激光显微切割，用于与物种无关的单组织应用

摘要

描述了一种使用激光显微切割来分离单个线虫组织以进行RNA测序的方案。该协议不需要物种特异性遗传工具包，允许在单组织样本水平上比较不同物种之间的基因表达谱。

摘要

单细胞方法彻底改变了特定细胞类型转录组的分析。然而，它们通常需要物种特异性遗传“工具包”，例如驱动荧光蛋白组织特异性表达的启动子。此外，破坏组织以分离单个细胞的方案将细胞从其天然环境中移除（例如，来自邻居的信号传导），并可能导致应激反应或与天然基因表达状态的其他差异。在本方案中，激光显微切割（LMD）被优化以分离单个线虫尾尖，用于研究雄性尾尖形态发生期间的基因表达。

LMD允许在不需要细胞破坏或物种特异性工具包的情况下分离动物的一部分，因此适用于任何物种。随后，单细胞RNA-seq文库制备方案（如CEL-Seq2）可以应用于LMD分离的单组织，并使用标准管道进行分析，前提是该物种有一个注释良好的基因组或转录组。这些数据可用于确定转录组在不同物种中形成组织的基础的保守性或差异性。

局限性包括切除感兴趣组织和样本数量的能力。功率分析表明，80%的功率只需要每个条件70个尾尖。需要紧密同步发育才能在同一发育阶段获得这么多的动物。因此，还描述了一种以1小时间隔同步动物的方法。

引言

线虫 - 特别是与秀 丽隐杆线虫模型系统相关的横纹线虫 - 是进化发育生物学（EDB）的一组奇妙的动物，原因有很多^1，2。其优点包括细胞数量少，细胞谱系明确且一致，透明度高，易于培养和饲养。还有许多可用的资源，包括多个物种的高质量基因组和 秀丽隐杆线虫，广泛的分子遗传工具和有关发育，遗传学，解剖学和生理学的知识^{3，4，5，6}。

与许多其他生物体一样，表征单个组织或单个细胞中转录组动力学的能力彻底改变了秀丽隐杆线虫^7，8，^9，10的发育分析。能够比较线虫之间的单细胞转录组同样会使用这些生物体改变EDB。例如，这种比较将深入了解基因调控网络如何为保守的字符（性状），已经分化的字符或独立进化的字符进化。

研究方案

1. 蠕虫病毒同步

注意：下面描述了两种方法来同步 秀丽隐杆线虫 和其他横纹虫物种的发育。

1. 在碱性次氯酸盐（漂白剂）处理后，通过第一幼虫期（L1）停滞同步。
   注意：此方法在前面已详细描述¹⁹。这种方法依赖于秀丽隐杆线虫的两个特征，这些特征也适用于其他几种横纹虫物种：（1）蛋壳对漂白剂具有抗性，而成年和幼虫周围的角质层则不^然。
   1. 用稀释的漂白剂溶液处理妊娠雌雄同体（或雌性），以分解其角质层并释放胚胎。
   2. 从漂白剂中取出胚胎，并保持它们没有食物，直到所有L1孵化。
   3. 将被捕的L1放在食物上，所有L1几乎同时恢复发育。
      注意：退出 L1 逮捕可在一小时内发生。
2. 与“舱口关闭”方法同步（此处使用; 图 1 顶部）：
   注意：舱口关闭方法允许在不中断开发的情况下实现紧密同步（L1停滞甚至会影响后期^阶段21的开发）。该协议改编自Pepper等人²²。该方法的目的是从仅包含胚胎的板中收集在特定时期内孵化的L1。

结果

激光捕获显微切割后，雄性和雌雄同体的个体尾尖在4个时间点（L3孵化后22小时;使用CEL-Seq2方案制备L4 24，26和28 h）用于RNA测序。CEL-Seq2引物包含独特的条形码，能够以生物信息学方式识别来自特定样品（在本例中为单个尾尖）的测序读数。使用这种方法生成了总共557个尾尖的测序数据（266个雌雄同体和291个雄性，分布在4个发育时间点，每个性别和时间点59-78个尾巴）。回收了这些尾尖97%（即543个?.......

讨论

该方法的关键步骤
如果操作正确，此处描述的方法将使用相对较少的激光解剖样品（本例中有70个尾尖）获得稳健的RNA图谱。然而，对于来自发育中的动物的样品，紧密同步对于减少样品之间的变异性至关重要。因此，该协议建议使用删除出雏方法进行蠕虫病毒同步。在这里，研究人员可以确定并精确控制个体之间的年龄差异（本方案中的1小时）。此外，孵化方法适用于任何物种?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 µM PEN membrane glass slides RNase free	Leica	11600288	for LMD
500 µL PCR tubes (nuclease-free)	Axygen	732-0675	to cut the tail tips into
Compound microscope with 40x objective and DIC	any		to check age of worms
Desktop humidifier	any
Dissection microscope with transmitted light base	any		for all worm work
glass pasteur pipets	any		handle of worm pick
glass slides and coverslips	any		to check age of worms
LMD6 microdissection system	Leica	multiple	to cut tail tips
LoBind tubes 0.5 mL	Eppendorf	22431005
M9 Buffer			Recipe in WormBook
Methanol 99.8%	Sigma	322415	to fix worms
NGM growth medium	US Biological	N1000	Buffers and salts need to be added: Recipe in WormBook
P10 pipette variablle volume	e.g. Gilson
P1000 pipette variable volume	e.g. Gilson
P2 pipette variable volume	e.g. Gilson
Pipette tips 1,000 µL	any
Pipette tips 1-10 µL filtered	any
platinum iridium wire	Tritech	PT-9010	to make worm pick
sterile and nuclease-free 1 mL centrfuge tubes	any
Tween 20	Sigma	P9416	Add a very small amount to M9 buffer to prevent worms from sticking to the pipet tips
vented 6 mm plastic Petri dishes	any
For CEL-Seq2
4200 TapeStation System with reagents for high-sensitivity RNA and DNA detection	Aligent		automated electrophoresis system
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63880	DNA cleanup beads
Bead binding buffer  20% PEG8000, 2.5 M NaCl
CEL-Seq2 primers (see Table S1)	Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf	6335000020	Thermal cycler with programmable lid and block for 200 µl tubes.
DNA Polymerase I (E. coli)	Invitrogen	18052-025
dNTP mix 10 mM	any
E. coli DNA ligase	Invitrogen	18052-019
Ethanol
ExoSAP-IT For PCR Product Clean-Up	Affymetrix	78200	exonuclease solution
MEGAscript T7 Transcription Kit	Ambion	AM1334	For step 4.6.1
Nuclease-free water	any
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	NEB	M0531	PCR mix step 4.9.7
random hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN	IDT		a primer with 6 nucleotides that are random
RNA Fragmentation buffer	NEB	E6150S
RNA Fragmentation stop buffer	NEB	E6150S
RNA PCR Index Primers (RPI1–RPI48)	Illumina, NEB, or IDT		RPIX in protocol step 4.9.7, sequences available from Illumina
RNAClean XP beads	Beckman Coulter	A63987
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Scientific	7000TS1	or any other similar product
RNaseH (E. coli)	Invitrogen	18021-071
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Invitrogen	10777-019
Second strand buffer	Invitrogen	10812-014
Superscripit II	Invitrogen	18064-014	reverse transcriptase