de um poço de uma placa de 12 poços) resultará em confluência celular de 90%-100%, necessária para a transfecção.
  8. Verifique as células depois de 3 horas para ver se elas se estabeleceram na tampa. Adicione 400 μL de meio de crescimento complementado com EGF.
    NOTA: As células geralmente estão prontas para transfecção no dia seguinte (Figura 3G). Se não for confluente (90%-100%), deixe-os por mais um dia. Se ainda não for confluente, não os use para transfecção. Se outras aplicações a jusante forem realizadas, como perfil de miRNA, RNA-Seq, RT-qPCR ou mancha ocidental, as células precisam ser passagemdas para placas de 12 poços (proporção 1:1; sem necessidade de tratamento de placas) e colhidas para extração de RNA/proteína.

7. Transfecção

NOTA: A fase de transfecção consiste apenas em uma fase de 3h apenas no meio de transfecção (os procedimentos de transfecção são descritos no manual de transfecção que vem com o reagente de transfecção) e uma fase alongada em que o reagente de transfecção e miRNAs ainda estão presentes, mas o meio neuronal com suplementos necessários é adicionado (a duração total é de 2 dias; Figura 1B). Neste protocolo, seis poços serão transfeinados: três poços receberão a reprogramação miRNA miR-25 e três poços receberão o miRNA de controle.

  1. Verifique se as células atingiram 90% de confluência e registem/imagem das células antes da transfecção.
  2. Remova o meio de crescimento e adicione 500 μL de HBSS (temperatura ambiente) para lavar as células.
  3. Remova o HBSS e adicione 400 μL de meio de soro reduzido usado para transfecções. Coloque a placa de volta em uma incubadora de 37 °C.
  4. Prepare a mistura de transfecção seguindo as instruções do protocolo de reagente de transfecção do fabricante. Faça duas misturas: mistura de reagente de transfecção e mix de miRNA (ver Figura 1B para ilustração).
    1. Prepare a mistura de reagente de transfecção: Para uma placa de 24 poços, são necessários 49 μL de meio soro reduzido e 1 μL de reagente de transfecção para um poço (50 μL no total). Para seis poços, 294 μL de meio soro reduzido e 6 μL de reagente de transfecção são combinados e misturados bem por tubos suavemente para cima e para baixo.
    2. Prepare a mistura de mímica miRNA: Para uma placa de 24 poços, é necessário um volume total de 50 μL da mistura de mímica para um poço. Três poços receberão o miRNA de controle e os outros três poços serão tratados com miR-25. Para este protocolo, é utilizada uma concentração final de 200 nM.
      1. Para o tratamento miR-25 (três poços), 150 μL de meio soro reduzido e 3 μL de miR-25 (solução de estoque de 100 μM) são combinados e misturados bem por tubos suavemente para cima e para baixo. Incubar por 5 minutos.
        Para o tratamento de imitações de controle (três poços), 150 μL de meio soro reduzido e 3 μL de mímicas de controle-miRNA (solução de estoque de 100 μM) são combinados e misturados bem por tubos suavemente para cima e para baixo. Incubar por 5 minutos.
        NOTA: O volume de mímicas de miRNA depende do fator de diluição e concentração necessário (20-500 nM). inibidores de miRNA (antagomirs), ou outras moléculas, incluindo plasmídeos, também podem ser usados. Além disso, combinações de moléculas são possíveis de serem transfeinadas.
  5. Combine mistura de mímica miRNA e mistura de reagente de transfecção. Misture cuidadosamente por pipetar lentamente e cuidadosamente, pipetando suavemente para cima e para baixo. Incubar por 20 min a temperatura ambiente (por instruções do fabricante).
  6. Adicione a mistura de transfecção acima de forma gota e lentamente em cima das células, perto da superfície da mídia no poço usando uma pipeta de 20 μL. Balance a placa suavemente (para frente e para trás, da esquerda para a direita).
  7. Incubar em uma incubadora de 37 °C por 3 h.
  8. Após 3h, adicione o meio neuronal aos poços (500 μL por poço) complementado com 4-Hydroxytamoxifen (estoque de 5 mM reconstituído com 2,58 mL de etanol, Concentração final de 250 nM) para ativar a recombinase de Cre e 5-ethynyl-2'-deoxyuridina (EdU, solução de estoque de 10 mM reconstituída com 2 mL de DMSO, 1 μM de concentração final) para rastrear a proliferação celular.
    ATENÇÃO: 4-Hydroxytamoxifen e EdU são conhecidos por serem cancerígenos humanos, teratogens e mutagens. Leia a ficha técnica de segurança do material antes de usar e usar luvas, óculos e jaleco. Reconstitua ambos os reagentes de acordo com as recomendações do fabricante. Não inale a substância/mistura. Feche bem após o uso. Os resíduos devem ser descartados seguindo as normas nacionais e locais. Lave as mãos e o rosto depois de trabalhar com a substância.
  9. Incubar em uma incubadora de 37 °C por 2 dias (Figura 1B).

8. Conversão celular

NOTA: A fase de conversão celular tem uma duração de cerca de 5-6 dias (Figura 1B), mas períodos mais longos são possíveis.

  1. Verifique as células diariamente para obter uma indução bem sucedida da expressão tdTomato, morte celular potencial e/ou contaminação. A densidade celular não muda (Figura 4). As primeiras células fluorescentes vermelhas fracas podem ser observadas 1 dia após o tratamento 4-Hidroxytamoxifen. Um microscópio fluorescente é necessário para monitorar e imaginar as células.
    NOTA: Neste estudo, um microscópio de fluorescência é usado para imagens vivas. As imagens são tiradas com objetivos 4x, 10x ou 20x.
  2. Dois dias após a transfecção, remova o meio e adicione 500 μL de meio neuronal pré-aquecido complementado com 4-Hydroxytamoxifen e EdU em cada poço.
  3. Substitua o meio por um meio fresco a cada dois dias até que as células sejam colhidas.
  4. Faça imagens ao vivo para avaliação e avaliação do número de células fluorescentes vermelhas (Ascl1 expressando) e suas alterações morfológicas (Figura 4 e Figura 5A-C).

9. Colheita celular: fixação para rotulagem imunofluorescente

NOTA: As células podem ser colhidas para outras aplicações a jusante, incluindo volume ou scRNA-Seq, RT-qPCR ou mancha ocidental.

  1. Retire o meio e adicione 500 μL de HBSS frio (4 °C) por poço e balance a placa suavemente (para frente e para trás, da esquerda para a direita). Remova o HBSS.
  2. Fixar as células adicionando 500 μL de 2% paraformaldeído (PFA) e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente.
  3. Realizar rotulagem imunofluorescente de acordo com protocolos estabelecidos.

Resultados

Este protocolo descreve como cultivar MG a partir de retinas de camundongos P12 e como reprogramar essas células com miR-25 em neurônios de retina usando o rato repórter Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. Este método foi utilizado em trabalhos anteriores relatando em detalhes outros miRNAs adequados (imitadores ou inibidores, como moléculas únicas ou em combinação) para reprogramar MG em RPC que, em seguida, adotam características celulares neuronais27. Este...

Discussão

Este protocolo descreve como cultivar MG a partir de retinas de camundongos dissociados para estudos de reprogramação usando miRNAs. Como mostrado e confirmado em uma variedade de estudos anteriores, a grande maioria (80%-90%) das células encontradas nessas culturas são MG 20,23,24. Este método é uma técnica muito robusta e confiável e os resultados podem ser facilmente reproduzidos se o protocolo for seguido corretament...

Divulgações

Uma patente, incluindo algumas das conclusões deste relatório, foi arquivada pela Universidade de Washington com os inventores Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl e Thomas A. Reh. A patente é intitulada ''Métodos e composições para estimular a regeneração da retina.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Dra. Agradecimentos especiais aos Drs. Tom Reh, Julia Pollak e Russ Taylor por introduzirem culturas primárias de MG como uma ferramenta de triagem para a S.G.W. durante o treinamento de pós-doutorado na Universidade de Washington, em Seattle. O estudo foi financiado pelo Empire Innovation Program (EIP) Grant to S.G.W. e fundos in start-up da SUNY Optometria para a S.G.W., bem como o prêmio R01EY032532 do National Eye Institute (NEI) para s.G.W.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/JJax laboratories#012882Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/JJax laboratories#007914Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomerSigma-AldrichH7904-5MGreconstituted in ethanol, frozen aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solutionVWR100504-7822% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories711-546-152dilution 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories705-606-147dilution 1:500
Anti-human Otx2 Antibody, R&D SystemsFisher ScientificAF1979dilution 1:500
Anti-rabbit MAP2 antibodySigma-AldrichM9942-200ULdilution 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibodyAntibodies-OnlineABIN334653dilution 1:500
Ascorbic AcidSTEMCELL Technologies72132reconstituted in PBS, frozen aliquots
B-27 SupplementFisher Scientific17-504-044frozen aliquots
Brain Phys Neuronal MediumSTEMCELL Technologies05790used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.1643
231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging KitFisher ScientificC10340reconstitute following manual, 4°C
Dibutyryl-cAMPSTEMCELL Technologies73886reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificMT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher ScientificMT35010CVfrozen aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX SupplementFisher Scientific51-985-034store at 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol redFisher Scientific12-605-028used as solution containing trypsin, store at 4 °C
HBSSFisher Scientific14-025-134store at 4 °C
Laminin mouse protein, naturalFisher Scientific23-017-015

frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.164323
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KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)

L-GlutamineFisher Scientific25-030-081frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negative ControlHorizonCN-001000-01-50reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimicHorizonC-310564-05-0050reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
N-2 SupplementFisher Scientific17-502-048frozen aliquots
Neurobasal MediumFisher Scientific21-103-049used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C
Papain Dissociation SystemWorthington BiochemicalLK003153reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots
Penicillin StreptomycinFisher Scientific15-140-122frozen aliquots
Phosphate-buffered saline (PBS)Fisher Scientific20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromideSigma-AldrichP4538-50MGreconstituted in steriled water, frozen aliquots
Recombinant Human BDNF ProteinR&D Systems248-BDB-050/CFreconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots
Recombinant Mouse EGF ProteinFisher Scientific2028EG200reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Recombinant Rat GDNF ProteinFisher Scientific512GF010reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories712-296-150dilution 1:1,000
Slide Mounting MediumFisher ScientificOB100-01
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)Fisher ScientificL3000015store at 4 °C
plasticware/supplies
0.6 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-120
1.5 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-129
10 µL TIP  sterile filter  Pipette TipsFisher Scientific02-707-439
100 µL TIP  sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-431
1000 µL TIP sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-404
2.0 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-138
20 µL TIP  sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-432
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL)Eppendorf2231300008
Disposable Transfer PipetsFisher Scientific13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12Fisher Scientific08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24Fisher Scientific08-772-1
PIPET  sterile filter 10ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10J
PIPET  sterile filter 50ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10Q
PIPET  sterile filter 5ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10H
Powder-Free Nitrile Exam GlovesFisher Scientific19-130-1597B
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)Fisher Scientific22293232
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µmFisher Scientific09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinetThermo Scientific1310
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810Keyence9011800000
Binocular Zoom Stereo MicroscopeVision ScientificVS-1EZ-IFR07
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)VWR25384-088
Dumont #5 Forceps - Biologie/TitaniumFine Science Tools11252-40
Dumont #55 Forceps - Biologie/InoxFine Science Tools11255-20
Dumont #7 curved Forceps - Biologie/TitaniumFine Science Tools11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 REppendorf2231000508
Fine Scissors-sharpFine Science Tools14058-11
McPherson-Vannas Scissors, 8 cmWorld Precision Instruments14124
Metal bead bathLab Armor74309-714
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpmVWR82007-202
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)Living Systems InstrumentationDD-ECON-90-BLK-5PK
Tweezers, economy #5World Precision Instruments501979
Water Jacketed CO2 IncubatorVWR10810-744

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