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Résumé

Les cultures primaires de glie de Müller obtenues à partir de rétines de souris représentent un outil très robuste et fiable pour étudier la conversion gliale en cellules progénitrices rétiniennes après un traitement par microARN. Des molécules uniques ou des combinaisons peuvent être testées avant leur application ultérieure d’approches in vivo .

Résumé

La glie de Müller (MG) est la glie prédominante dans la rétine neurale et peut fonctionner comme une source régénératrice pour les neurones rétiniens. Chez les vertébrés inférieurs tels que les poissons, la régénération entraînée par MG se produit naturellement; chez les mammifères, cependant, une stimulation avec certains facteurs ou une manipulation génétique / épigénétique est nécessaire. Étant donné que les MG ne représentent que 5% de la population cellulaire rétinienne, il existe un besoin de systèmes modèles permettant l’étude exclusive de cette population cellulaire. L’un de ces systèmes modèles est constitué de cultures MG primaires qui sont reproductibles et peuvent être utilisées pour une variété d’applications, y compris le criblage et l’identification de molécules / facteurs, le test de composés ou de facteurs, la surveillance cellulaire et / ou des tests fonctionnels. Ce modèle est utilisé pour étudier le potentiel de la MG murine à se convertir en neurones rétiniens après supplémentation ou inhibition des microARN (miARN) par transfection de miARN artificiels ou de leurs inhibiteurs. L’utilisation de souris rapporteures spécifiques à MG en combinaison avec le marquage immunofluorescent et le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) a confirmé que 80% à 90% des cellules trouvées dans ces cultures sont MG. En utilisant ce modèle, il a été découvert que les miARN peuvent reprogrammer MG en cellules progénitrices rétiniennes (RPC), qui se différencient ensuite en cellules neuronales. Les avantages de cette technique sont que les candidats miARN peuvent être testés pour leur efficacité et leurs résultats avant leur utilisation dans des applications in vivo .

Introduction

La glie de Müller (MG) est la glie prédominante dans la rétine neurale. Ils ont des fonctions similaires à celles d’autres glies dans d’autres parties du système nerveux central, telles que le maintien de l’homéostasie de l’eau et des ions, la nutrition des neurones et la protection des tissus. Les MG ont une autre caractéristique fascinante : bien qu’ils soient des glie matures, ils expriment encore de nombreux gènes exprimés dans les cellules progénitrices rétiniennes (RPC) à la fin du développement 1,2. Cette ressemblance est supposée être la raison de la régénération neuronale naturelle à base de MG dans la rétine du poisson après une lésion rétinienne 3,4. Au cours de ce processus, MG rentre dans le cycle cellulaire et se différencie en RPC qui se différencient ensuite en six types de neurones rétiniens. Bien que ce phénomène se produise naturellement chez les poissons, les MG de mammifères ne se convertissent pas en neurones 5,6. Ils peuvent toutefois être reprogrammés. Il a été démontré qu’une variété de facteurs reprogramment mg en RPC / neurones; parmi ces facteurs figure le facteur de transcription de base hélice-boucle-hélice (bHLH) homologue achaete-scute 1 (Ascl1) qui est impliqué dans la régénération des poissons 7,8. Chez la souris, Ascl1 n’est exprimé que dans les RPC pendant la rétinogenèse mais est absent dans les neurones MG matures ou rétiniens9.

La reprogrammation des cellules directement in vivo est non seulement difficile sur le plan méthodologique, mais nécessite également l’approbation d’un comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux. Pour recevoir l’approbation, des données préliminaires sur le ou les facteurs utilisés ou modifiés, les concentrations, les effets hors cible, les mécanismes sous-jacents, la toxicité et l’efficacité sont requises. Les systèmes de culture cellulaire permettent de tester ces critères avant utilisation dans des modèles in vivo. De plus, comme les MG ne représentent qu’environ 5% de l’ensemble de la population de cellules rétiniennes10, les cultures MG permettent d’étudier leur fonction11 ainsi que leur comportement, y compris la migration 12,13, la prolifération14, la réaction au stress aux blessures / dommages15,16, leur interaction avec d’autres types de cellules telles que la microglie17 ou les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR)18, ou leur potentiel neurogène 19,20,21. De nombreux chercheurs utilisent des lignées cellulaires immortalisées pour leurs études car elles ont un potentiel prolifératif illimité et peuvent être facilement maintenues et transfectées. Les cellules primaires, cependant, sont préférables pour les essais biologiquement pertinents que les cellules immortalisées car elles ont de vraies caractéristiques cellulaires (expression des gènes et des protéines) et, plus important encore, elles représentent un certain stade de développement et ont donc un « âge ». L’âge d’un animal (et par conséquent des cellules obtenues à partir d’un animal) est un facteur particulièrement crucial dans la reprogrammation cellulaire puisque la plasticité cellulaire diminue avec le stade de développement avancé22.

Ce protocole décrit en détail comment reprogrammer la MG primaire avec des miARN comme méthode in vitro actuelle pour étudier la régénération. Ce modèle de culture primaire MG a été établi en 2012 pour évaluer les caractéristiques de prolifération cellulaire de MG chez les souris knock-out P53 (souris trp53-/-)23. Il a été démontré que les MG cultivés conservent leurs caractéristiques gliales (c’est-à-dire l’expression des protéines S100β, Pax6 et Sox2 évaluées par marquage immunofluorescent), et qu’ils ressemblent à des MG in vivo (microréseau de MG purifié par FACS)23. Peu de temps après, l’expression de l’ARNm glial et des protéines a été validée et confirmée dans une approche différente utilisant des vecteurs viraux20. Quelques années plus tard, il a été confirmé que la grande majorité des cellules trouvées dans ces cultures sont MG en utilisant la souris rapporteur Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl spécifique à MG 24. De plus, la quantification de l’ensemble des miARN dans le MG purifié par FACS et le MG primaire cultivé a montré que les niveaux de mg miARN (mGLiomiRs) ne varient pas beaucoup dans le MG cultivé pendant la phase de croissance. Les périodes de culture allongées, cependant, provoquent des changements dans les niveaux de miARN et, par conséquent, dans les niveaux d’ARNm et l’expression des protéines, car les miARN sont des régulateurs translationnels25.

En 2013, ce modèle de culture MG a été utilisé pour tester une variété de facteurs de transcription en ce qui concerne leur capacité à reprogrammer MG dans les neurones rétiniens20. Ascl1 s’est avéré être un facteur de reprogrammation très robuste et fiable. La surexpression d’Ascl1 via des vecteurs viraux a induit des changements morphologiques, l’expression de marqueurs neuronaux et l’acquisition de propriétés électrophysiologiques neuronales. Plus important encore, les connaissances et les résultats obtenus à partir de ces premières expériences in vitro ont été transférés avec succès à des applications in vivo 22,26, démontrant que les cultures MG primaires représentent un outil solide et fiable pour les criblages factoriels initiaux et l’évaluation des caractéristiques gliales avant la mise en œuvre in vivo.

Il y a quelques années, il a été démontré que le miARN miR-124 enrichi par le cerveau, qui est également fortement exprimé dans les neurones rétiniens, peut induire l’expression d’Ascl1 dans MG21 cultivé. L’expression d’Ascl1 dans les cellules vivantes a été visualisée via une souris rapporteure Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Une souris rapporteure est une souris génétiquement modifiée qui a un gène rapporteur inséré dans son ADN. Ce gène rapporteur code pour une protéine rapporteure, qui est dans cette étude tdTomato, une protéine fluorescente rouge. Cette protéine rapporteure rapporte l’expression d’un gène d’intérêt, en l’occurrence Ascl1. En d’autres termes, les cellules qui expriment Ascl1 deviendront rouges. Étant donné qu’Ascl1 n’est exprimé que dans les RPC9, cette souris Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl permet de suivre la conversion DE MG en RPC exprimant Ascl1 , ce qui signifie que la conversion des cellules exprimera la protéine rapporteure tdTomato fluorescente rouge. Il s’agit d’un marquage irréversible puisque l’ADN de ces cellules est altéré. Par conséquent, toute différenciation neuronale ultérieure sera visualisée car l’étiquette tdTomato reste dans les cellules différenciantes. Si Ascl1 exprimant des RPC dérivés de MG (avec étiquette tdTomato) se différencient en neurones, ces neurones auront toujours leur étiquette rouge. Cette souris permet donc non seulement l’étiquetage des RPC dérivés de MG pour l’imagerie de cellules vivantes, mais permet également la cartographie du destin et le traçage de la lignée de ces RPC dérivés de MG (rouges). Plus récemment, l’ensemble des miARN dans les RPC a été identifié et des cultures MG de souris Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter ont été utilisées pour dépister et tester l’effet de ces miARN sur la capacité et l’efficacité de reprogrammation27. Un candidat, le RPC-miRNA miR-25, s’est avéré capable de reprogrammer la MG cultivée dans des cellules exprimant Ascl1 (Ascl1-Tomato+). Ces cellules reprogrammées adoptent des caractéristiques neuronales au fil du temps, y compris la morphologie neuronale (petits somata et processus fins courts ou longs), l’expression des transcriptions neuronales mesurées via scRNA-Seq, ainsi que l’expression de protéines neuronales validées par marquage immunofluorescent27.

Ici, le protocole détaille comment cultiver et transfecter MG à partir de souris P12 adaptées des travauxprécédents 21,24,27. Choisi pour ce protocole est le miARN miR-25 susmentionné, un miARN fortement exprimé dans les RPC, avec de faibles niveaux d’expression dans les neurones MG ou rétiniens. Afin de surexprimer miR-25, des mimiques murines miR-25, c’est-à-dire des molécules artificielles de miARN sont utilisées. Comme contrôle, on choisit des imitations d’un miARN de Caenorhabditis elegans, qui n’ont aucune fonction dans les cellules de mammifères. La visualisation de la conversion de MG en RPC a été réalisée via la souris rapporteur RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), une souris avec un fond mixte (souches C57BL/6, S129 et ICR). Cette culture peut toutefois être réalisée avec toutes les souches de souris, y compris les souches de type sauvage. Au cours des dernières années, le protocole original a été modifié pour réduire la durée de la phase de croissance et la période de culture globale et assurer un statut de cellule gliale plus robuste et minimiser le degré de dégénérescence cellulaire, qui se produit pendant les périodes de culture prolongées. La fenêtre de temps de transfection régulière a également été prolongée de 3 h à 2 jours. Comme mentionné précédemment, bien que le protocole actuel décrive les cultures MG comme un outil pour les études de régénération, la méthode est non seulement utile pour tester les facteurs de reprogrammation, mais peut également être adaptée à d’autres applications, y compris des études sur le comportement migratoire ou prolifératif MG, les paradigmes liés aux blessures / dommages cellulaires, et / ou l’identification des mécanismes et des voies sous-jacents.

Protocole

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du SUNY College of Optometry.

REMARQUE: Ce protocole de culture se compose de trois phases: la croissance, la transfection et la phase de conversion. Un résumé du protocole global avec la chronologie est donné à la figure 1.

1. Préparation des milieux et de tous les réactifs requis

REMARQUE: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une armoire de biosécurité (BSC) A2 ou B2. Pendant la phase de croissance, un milieu de croissance sérique élevé est utilisé qui consiste en un milieu neuronal basal complété par un facteur de croissance épidermique (EGF). Pour la phase de conversion, un milieu basal neurophysiologique à faible sérum complété par des suppléments neuronaux est utilisé pour assurer la différenciation neuronale et la survie.

  1. Préparer le milieu de croissance (utilisé pendant la phase de croissance) en complétant 200 mL de milieu neuronal basal avec 20 mL de sérum bovin fœtal (FBS, 10%), 1 mL de 200 mM de L-glutamine (0,5%), 2 mL de pénicilline/streptomycine (1%) et 2 mL de supplément de N2 (1%). Effectuer une filtration stérile (unités de filtration avec une taille de pore de 0,22 μm). Préchauffer le milieu dans un bain de billes métalliques à 37 °C avant utilisation.
  2. Préparer le milieu neuronal (utilisé pendant la phase de conversion) en suivant les instructions du fabricant (voir tableau des matériaux) en complétant 100 mL de milieu basal neurophysiologique sans sérum par 2 mL de supplément neuronal B27 (2 %), 1 mL de supplément de N2 (1 %), 20 μL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau de 100 ng/mL (BDNF, reconstitué dans 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, concentration finale 20 ng/mL), 20 μL de 100 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales (GDNF, reconstitué dans une solution saline équilibrée stérile de Hanks [HBSS], concentration finale 20 ng/mL), 500 μL de 100 mg/mL de Dibutyryl-cAMP (reconstitué dans le DMSO), 70 μL d’acide ascorbique de 50 ng/mL (reconstitué dans le PBS stérile) et 1,5 mL de pénicilline/streptomycine. Effectuer une filtration stérile (unités de filtration avec une taille de pore de 0,22 μm). Milieu préchauffant dans un bain de billes métalliques à 37 °C avant utilisation.
    REMARQUE: Ces supports peuvent être conservés à 4 °C, pendant 1 mois.
  3. Reconstituer la papaïne, la DNase I et les réactifs ovomucoïdes nécessaires à la dissociation rétinienne selon le protocole du fabricant. Aliquote 750 μL de papaïne dans des tubes stériles de 1,5 mL, 75 μL de DNase I dans des tubes stériles de 0,6 mL et 750 μL d’inhibiteur de la protéase ovomucoïde dans des tubes de 2 mL. Congeler les aliquotes de papaïne et de DNase I à -20 °C et conserver les aliquotes ovomucoïdes à 4 °C pour éviter la dégradation des réactifs. Décongeler à température ambiante juste avant utilisation.
    REMARQUE: La papaïne, la DNase I et l’ovomucoïde se trouvent dans un kit appelé Système de dissociation de la papaïne (voir tableau des matériaux).
  4. Reconstituer la poly-L-ornithine (Poly-O) et la laminine pour le revêtement de couverture si le marquage immunofluorescent est effectué en suivant les instructions de la fiche technique (Poly-O: 0,1 mg/mL dans de l’eau stérile; Laminine : diluer 1,2 mg/mL à 1:50 dans le DMEM). Aliquote Poly-O et Laminine (2,5 mL) et congeler les aliquotes à -20 °C. Décongeler à température ambiante juste avant utilisation.
    REMARQUE: Étape 1.4. n’est nécessaire que si un marquage immunofluorescent et une microscopie à balayage laser sont effectués.

2. Extraction de souris et de tissus

REMARQUE: Pour ces études de reprogrammation, la souris Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl a été créée en croisant une souris Ascl1CreERT (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) avec une souris tdTomatoSTOPfl/fl (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914). Cette souris a un fond mixte (souche C57BL/6, S129 et ICR). Le génotype de cette souris est illustré à la figure 1A. Toutes les souches peuvent être utilisées pour ce protocole.

  1. Portez des gants et désinfectez l’espace de travail, y compris le microscope à dissection et tous les outils fins (pinces courbes Dumont #5 et Dumont #7, ciseaux fins et ciseaux Vannas) avec 70% d’éthanol. Désinfectez un plat de dissection noir enduit de silicone de 10 cm en l’exposant à la lumière UV pendant 20 min.
  2. Préparation de plats et d’assiettes pour l’extraction des tissus
    1. Préparer une plaque de 24 puits pour la collecte des yeux et la séparation des échantillons (deux yeux par souris dans un puits, étiquetés avec des ID de souris) avec ~ 1 mL de HBSS froid (4 °C) par puits. Placez la plaque de 24 puits sur de la glace.
    2. Remplissez une boîte de Petri stérile de 10 cm (pour le lavage) et la boîte de dissection désinfectée recouverte de silicone avec plusieurs mL de HBSS froid (4 °C) pour vous assurer que le tissu est entièrement recouvert de HBSS.
    3. Préparer un tube stérile de 1,5 mL avec 1 mL d’éthanol à 70 %.
    4. Préparez une plaque de culture de 12 puits en étiquetant la plaque avec le numéro de culture, la date, la souche et toutes les informations requises.
  3. Euthanasier les souris P12 en utilisant n’importe quelle méthode approuvée.
  4. Enlèvement des yeux
    1. Tenez doucement la tête de la souris avec le pouce et l’index autour de l’œil.
    2. À l’aide de pinces incurvées Dumont #7, allez doucement derrière le globe oculaire et coupez le nerf optique. Retirez soigneusement l’œil.
      REMARQUE: Si des souris adultes sont utilisées, n’utilisez pas de pince incurvée et ne tirez pas l’œil. Au lieu de cela, coupez soigneusement autour du globe oculaire à l’aide de ciseaux fins; couper le nerf optique mais ne pas couper l’œil lui-même. Utilisez une pince pour retirer soigneusement le globe oculaire.
  5. Nettoyage des globes oculaires
    1. Trempez brièvement le globe oculaire dans un tube contenant de l’éthanol pour éviter le transfert de bactéries de l’animal.
    2. Lavez brièvement le globe oculaire dans la boîte de Petri de 10 cm avant de le placer dans la plaque de 24 puits sur de la glace.
  6. Répétez les étapes 2.4 et 2.5 pour les autres yeux. Gardez la plaque de puits sur la glace pendant le processus. Placez deux yeux d’un animal dans la boîte de dissection placée sous un microscope à dissection avec une source de lumière.
  7. Extraction de la rétine
    1. Fixez un globe oculaire en saisissant le nerf optique et le tissu conjonctif environnant autour de la sclérotique avec une pince fine Dumont #5 et appuyez-le soigneusement contre la boîte de dissection (cornée vers le haut).
    2. Faites un trou au centre de la cornée à l’aide d’une aiguille de 30 G pour permettre un accès plus facile aux ciseaux Vannas.
    3. Disséquez la cornée autour du corps ciliaire à l’aide de ciseaux Vannas et retirez soigneusement la cornée, le cristallin, l’iris et le corps vitré avec une pince fine Dumont #5. La figure 2A illustre une coupe oculaire avec la rétine à l’intérieur.
    4. Disséquez la sclérotique avec des ciseaux Vannas jusqu’à ce que le nerf optique soit atteint. Coupez le nerf optique et extrayez soigneusement la rétine à l’aide de pinces fines Dumont #5.
    5. Utilisez une deuxième paire de pinces fines Dumont #5 pour pousser contre la rétine et permettre l’ablation complète du corps vitré. La figure 2B illustre deux rétines extraites.
  8. Transfert et lavage
    1. Couper environ 2,5 cm de l’extrémité d’une pipette de transfert stérile pour agrandir le diamètre. À l’aide de cette pointe, ramassez (aspirez) des rétines entières sans endommager les tissus.
    2. Transférer les rétines dans une nouvelle boîte de Petri stérile avec du HBSS froid (4 °C) et bercer la boîte (d’avant en arrière, à gauche et à droite).
    3. À l’aide de la pointe de la pipette de transfert, poussez soigneusement les rétines pour laver les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR).
      REMARQUE: Alternativement, toute la rétine avec le cristallin et le corps vitré peut être retirée de la coupe oculaire. Ensuite, le cristallin et le corps vitré peuvent être retirés de la rétine extraite. Si la rétine est déchirée, assurez-vous de ramasser tous les morceaux pour la dissociation; sinon, il n’y aura pas suffisamment de tissus pour développer des couches cellulaires confluentes.
  9. Placez immédiatement la rétine isolée dans un nouveau puits propre de la plaque de 24 puits remplie de 1 mL de HBSS. Gardez la plaque de 24 puits sur la glace pendant le processus de dissection.
  10. Répétez les étapes 2.7-2.9 pour isoler la deuxième rétine.

3. Dissociation de la rétine

REMARQUE: Toutes les étapes suivantes (jusqu’à la récolte des cellules) doivent être effectuées dans une armoire de biosécurité (BSC) A2 ou B2.

  1. Préparer le mélange de dissociation Papaïne/DNase I comme suit.
    1. Pour six rétines, ajouter 75 μL de DNase I dans le tube contenant 750 μL de papaïne (à partir de l’étape 1.3) et mélanger soigneusement (mélange de dissociation).
    2. Pour la préparation individuelle de l’échantillon requise pour ce protocole, diviser le volume total de 825 μL en trois aliquotes : 275 μL du mélange dans un tube de 1,5 mL par souris (deux rétines). Calculez les quantités requises de DNase I et de Papaïne en conséquence.
      REMARQUE: Jusqu’à six rétines peuvent être dissociées dans un tube de mélange papaïne / DNase I. Cependant, la préparation individuelle des échantillons entraîne moins d’amas et une meilleure croissance cellulaire que dans les échantillons combinés.
  2. Transférer deux rétines dans le mélange de dissociation Papaïne/DNase I. Utilisez une pipette de transfert avec un diamètre de pointe élargi (étape 2.8.1), ramassez les rétines, attendez que les rétines se déposent au bas de la pointe, puis relâchez les rétines sans HBSS excessif dans le tube contenant le mélange Papaïne/DNase I.
  3. Placer sur un nutator et l’incuber pendant 10 min dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5% de CO2).
  4. Dissocier les cellules en pipetant soigneusement de haut en bas (environ 20-30 fois) avec une pipette de 1 mL. Une fois les cellules dissociées (c.-à-d. résultant en une solution homogène sans morceaux), ajoutez 275 μL d’inhibiteur de la protéase ovomucoïde du kit de dissociation de la papaïne pour neutraliser la papaïne. Mélanger doucement en pipetant de haut en bas.
    REMARQUE: Si six rétines ont été dissociées dans 825 μL de mélange papaïne/DNase I, 825 μL d’ovomucoïde sont nécessaires.
  5. Centrifuger le mélange à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
  6. Ajouter le facteur de croissance épidermique (EGF, 1 μL pour 1 mL du milieu de croissance, reconstitué à 200 μg/mL dans le PBS) au volume calculé du milieu de croissance (1 mL par souris) préchauffé à 37 °C.
    REMARQUE: Selon la conception expérimentale, le marqueur de prolifération 5-éthyynyl-2'-désoxyuridine (EdU), ainsi que le 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) ou d’autres facteurs requis peuvent être ajoutés au début de la période de culture.
  7. Retirez soigneusement les tubes de la centrifugeuse. Ne touchez pas la pastille au fond du tube.
  8. Retirez le surnageant soigneusement et entièrement. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec 500 μL de milieu de croissance supplémenté en EGF.
  9. Transférer la suspension de la cellule dans un puits de la plaque étiquetée à 12 puits (Figure 2C). Rincez le tube avec 500 μL supplémentaires du milieu de croissance supplémenté en EGF et ajoutez-le au puits (volume total de 1 mL par puits).
  10. Répétez les étapes 3.8 et 3.9 avec tous les autres échantillons.
  11. Bercez la plaque du puits trois fois avec précaution (d’avant en arrière; à gauche et à droite). Placer la plaque dans l’incubateur (37 °C, CO2).
    REMARQUE: Si des souris transgéniques sont utilisées, effectuez un génotypage pour chaque animal (Figure 2D). Identifiez les souris positives et négatives à la Cre recombinase et étiquetez la plaque en conséquence. Pour ce protocole, seules des cellules de souris rapporteures positives à la Cre recombinase ont été utilisées pour les étapes suivantes. Les cellules des spécimens de Cre négatif sont congelées et utilisées pour d’autres applications.

4. Phase de croissance

REMARQUE: La phase de croissance a une durée d’environ 4-5 jours (Figure 1B). Pour ajouter des liquides aux puits contenant des cellules, la pipette doit pointer vers la paroi du puits et le liquide doit être libéré lentement pour éviter le détachement cellulaire. Ne pas pipeter directement sur les cellules.

  1. Un jour après la dissociation, retirez le milieu et ajoutez 1 mL de milieu de croissance frais supplémenté en EGF.
  2. Le jour 3, retirez le milieu et ajoutez 1 mL de HBSS (température ambiante) pour éliminer les débris cellulaires. Basculez doucement d’avant en arrière de gauche à droite. Retirez le HBSS, répétez l’étape de lavage et ajoutez 1 mL de milieu de croissance préchauffé supplémenté en EGF.
  3. Surveillez les cellules tous les jours et évaluez leur état de croissance jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 90% à 100%. La figure 3 montre un exemple de bonne croissance de MG au fil du temps. Vérifiez s’il y a une éventuelle contamination ou la mort cellulaire (figure supplémentaire 1). Jeter les cultures contaminées.
    REMARQUE: Pour surveiller et enregistrer l’état de la cellule, prenez des images à différents grossissements à l’aide d’un microscope optique avec une caméra attachée et des objectifs 4x, 10x ou 20x. Dans cette étude, un microscope à fluorescence est utilisé.

5. Préparation des couvertures avec de la poly-L-ornithine (Poly-O) et une couche de laminine

REMARQUE: Cette étape n’est nécessaire que si le marquage immunofluorescent et la microscopie confocale à balayage laser sont effectués. Des couvercles ronds en verre (12 mm de diamètre) sont nécessaires pour une imagerie correcte. Le protocole de revêtement se trouve également dans la fiche technique du milieu neuronal (voir Tableau des matériaux).

  1. Placez soigneusement les couvercles stériles au centre de chaque puits d’une plaque de 24 puits à l’aide de pinces à #2AP Dumont stériles.
    REMARQUE: Placez des couvertures au centre du puits. Placer des couvercles près de la paroi d’un puits entraînera des problèmes de tension superficielle pour les étapes suivantes.
  2. Décongeler une aliquote Poly-O de 2,5 mL à température ambiante et en placer 100 μL au centre de chaque couvercle.
  3. Incuber la plaque du puits pendant 30 min dans un incubateur à 37 °C.
  4. Retirez le Poly-O et lavez le puits avec le couvercle trois fois avec ~ 1 mL d’eau stérile.
  5. Laissez sécher la plaque de puits pendant la nuit dans le BSC. Décongeler 2,5 mL de laminine à 4 °C pendant la nuit.
  6. Le lendemain matin, ajouter 100 μL de Laminine au centre de chaque couvercle et incuber pendant 4 h dans un incubateur à 37 °C.
  7. Retirez la laminine soigneusement et entièrement.
  8. Maintenir la plaque à 4 °C si le passage ne peut pas être effectué immédiatement.
    REMARQUE: Les couvercles enduits dans des plaques préparées peuvent être conservés pendant quelques jours à 4 ° C.

6. Passage cellulaire pour éliminer les survivants neuronaux

REMARQUE: Le passage cellulaire est nécessaire pour éliminer les cellules neuronales, pas pour augmenter la population cellulaire. Glia ne se divise que quelques fois et ne grandira pas plus après le passage. Ne pas diluer les suspensions cellulaires. Les cellules d’un puits confluent d’une plaque de 12 puits peuvent être réparties sur un puits d’une plaque de 12 puits ou sur deux puits d’une plaque de 24 puits. Lorsque des couvercles enduits sont utilisés, seulement environ un tiers du couvercle est revêtu. Par conséquent, six couvercles assis dans une plaque de 24 puits, avec des cellules confluentes (~ 80% -90%) peuvent être obtenus à partir d’un puits de cellules confluentes d’une plaque de 12 puits. D’autres rapports peuvent également être choisis pour augmenter ou diminuer la densité cellulaire. Pour ce protocole, une souris rapporteur Cre+ est utilisée [une expérience, deux traitements : miR-25 ou control-miR ; réplique technique n = 3 (trois couvercles par traitement), réplication biologique n = 1]. Le nombre de répliques techniques et biologiques peut être défini différemment selon la conception expérimentale.

  1. Vérifiez si les cellules sont confluentes à 90% à 100% (également à la marge du puits; Figure 3E,F).
  2. Retirer le milieu et ajouter 1 mL de HBSS (température ambiante) pour laver. Bercez doucement la plaque (d’avant en arrière, à gauche et à droite). Retirez complètement HBSS.
  3. Ajouter 500 μL d’une solution préchauffée contenant de la trypsine (préchauffée à 37 °C dans un bain de billes métalliques) pour détacher les cellules du puits. Basculez doucement (d’avant en arrière, de gauche à droite) et incubez pendant 2 min dans un incubateur à 37 °C.
  4. Déplacez la plaque de l’incubateur vers BSC. Pendant l’inclinaison, aspirez la solution contenant de la trypsine et dispersez-la soigneusement et lentement sur le puits plusieurs fois jusqu’à ce que les cellules se détachent complètement. Tenez la plaque contre la lumière et assurez-vous qu’aucune cellule n’est laissée en bas.
  5. Transférer cette suspension cellulaire dans un tube stérile de 1,5 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 8 min à 4 °C.
  6. Retirez le surnageant et remettez soigneusement en suspension la pastille cellulaire en ajoutant 600 μL (100 μL par puits pour 6 puits/couvercles) de milieu de croissance préchauffé (complété par de l’EGF; 1:1000). et pipeter de haut en bas ~ 30-40 fois.
    REMARQUE: Les cellules peuvent être congelées à ce moment à -80 ° C ou dans de l’azote liquide et décongelées selon les protocoles standard pour la décongélation des lignées cellulaires. Si les cellules sont congelées, elles ne seront pas remises en suspension dans un milieu supplémenté en EGF (milieu de croissance). Ils seront remis en suspension en milieu de base (sans EGF) et en solution de congélation (rapport 1/1). Les étapes 6.1.1 à 6.6.2 décrivent les étapes de congélation des cellules. Si aucune cellule n’est gelée, passez à l’étape 6.7.
    1. Préparer la solution de congélation en mélangeant 100 μL de DMSO et 400 μL de FBS (volume total de 500 μL par puits/échantillon).
    2. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL de milieu de croissance préchauffé. Ajouter la suspension cellulaire à 500 μL de solution de congélation DMSO/FBS (volume total de 1 mL). Conservez les tubes sur la glace jusqu’à ce que tous les échantillons soient traités. Congeler les cellules à -20 °C pendant 1 h, puis les conserver à -80 °C.
  7. Ensemencer des cellules en plaçant 100 μL de la suspension cellulaire/média de 600 μL (étape 6.6) au centre de six couvercles enduits (voir étape 5) de la plaque de 24 puits. Placez soigneusement la plaque dans l’incubateur et laissez les cellules se déposer.
    REMARQUE: 100 μL de la suspension cellulaire de 600 μL (récoltée dans un puits d’une plaque de 12 puits) entraînera une confluence cellulaire de 90% à 100%, ce qui est nécessaire pour la transfection.
  8. Vérifiez les cellules après 3 h pour voir si elles se sont installées sur le couvercle. Ajouter 400 μL de milieu de croissance complété par du FEM.
    REMARQUE : Les cellules sont généralement prêtes à être transfectionnées le lendemain (Figure 3G). S’ils ne sont pas confluents (90%-100%), laissez-les pour un autre jour. S’ils ne sont toujours pas confluents, ne les utilisez pas pour la transfection. Si d’autres applications en aval sont menées, telles que le profilage des miARN, l’ARN-Seq, la RT-qPCR ou le transfert western, les cellules doivent être acheminées dans des plaques à 12 puits (rapport 1:1; aucun traitement de plaque requis) et récoltées pour l’extraction de l’ARN / protéine.

7. Transfection

REMARQUE: La phase de transfection se compose d’une phase de 3 h dans le milieu de transfection uniquement (les procédures de transfection sont décrites dans le manuel de transfection fourni avec le réactif de transfection) et d’une phase allongée dans laquelle le réactif de transfection et les miARN sont toujours présents, mais un milieu neuronal avec les suppléments requis est ajouté (la durée totale est de 2 jours; Figure 1B). Dans ce protocole, six puits seront transfectés : trois puits recevront le miARN de reprogrammation miR-25 et trois puits recevront le miARN de contrôle.

  1. Vérifiez si les cellules ont atteint 90% de confluence et enregistrez/imagez les cellules avant la transfection.
  2. Retirer le milieu de croissance et ajouter 500 μL de HBSS (température ambiante) pour laver les cellules.
  3. Retirer HBSS et ajouter 400 μL de milieu sérique réduit utilisé pour les transfections. Replacez la plaque dans un incubateur à 37 °C.
  4. Préparez le mélange de transfection en suivant les instructions du protocole de réactif de transfection du fabricant. Faire deux mélanges : mélange de réactif de transfection et mélange de miARN (voir la figure 1B pour l’illustration).
    1. Préparer le mélange de réactif de transfection : Pour une plaque de 24 puits, 49 μL de milieu sérique réduit et 1 μL de réactif de transfection sont nécessaires pour un puits (50 μL au total). Pour six puits, 294 μL de milieu sérique réduit et 6 μL de réactif de transfection sont combinés et bien mélangés en pipetant doucement de haut en bas.
    2. Préparer un mélange mimique de miARN : Pour une plaque de 24 puits, un volume total de 50 μL du mélange mimétique est nécessaire pour un puits. Trois puits recevront le miARN témoin et les trois autres puits seront traités avec du miR-25. Pour ce protocole, une concentration finale de 200 nM est utilisée.
      1. Pour le traitement miR-25 (trois puits), 150 μL de milieu sérique réduit et 3 μL d’imitations miR-25 (solution mère de 100 μM) sont combinés et bien mélangés en piquant doucement de haut en bas. Incuber pendant 5 min.
        Pour le traitement des mimiques de contrôle (trois puits), 150 μL de milieu sérique réduit et 3 μL d’imitations de miARN de contrôle (solution mère de 100 μM) sont combinés et bien mélangés en pipetant doucement de haut en bas. Incuber pendant 5 min.
        REMARQUE: Le volume d’imitations de miARN dépend du facteur de dilution et de la concentration nécessaires (20-500 nM). Les inhibiteurs de miARN (antagomiRs), ou d’autres molécules, y compris les plasmides, peuvent également être utilisés. En outre, des combinaisons de molécules peuvent être transfectées.
  5. Combinez le mélange d’imitation de miARN et le mélange de réactif de transfection. Mélanger soigneusement en pipetant lentement et soigneusement en pipetant doucement de haut en bas. Incuber pendant 20 min à température ambiante (selon les instructions du fabricant).
  6. Ajouter le mélange de transfection ci-dessus goutte à goutte et lentement sur le dessus des cellules, près de la surface du milieu dans le puits à l’aide d’une pipette de 20 μL. Bercez doucement la plaque (d’avant en arrière, de gauche à droite).
  7. Incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 3 h.
  8. Après 3 h, ajouter un milieu neuronal aux puits (500 μL par puits) complété par du 4-hydroxytamoxifène (stock de 5 mM reconstitué avec 2,58 mL d’éthanol, concentration finale de 250 nM) pour activer la Cre recombinase et la 5-éthyynyl-2'-désoxyuridine (EdU, solution mère de 10 mM reconstituée avec 2 mL de DMSO, concentration finale de 1 μM) pour suivre la prolifération cellulaire.
    ATTENTION : Le 4-hydroxytamoxifène et l’EdU sont connus pour être des cancérogènes, des tératogènes et des mutagènes pour l’homme. Lisez la fiche de données de sécurité avant utilisation et portez des gants, des lunettes et des blouses de laboratoire. Reconstituer les deux réactifs selon les recommandations du fabricant. Ne pas inhaler la substance/le mélange. Fermer hermétiquement après utilisation. Les déchets doivent être éliminés conformément aux réglementations nationales et locales. Lavez-vous les mains et le visage après avoir travaillé avec la substance.
  9. Incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 2 jours (Figure 1B).

8. Conversion cellulaire

REMARQUE: La phase de conversion cellulaire a une durée d’environ 5-6 jours (Figure 1B), mais des périodes plus longues sont possibles.

  1. Vérifiez quotidiennement les cellules pour une induction réussie de l’expression de tdTomato, une mort cellulaire potentielle et / ou une contamination. La densité cellulaire ne change pas (Figure 4). Les premières cellules fluorescentes rouges faibles peuvent être observées 1 jour après le traitement au 4-hydroxytamoxifène. Un microscope fluorescent est nécessaire pour surveiller et imager les cellules.
    REMARQUE: Dans cette étude, un microscope à fluorescence est utilisé pour l’imagerie en direct. Les images sont prises avec des objectifs 4x, 10x ou 20x.
  2. Deux jours après la transfection, retirer le milieu et ajouter 500 μL de milieu neuronal préchauffé complété par du 4-hydroxytamoxifène et de l’EdU dans chaque puits.
  3. Remplacez le milieu par un milieu frais tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules soient récoltées.
  4. Prenez des images en direct pour l’évaluation et l’évaluation du nombre de cellules fluorescentes rouges (exprimant Ascl1) et de leurs changements morphologiques (Figure 4 et Figure 5A-C).

9. Récolte cellulaire : fixation pour marquage immunofluorescent

REMARQUE: Les cellules peuvent être récoltées pour d’autres applications en aval, y compris le vrac ou scRNA-Seq, RT-qPCR ou Western Blot.

  1. Retirer le milieu et ajouter 500 μL de HBSS froid (4 °C) par puits et balancer doucement la plaque (d’avant en arrière, de gauche à droite). Supprimez HBSS.
  2. Fixez les cellules en ajoutant 500 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 2 % et en incubant pendant 20 min à température ambiante.
  3. Effectuer un marquage immunofluorescent selon les protocoles établis.

Résultats

Ce protocole décrit comment cultiver mg à partir de rétines de souris P12 et comment reprogrammer ces cellules avec miR-25 en neurones rétiniens à l’aide de la souris rapporteur Ascl1 CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. Cette méthode a été utilisée dans des travaux antérieurs rapportant en détail d’autres miARN appropriés (mimiques ou inhibiteurs, en tant que molécules uniques ou en combinaison) pour reprogrammer MG en RPC qui adoptent ensuite les caractéristiques des cellules n...

Discussion

Ce protocole décrit comment cultiver la MG à partir de rétines de souris dissociées pour des études de reprogrammation à l’aide de miARN. Comme l’ont montré et confirmé diverses études antérieures, la grande majorité (80% à 90%) des cellules trouvées dans ces cultures sont MG 20,23,24. Cette méthode est une technique très robuste et fiable et les résultats peuvent être facilement reproduits si le protocole e...

Déclarations de divulgation

Un brevet incluant certaines des conclusions de ce rapport a été déposé par l’Université de Washington auprès des inventeurs Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl et Thomas A. Reh. Le brevet s’intitule « Méthodes et compositions pour stimuler la régénération rétinienne.

Remerciements

Les auteurs remercient la Dre Ann Beaton et tous les membres du laboratoire pour leur contribution au manuscrit. Nous remercions tout particulièrement les Drs Tom Reh, Julia Pollak et Russ Taylor d’avoir présenté les cultures primaires MG comme outil de dépistage à S.G.W. lors d’une formation postdoctorale à l’Université de Washington à Seattle. L’étude a été financée par la subvention empire innovation program (EIP) à S.G.W. et des fonds de démarrage de SUNY Optometry à S.G.W., ainsi que par le prix R01EY032532 du National Eye Institute (NEI) à S.G.W.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/JJax laboratories#012882Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/JJax laboratories#007914Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomerSigma-AldrichH7904-5MGreconstituted in ethanol, frozen aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solutionVWR100504-7822% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories711-546-152dilution 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories705-606-147dilution 1:500
Anti-human Otx2 Antibody, R&D SystemsFisher ScientificAF1979dilution 1:500
Anti-rabbit MAP2 antibodySigma-AldrichM9942-200ULdilution 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibodyAntibodies-OnlineABIN334653dilution 1:500
Ascorbic AcidSTEMCELL Technologies72132reconstituted in PBS, frozen aliquots
B-27 SupplementFisher Scientific17-504-044frozen aliquots
Brain Phys Neuronal MediumSTEMCELL Technologies05790used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.1643
231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging KitFisher ScientificC10340reconstitute following manual, 4°C
Dibutyryl-cAMPSTEMCELL Technologies73886reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificMT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher ScientificMT35010CVfrozen aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX SupplementFisher Scientific51-985-034store at 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol redFisher Scientific12-605-028used as solution containing trypsin, store at 4 °C
HBSSFisher Scientific14-025-134store at 4 °C
Laminin mouse protein, naturalFisher Scientific23-017-015

frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.164323
1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA
KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)

L-GlutamineFisher Scientific25-030-081frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negative ControlHorizonCN-001000-01-50reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimicHorizonC-310564-05-0050reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
N-2 SupplementFisher Scientific17-502-048frozen aliquots
Neurobasal MediumFisher Scientific21-103-049used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C
Papain Dissociation SystemWorthington BiochemicalLK003153reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots
Penicillin StreptomycinFisher Scientific15-140-122frozen aliquots
Phosphate-buffered saline (PBS)Fisher Scientific20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromideSigma-AldrichP4538-50MGreconstituted in steriled water, frozen aliquots
Recombinant Human BDNF ProteinR&D Systems248-BDB-050/CFreconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots
Recombinant Mouse EGF ProteinFisher Scientific2028EG200reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Recombinant Rat GDNF ProteinFisher Scientific512GF010reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories712-296-150dilution 1:1,000
Slide Mounting MediumFisher ScientificOB100-01
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)Fisher ScientificL3000015store at 4 °C
plasticware/supplies
0.6 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-120
1.5 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-129
10 µL TIP  sterile filter  Pipette TipsFisher Scientific02-707-439
100 µL TIP  sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-431
1000 µL TIP sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-404
2.0 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-138
20 µL TIP  sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-432
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL)Eppendorf2231300008
Disposable Transfer PipetsFisher Scientific13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12Fisher Scientific08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24Fisher Scientific08-772-1
PIPET  sterile filter 10ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10J
PIPET  sterile filter 50ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10Q
PIPET  sterile filter 5ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10H
Powder-Free Nitrile Exam GlovesFisher Scientific19-130-1597B
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)Fisher Scientific22293232
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µmFisher Scientific09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinetThermo Scientific1310
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810Keyence9011800000
Binocular Zoom Stereo MicroscopeVision ScientificVS-1EZ-IFR07
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)VWR25384-088
Dumont #5 Forceps - Biologie/TitaniumFine Science Tools11252-40
Dumont #55 Forceps - Biologie/InoxFine Science Tools11255-20
Dumont #7 curved Forceps - Biologie/TitaniumFine Science Tools11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 REppendorf2231000508
Fine Scissors-sharpFine Science Tools14058-11
McPherson-Vannas Scissors, 8 cmWorld Precision Instruments14124
Metal bead bathLab Armor74309-714
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpmVWR82007-202
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)Living Systems InstrumentationDD-ECON-90-BLK-5PK
Tweezers, economy #5World Precision Instruments501979
Water Jacketed CO2 IncubatorVWR10810-744

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