Microdisección láser para aplicaciones de un solo tejido independientes de la especie

Resumen

Se describe un protocolo que utiliza la microdisección láser para aislar tejidos de nematodos individuales para la secuenciación de ARN. El protocolo no requiere kits de herramientas genéticas específicas de la especie, lo que permite comparar los perfiles de expresión génica entre diferentes especies a nivel de muestras de un solo tejido.

Resumen

Las metodologías unicelulares han revolucionado el análisis de los transcriptomas de tipos celulares específicos. Sin embargo, a menudo requieren "kits de herramientas" genéticos específicos de la especie, como promotores que impulsan la expresión específica de proteínas fluorescentes en los tejidos. Además, los protocolos que interrumpen los tejidos para aislar células individuales eliminan las células de su entorno nativo (por ejemplo, la señalización de los vecinos) y pueden provocar respuestas al estrés u otras diferencias con los estados de expresión génica nativa. En el presente protocolo, la microdisección láser (LMD) está optimizada para aislar las puntas individuales de la cola de los nematodos para el estudio de la expresión génica durante la morfogénesis de la punta de la cola masculina.

LMD permite el aislamiento de una porción del animal sin la necesidad de interrupción celular o kits de herramientas específicos de la especie y, por lo tanto, es aplicable a cualquier especie. Posteriormente, los protocolos de preparación de la biblioteca de ARN-seq de una sola célula, como CEL-Seq2, se pueden aplicar a tejidos individuales aislados de LMD y analizarse utilizando tuberías estándar, dado que se dispone de un genoma o transcriptoma bien anotado para la especie. Dichos datos se pueden utilizar para establecer qué tan conservados o diferentes son los transcriptomas que subyacen al desarrollo de ese tejido en diferentes especies.

Las limitaciones incluyen la capacidad de cortar el tejido de interés y el tamaño de la muestra. Un análisis de potencia muestra que se requieren tan solo 70 puntas de cola por condición para obtener un 80% de potencia. Se necesita una estrecha sincronización del desarrollo para obtener este número de animales en la misma etapa de desarrollo. Por lo tanto, también se describe un método para sincronizar animales a intervalos de 1 h.

Introducción

Los nematodos, particularmente los nematodos rabdíidos relacionados con el sistema modelo Caenorhabditis elegans, son un maravilloso grupo de animales para la biología evolutiva del desarrollo (EDB) por muchas razones ^1,2. Las ventajas incluyen su pequeño número de células, linajes celulares definidos y consistentes, transparencia y facilidad de cultivo y cría. También hay muchos recursos disponibles, incluidos genomas de alta calidad para múltiples especies, y para C. elegans, amplias herramientas genéticas moleculares y conocimientos sobre desarrollo, genética, anatomía y fisiología 3,4,5,6.

Al igual que con muchos otros organismos, la capacidad de caracterizar la dinámica del transcriptoma en tejidos individuales o células individuales ha revolucionado el análisis del desarrollo en C. elegans 7,8,9,10. Ser capaz de comparar transcriptomas unicelulares entre nematodos transformaría de manera similar EDB utilizando estos organismos. Por ejemplo, tales comparaciones proporcionarían información sobre cómo las redes reguladoras de genes han evolucionado para los caracteres (rasgos) que se han conservado, para los caracteres que han divergido o para los caracteres que evolucionaron de forma independiente.

Sin embargo, aislar tejidos o células particulares de los nematodos es uno de los grandes desafíos. Para muchos organismos, las células individuales pueden disociarse de los tejidos y cosecharse de manera imparcial o pueden etiquetarse con la expresión específica del tejido de una proteína fluorescente y clasificarse mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)¹¹. En C. elegans, el aislamiento de células de alto rendimiento (HTP) se ha limitado principalmente a embriones porque la cutícula externa dura (y el esqueleto hidrostático) ha obstaculizado el aislamiento celular de larvas y adultos. Para sortear este desafío, algunos métodos han empleado herramientas genéticas en gusanos C. elegans completos, como el etiquetado de ARNm específico del tejido¹² y las comparaciones de expresión diferencial entre el tipo salvaje y los mutantes que afectan a un tipo celular¹³. Métodos más recientes han superado el desafío disolviendo la cutícula para aislar núcleos¹⁴ o células enteras ^8,9,15. Sin embargo, el aislamiento celular y el cultivo celular tienen las desventajas obvias de que las células se eliminan de su contexto anatómico o de desarrollo natural, por ejemplo, lejos de la señalización célula-célula y el contacto con la matriz extracelular, que se espera que afecten el perfil de expresión génica¹⁵. Además, las herramientas genéticas y los marcadores específicos de tejidos son específicos de la especie (es decir, solo se pueden usar en C. elegans).

LMD proporciona un método alternativo para aislar tejidos sin interrumpir el contexto natural de las células. Significativamente para EDB, LMD también permite comparar transcriptomas de tejidos homólogos de diferentes especies sin la necesidad de kits de herramientas genéticas específicas de la especie si se dispone de secuencias del genoma o del transcriptoma completo de estas especies. LmD consiste en dirigirse a los tejidos mediante la observación microscópica directa y el uso de una microhaz láser, integrada en la óptica del microscopio, para cortar y cosechar (capturar) el tejido de interés¹⁶. Las limitaciones de LMD son que no es propicio para enfoques muy HTP (aunque los perfiles de transcripción para las puntas de la cola, como se describe en este protocolo, eran robustos con ~ 70 muestras), ciertas muestras pueden ser difíciles de diseccionar, y los cortes se limitan a la precisión del láser y lo que se puede visualizar en el microscopio.

El propósito del presente protocolo es describir cómo lmD, seguido de ARN-Seq de un solo tejido, se puede utilizar para obtener datos de transcriptoma específicos de estadios y tejidos de nematodos. Específicamente, demuestra LMD para aislar las puntas de la cola de larvas de cuarta etapa (L4) de C. elegans. Sin embargo, este método se puede adaptar a otros tejidos y, por supuesto, a diferentes especies.

En C. elegans, hay 4 células que hacen la punta de la cola tanto en machos como en hermafroditas. Durante la etapa L4 en los machos, pero no en los hermafroditas, las células de la punta de la cola cambian su forma y migran hacia arriba y hacia adentro. Este proceso también ocurre en algunas pero no en todas las demás especies de nematodos rabdítidos. Por lo tanto, la punta de la cola es un buen modelo para la evolución de la morfogénesis dimórfica sexual. Debido a su posición, la punta de la cola también es fácil de aislar por LMD.

Para obtener perfiles de transcriptoma a partir de puntas de cola, el presente protocolo utiliza CEL-Seq2, un método de ARN-seq desarrollado para células individuales^17,18. Este método tiene varias ventajas para los tejidos derivados de LMD. CEL-Seq2 es altamente sensible y eficiente, utilizando identificadores moleculares únicos (UMI) para permitir la cuantificación directa de las lecturas de ARNm, la transcripción in vitro para garantizar la amplificación lineal y el código de barras que permite la multiplexación de muestras de tejido individuales. La única limitación de CEL-Seq2 es que las lecturas recuperadas están sesgadas al extremo 3' de los ARNm, y la mayoría de las isoformas no se pueden distinguir.

Protocolo

1. Sincronización de gusanos

NOTA: A continuación se describen dos métodos para sincronizar el desarrollo de C. elegans y otras especies rabdítidas.

1. Sincronizar por primera parada en estadio larvario (L1) después del tratamiento con hipoclorito alcalino (lejía).
   NOTA: Este método fue descrito anteriormente en detalle¹⁹. Este método se basa en dos características de C. elegans que también son ciertas para varias otras especies de rabditides: (1) La cáscara del huevo es resistente a la lejía, mientras que la cutícula que rodea a los gusanos adultos y larvales no lo es. (2) Las larvas de primera etapa detienen el desarrollo cuando se mantienen sin alimento²⁰.
   1. Trate a los hermafroditas grávidos (o hembras) con una solución de lejía diluida para romper su cutícula y liberar embriones.
   2. Retire los embriones de la lejía y manténgalos sin alimentos hasta que todo el L1 haya eclosionado.
   3. Coloque el L1 arrestado en la comida, donde todos reanudan el desarrollo aproximadamente al mismo tiempo.
      NOTA: La salida del arresto L1 puede ocurrir dentro de una hora.
2. Sincronización con el método "hatch-off" (utilizado aquí; Figura 1 arriba):
   NOTA: El método de eclosión permite una sincronización estrecha sin interrupción del desarrollo (la detención L1 afecta el desarrollo incluso de etapas posteriores²¹). El protocolo está adaptado de Pepper et ^al.22. El objetivo de este método es recolectar L1 que han eclosionado durante un período específico de una placa que solo contiene embriones.
   1. Elige madres: En la noche antes de realizar la eclosión, escoja ~ 30 hermafroditas grávidos en una placa sembrada con E. coli OP50.
   2. Incubar a 25 °C para la puesta de huevos durante la noche.
      NOTA: Elija un plato sin grietas o burbujas donde los gusanos puedan atascarse. Evite las placas con un césped bacteriano muy grueso, ya que será difícil eliminar todos los gusanos más adelante. Si trabaja con una cepa sensible a la temperatura, ajuste el tiempo de puesta de huevos para tener en cuenta una embriogénesis más larga. Elija a las madres en la etapa máxima de puesta de huevos.
   3. Retire las madres y las larvas: a la mañana siguiente, bajo el microscopio de disección (aumento de 20x), pipetee suavemente 1-2 ml de tampón M9 contra la pared de la placa sin chorrear; girar la placa para desalojar los gusanos.
   4. Retire y deseche todo el líquido y los gusanos colocando la punta de la pipeta contra la pared de la placa en el borde del agar para evitar agujeros. Verifique que no queden gusanos (y solo huevos / embriones) en el plato, especialmente no L1; de lo contrario, repita el lavado.
   5. Coloque la placa a 25 °C durante 1 h y espere a que eclosionen algunas L1.
   6. Recoja los L1 recién eclosionados: deje caer cuidadosamente el búfer M9 de 1 ml sobre el agar. Girar la placa para desalojar L1 pero no embriones. Pipete suavemente el tampón y los gusanos en un tubo de centrífuga de 1 ml.
   7. Centrifugar el tubo durante 1 min a ~18,000 × g. Retire el sobrenadante.
   8. Pipeta L1 directamente sobre el césped bacteriano de una placa sembrada. Verifique bajo el microscopio de disección que no hay gusanos o embriones adultos presentes.
   9. Mantenga los gusanos a 25 °C hasta que se hayan desarrollado a la etapa deseada.
      NOTA: Si las condiciones son óptimas, se pueden recolectar dos lotes más de L1 de la misma placa. Inspeccione la placa inicial para asegurarse de que no haya L1 presente. Si es necesario, lávese de nuevo. Repita los pasos 1.2.5-1.2.9.
   10. Verifique el momento del desarrollo. Antes de proceder a la aplicación aguas abajo, inspeccione algunos gusanos bajo un microscopio compuesto a un aumento de 400x para confirmar que alcanzaron la etapa de desarrollo deseada, aquí L3.
       NOTA: La distancia de migración de las células de la punta distal o las células enlazadoras se puede utilizar como guía, además del desarrollo de la vulva. Para el desarrollo de la vulva, Mock et ^al.23 proporcionan una guía útil, aunque el tiempo en ese estudio se determinó a 20 °C. A 25 °C, los C. elegans de tipo salvaje se someterán a la muda L3-L4 24 h después de la eclosión.

2. Recolección de machos L4 y hermafroditas y fijación

1. Preparar sin RNAse, frío (-20 °C), 70% de metanol antes de la fijación.
2. Bajo un microscopio de disección a un aumento de 30-50x, comience a recoger machos y hermafroditas de las placas de sincronización en placas separadas sin sembrar tan pronto como se puedan distinguir los sexos (~ 21 h después de la eclosión, Figura 2), y continúe recogiendo durante 1-2 h o hasta que se recolecten 200 animales.
3. Mantenga los gusanos a 25 °C hasta que alcancen la etapa deseada para el experimento.
4. Lave los gusanos de la placa con 1-2 ml de tampón M9 usando una punta de pipeta prelavada con tampón M9 que contenga detergente al 0.01% (para evitar que los gusanos se peguen a la punta).
5. Transfiera los gusanos a un tubo centrífugo de 1 ml.
6. Girar durante 1 min a 21.000 × g para peletizar los gusanos. Retire el sobrenadante.
7. Agregue 1 ml de tampón M9 y mezcle para romper el pellet.
8. Girar durante 1 min a 21.000 × g para peletizar los gusanos. Retire el sobrenadante.
9. Repita el lavado.
10. Añadir 1 ml de metanol helado al 70% y mezclar bien.
11. Girar durante 1 min a 21.000 × g para peletizar los gusanos. Retire el sobrenadante.
12. Repita los pasos 2.10 y 2.11.
13. Agregue 500 μL de metanol al 70%, mezcle y almacene a 4 °C durante 1 h hasta la noche.

3. Microdisección láser

NOTA: De aquí en adelante, use reactivos y consumibles libres de RNasa; use puntas de filtro.

1. Si se utiliza el método CEL-Seq2 para procesar las muestras, prepare una mezcla maestra para cada imprimación CEL-Seq2 (Tabla suplementaria S1): pipeta 2 μL de imprimación CEL-Seq2, 1 μL de 10 mM dNTP y 9 μL de 1% β-Mercaptoetanol (en agua libre de RNasa) en un tubo etiquetado de 200 μL.
2. Montaje en diapositiva
   1. Bajo un microscopio de disección, pipetee 20 μL de los gusanos fijos (20-40 gusanos del paso 2.13) en el lado mate de un portaobjetos de vidrio de membrana de naftalato de polietileno (PEN) (donde está la membrana).
   2. Espere a que el metanol se evapore. Use un calentador deslizante para acelerar la evaporación.
      NOTA: Se pueden aplicar gotas adicionales de metanol y se usa una punta de pipeta para extender los gusanos si comienzan a agruparse a medida que se secan. Cuando los gusanos están en grupos, pueden ser difíciles de diseccionar.
3. Configuración del microscopio
   NOTA: El siguiente protocolo es específico para el instrumento enumerado en la Tabla de Materiales. Debe ajustarse si se utiliza un microscopio LMD diferente.
   1. Coloque un humidificador de escritorio detrás del escenario en el lado del microscopio LMD. Asegúrese de que el vapor sople directamente sobre el escenario.
      NOTA: El humidificador es útil para reducir la electricidad estática, que de lo contrario puede evitar que la pequeña sección de la membrana caiga en la tapa del tubo.
   2. Gire la llave para la potencia del láser.
   3. Encienda el control del escenario.
   4. Encienda la caja de control del microscopio.
   5. Abra el software de microdisección láser.
   6. Retire el escudo de plástico sobre el escenario.
   7. Haga clic en el botón de descarga con la flecha hacia arriba para cargar las diapositivas de membrana.
   8. Asegúrese de que la diapositiva esté completamente seca, voltee para que la membrana esté hacia abajo.
   9. Inserte la diapositiva y haga clic en continuar en la ventana de cambio de muestra .
   10. Reemplace el escudo de plástico.
   11. En la parte inferior de la pantalla, elija qué soporte deslizante contiene la diapositiva.
   12. Para cargar los tubos, haga clic en el botón de descarga con la flecha hacia abajo.
   13. Saque la bandeja y retire el bloque de tubo.
       NOTA: El bloque de tubo utilizado para este experimento es para tubos de PCR de 500 μL.
   14. Inserte las tapas de los tubos de PCR de 500 μL en el soporte y doble el tubo debajo.
   15. Devuelva el bloque a la bandeja y deslice la bandeja de nuevo en la etapa del microscopio.
   16. En la ventana emergente del dispositivo colector de cambios , seleccione Tubos pcr y haga clic en Aceptar.
   17. Haga clic en la ubicación vacía del tubo en la parte inferior izquierda de la pantalla debajo de las tapas del tubo del dispositivo colector.
   18. En el panel de control microscopio , seleccione TL-BF para la iluminación de campo brillante de luz transmitida.
4. Cortante
   NOTA: Este protocolo es específico para el instrumento enumerado en la Tabla de Materiales.
   1. Usando la lente 2.5x, ajuste el enfoque hasta que los gusanos y la estructura de la membrana sean visibles.
   2. Cambie a la lente 20x.
   3. Mueva el escenario a una región sin gusanos. Ajuste el enfoque de tal manera que las estructuras en forma de burbuja en la membrana tengan un color amarillento (Figura 3A, B) para enfocar el láser en el plano focal correcto.
   4. Ajuste los parámetros del láser; para las puntas de la cola, comience con Power 45, apertura 30 y velocidad 20.
   5. En el panel Control láser , seleccione calibrar. Siga las instrucciones.
      NOTA: El instrumento realizará este paso automáticamente. Se asegurará de que una forma dibujada con el mouse en la pantalla sea idéntica a la forma recortada por el láser.
   6. En la parte inferior de la pantalla, en las tapas del tubo del dispositivo colector, haga clic en la posición A.
   7. En el lado derecho de la pantalla, seleccione una sola forma | Dibujar + Cortar. En el lado izquierdo de la pantalla, seleccione PtoP.
   8. Dibuja una línea.
   9. Haga clic en Iniciar corte para que el láser corte a través de la membrana.
      NOTA: También puede grabar una línea en el vidrio.
   10. Si este corte de prueba se ve bien (la membrana está cortada, los bordes del corte se ven lisos), continúe con el siguiente paso. De lo contrario, ajuste el enfoque y corte otra línea.
   11. Encuentra un gusano. Cambie a Mover + Cortar y use el mouse para cortar la cola.
       NOTA: Si el láser no corta la cola, ajuste el enfoque y aumente la potencia del láser. Para tejidos más gruesos, la potencia del láser puede tener que ajustarse a 60.
   12. Guardar los parámetros: ficha Archivo | Guardar la configuración de la aplicación; para su posterior recuperación, Restaurar configuración de la aplicación.
   13. Para recoger la muestra, cambie a la configuración Dibujar + Cortar con la función PtoP y dibuje una forma para completar el corte de una sección de membrana (Figura 3C).
       NOTA: Las secciones de membrana más grandes y las secciones con forma de rectángulos o triángulos en lugar de círculos u óvalos son más fáciles de ubicar en la tapa del tubo colector.
   14. Seleccione el siguiente tubo en Collector Device Tube Cap en la parte inferior de la pantalla y corte la siguiente punta de la cola.
   15. Una vez cortadas cuatro colas, descargue el bastidor del tubo (haga clic en Descargar con la flecha hacia abajo) y busque las secciones de membrana bajo un microscopio de disección (Figura 3D).
       NOTA: Las secciones pueden estar ubicadas en el centro de la tapa del tubo o pegadas al costado de la tapa.
   16. Continúe con la aplicación descendente. Para CEL-Seq2, pipetee 1,2 μL de una mezcla maestra de imprimación CEL-Seq2 (del paso 3.1) directamente encima de la muestra.
   17. Cierre el tubo, etiquete con el número de imprimación e inmediatamente coloque la tapa del tubo directamente sobre un trozo de hielo seco para congelar la muestra y evitar la degradación del ARN.
   18. Cargue más tubos, devuelva el bloque de tubos al escenario y corte más muestras. Agregue una mezcla de imprimación CEL-Seq2 diferente a cada punta de la cola.
   19. Conservar todos los tubos a -70 °C.

4. Secuenciación de ARN de cola única con CEL-Seq2

NOTA: Para obtener detalles completos sobre el protocolo CEL-Seq2, consulte Yanai y Hashimshony¹⁸.

1. Limpie el área del banco de laboratorio con una solución de descontaminación de RNasa para evitar la degradación del ARN.
2. Prepare mezclas maestras y manténgalas en hielo.
   1. Preparar la mezcla maestra de transcripción inversa: 0,4 μL de tampón de primera hebra, 0,1 μL de 0,1 M de TDT, 0,1 μL de inhibidor de la RNasa y 0,1 μL de transcriptasa inversa por muestra.
   2. Preparar la mezcla maestra de reacción de la segunda hebra: 7 μL de agua, 2,31 μL de tampón de segunda hebra, 0,23 μL de dNTP, 0,08 μL de E. coli ligasa, 0,3 μL de E. coli ADN polimerasa, 0,08 μL de RNasaH por muestra.
3. Romper las celdas abiertas y recocir con cebadores (consulte la Tabla suplementaria S1 para obtener la lista completa de cebadores):
   1. Programe el termociclador y su tapa a 65 °C.
   2. Recuperar las muestras a partir de -70 °C e incubarlas en el termociclador durante 2,5 min.
   3. Girar a 21.000 × g durante 30-40 s.
   4. Incubar a 65 °C durante 2,5 min.
   5. Muévelos inmediatamente al hielo.
   6. Girar a 21.000 × g durante 30-40 s y devolverlos al hielo.
4. Conversión de ARN a ADNc:
   1. Agregue 0.8 μL de la mezcla de transcripción inversa a cada punta de la cola.
   2. Incubar a 42 °C durante 1 h.
   3. Inactivar térmicamente a 70 °C durante 10 min.
   4. Muévelo inmediatamente al hielo.
   5. Agregue 10 μL de la segunda mezcla de hebras a cada punta de la cola.
   6. Desplácese por las muestras.
   7. Girar a 21.000 × g durante 30-40 s.
   8. Incubar a 16 °C durante 2 h.
5. Limpieza de ADNc:
   1. Precalentar las cuentas de limpieza de ADN a temperatura ambiente.
   2. Acumule hasta 40 muestras en un tubo centrífugo de 1,5 ml (hasta 480 μL).
   3. Mezcle las perlas hasta que estén bien dispersas y agregue 20 μL de perlas y 100 μL de tampón de unión de perlas por cada 100 μL de la muestra agrupada (para 480 μL de muestra agregue 480 μL de tampón de cuentas y 96 μL de perlas a un volumen final de hasta 1.056 μL). Mezclar bien mediante pipeteo.
   4. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
   5. Coloque en un soporte magnético durante al menos 5 minutos hasta que el líquido parezca claro.
   6. Retire y deseche todos menos 20 μL del sobrenadante.
   7. Añadir 200 μL de etanol 80% recién preparado.
   8. Incubar durante al menos 30 s, retirar el sobrenadante pipeteándolo sin molestar las perlas. Deseche el sobrenadante.
   9. Repita los pasos 4.5.7 y 4.5.8 una vez.
   10. Seque al aire las perlas durante 15 minutos o hasta que estén completamente secas.
   11. Resuspend las perlas (~6.4 μL) con 6.4 μL de agua. Mezclar bien canalizando todo el volumen hacia arriba y hacia abajo diez veces.
   12. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
   13. Vaya directamente a la transcripción in vitro (IVT).
6. Transcripción y fragmentación in vitro :
   1. Al tubo que contiene 6,4 μL de muestra y las perlas, añadir la siguiente mezcla (9,6 μL en total): 1,6 μL de 10x T7 Buffer, 1,6 μL de ATP, 1,6 μL de UTP, 1,6 μL de CTP y 1,6 μL de GTP (cada dNTP a 75 mM concentración) 1,6 μLof T7 enzima.
   2. Incubar durante 13 h a 37 °C con una retención de 4 °C.
   3. Añadir 6 μL de solución de exonucleasa (el volumen final debe ser de 22 μL).
   4. Incubar durante 15 min a 37 °C.
   5. Vuelva a colocar el tubo sobre hielo y agregue 5,5 μL de tampón de fragmentación (0,25 × volumen de reacción).
   6. Incubar durante 3 min a 94 °C.
   7. Mueva inmediatamente el tubo al hielo y agregue 2,75 μL de búfer de parada de fragmentación (0,5 × volumen de búfer de fragmentación añadido).
   8. Retire las perlas colocando el tubo en el soporte magnético durante al menos 5 minutos hasta que el líquido parezca claro.
   9. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
7. Limpieza de ARN amplificado (aRNA):
   1. Precalentar las perlas de limpieza de ARN a temperatura ambiente.
   2. Mezcle las cuentas hasta que estén bien dispersas.
   3. Pipeta 55 μL de perlas (1,8 × volumen de reacción).
   4. Incubarlos a temperatura ambiente durante 10 min.
   5. Coloque el tubo en el soporte magnético durante al menos 5 minutos hasta que el líquido parezca claro.
   6. Retire y deseche 80 μL del sobrenadante.
   7. Añadir 200 μL de etanol 70% recién preparado.
   8. Incubar durante al menos 30 s, retirar el sobrenadante pipeteando sin molestar las perlas. Deseche el sobrenadante.
   9. Repita el lavado con etanol dos veces más.
   10. Seque al aire las perlas durante 15 minutos o hasta que estén completamente secas.
   11. Resuspendir las perlas con 7 μL de agua. Pipetear todo el volumen hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar bien.
   12. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
   13. Coloque el tubo con las perlas en el soporte magnético durante 5 minutos hasta que el líquido parezca claro.
   14. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
       NOTA: Punto de parada: las muestras se pueden mantener a -70 °C.
8. Opcional: Compruebe la cantidad y calidad de aRNA con un sistema de electroforesis automatizado siguiendo el protocolo del fabricante.
9. Preparación de la biblioteca:
   1. A 5 μL de ARN, añadir 1 μL de cebador RT de hexámero aleatorio de 100 μM (véase la Tabla de Materiales) y 0,5 μL de 10 mM dNTP.
   2. Incubar a 65 °C durante 5 min.
   3. Añadir 4 μL de la siguiente mezcla a temperatura ambiente: 2 μL de tampón First Strand, 1 μL de 0,1 M DDT, 0,5 μL de inhibidor de la RNasa, 0,5 μL de transcriptasa inversa.
   4. Incubar a 25 °C durante 10 min.
   5. Incubar a 42 °C durante 1 h (en un horno de hibridación o en un termociclador precalentado con la tapa ajustada a 50 °C).
   6. Incubar a 70 °C durante 10 min.
   7. Transfiera 5 μL a un tubo nuevo (mantenga el resto de la reacción a -20 °C). Agregue 5,5 μL de agua ultrapura, 1 μL de ARN PCR Primer (RP1), 1 μL de RNA PCR Indexado (RPIX) y 12,5 μL de mezcla de PCR.
   8. Utilice el siguiente programa en el termociclador: 30 s a 98 °C, 11 ciclos de: (10 s a 98 °C, 30 s a 60 °C, 30 s a 72 °C), 10 min a 72 °C, mantener a 4 °C.
      NOTA: Punto de parada: las muestras se pueden mantener a -20 °C.
10. Limpieza de bibliotecas:
    1. Precalentar las cuentas de limpieza de ADN a temperatura ambiente.
    2. Mezcle las cuentas hasta que estén bien dispersas.
    3. Añadir 25 μL de las perlas a la reacción de PCR. Mezclar bien mediante pipeteo.
    4. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
    5. Coloque el tubo en el soporte magnético durante al menos 5 minutos hasta que el líquido parezca claro.
    6. Retire y deseche 45 μL del sobrenadante.
    7. Añadir 200 μL de etanol 80% recién preparado.
    8. Incubar durante al menos 30 s, retirar y desechar el sobrenadante sin molestar las perlas.
    9. Repita el lavado con etanol una vez.
    10. Seque las perlas al aire durante 15 minutos o hasta que estén completamente secas.
    11. Resuspenderlos con 25 μL de agua. Mezclar bien mediante pipeteo.
    12. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
    13. Coloque el tubo en el soporte magnético durante 5 minutos hasta que el líquido aparezca claro.
    14. Transfiera 25 μL de sobrenadante a un tubo nuevo.
    15. Repita los pasos 4.10.2-4.10.10 una vez.
    16. Resuspend con 10,5 μL de agua. Mezclar bien mediante pipeteo.
    17. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
    18. Coloque el tubo en el soporte magnético durante 5 minutos hasta que el líquido aparezca claro.
    19. Transfiera 10 μL del sobrenadante a un nuevo tubo y guárdelo a -20 °C.
11. Evaluar la calidad y cantidad de la biblioteca de acuerdo con los requisitos de la instalación de secuenciación.

Resultados

Después de la microdisección de captura láser, puntas de cola individuales de machos y hermafroditas en 4 puntos de tiempo (L3 22 h después de la eclosión; L4 24, 26 y 28 h después de la eclosión) se prepararon para la secuenciación de ARN utilizando el protocolo CEL-Seq2. Los cebadores CEL-Seq2 contienen códigos de barras únicos que permiten identificar bioinformáticamente las lecturas de secuenciación de una muestra en particular (en este caso, una punta de cola individual). Los datos de secuenciación se g...

Discusión

Pasos críticos del método
Si se realiza correctamente, el método descrito aquí obtendrá perfiles de ARN robustos con un número relativamente pequeño de muestras diseccionadas con láser (70 puntas de cola en este ejemplo). Sin embargo, para las muestras de animales en desarrollo, la sincronización estrecha es fundamental para reducir la variabilidad entre las muestras. Por esta razón, el protocolo recomienda el método de sombreado para la sincronización de gusanos. Aquí, el investigador pu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 µM PEN membrane glass slides RNase free	Leica	11600288	for LMD
500 µL PCR tubes (nuclease-free)	Axygen	732-0675	to cut the tail tips into
Compound microscope with 40x objective and DIC	any		to check age of worms
Desktop humidifier	any
Dissection microscope with transmitted light base	any		for all worm work
glass pasteur pipets	any		handle of worm pick
glass slides and coverslips	any		to check age of worms
LMD6 microdissection system	Leica	multiple	to cut tail tips
LoBind tubes 0.5 mL	Eppendorf	22431005
M9 Buffer			Recipe in WormBook
Methanol 99.8%	Sigma	322415	to fix worms
NGM growth medium	US Biological	N1000	Buffers and salts need to be added: Recipe in WormBook
P10 pipette variablle volume	e.g. Gilson
P1000 pipette variable volume	e.g. Gilson
P2 pipette variable volume	e.g. Gilson
Pipette tips 1,000 µL	any
Pipette tips 1-10 µL filtered	any
platinum iridium wire	Tritech	PT-9010	to make worm pick
sterile and nuclease-free 1 mL centrfuge tubes	any
Tween 20	Sigma	P9416	Add a very small amount to M9 buffer to prevent worms from sticking to the pipet tips
vented 6 mm plastic Petri dishes	any
For CEL-Seq2
4200 TapeStation System with reagents for high-sensitivity RNA and DNA detection	Aligent		automated electrophoresis system
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63880	DNA cleanup beads
Bead binding buffer  20% PEG8000, 2.5 M NaCl
CEL-Seq2 primers (see Table S1)	Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf	6335000020	Thermal cycler with programmable lid and block for 200 µl tubes.
DNA Polymerase I (E. coli)	Invitrogen	18052-025
dNTP mix 10 mM	any
E. coli DNA ligase	Invitrogen	18052-019
Ethanol
ExoSAP-IT For PCR Product Clean-Up	Affymetrix	78200	exonuclease solution
MEGAscript T7 Transcription Kit	Ambion	AM1334	For step 4.6.1
Nuclease-free water	any
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	NEB	M0531	PCR mix step 4.9.7
random hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN	IDT		a primer with 6 nucleotides that are random
RNA Fragmentation buffer	NEB	E6150S
RNA Fragmentation stop buffer	NEB	E6150S
RNA PCR Index Primers (RPI1–RPI48)	Illumina, NEB, or IDT		RPIX in protocol step 4.9.7, sequences available from Illumina
RNAClean XP beads	Beckman Coulter	A63987
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Scientific	7000TS1	or any other similar product
RNaseH (E. coli)	Invitrogen	18021-071
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Invitrogen	10777-019
Second strand buffer	Invitrogen	10812-014
Superscripit II	Invitrogen	18064-014	reverse transcriptase