Türlerden Agnostik Tek Doku Uygulamaları için Lazer Mikrodiseksiyonu

Özet

RNA dizilimi için bireysel nematod dokularını izole etmek için lazer mikrodiseksiyonu kullanan bir protokol tanımlanmıştır. Protokol, türe özgü genetik araç setleri gerektirmez ve gen ekspresyon profillerinin tek doku örnekleri düzeyinde farklı türler arasında karşılaştırılmasına izin verir.

Özet

Tek hücreli metodolojiler, spesifik hücre tiplerinin transkriptomlarının analizinde devrim yaratmıştır. Bununla birlikte, genellikle floresan proteinlerin dokuya özgü ekspresyonunu yönlendiren destekleyiciler gibi türe özgü genetik "araç setleri" gerektirirler. Ayrıca, bireysel hücreleri izole etmek için dokuları bozan protokoller, hücreleri doğal ortamlarından uzaklaştırır (örneğin, komşulardan sinyal verme) ve stres tepkilerine veya doğal gen ekspresyon durumlarından başka farklılıklara neden olabilir. Mevcut protokolde, lazer mikrodiseksiyonu (LMD), erkek kuyruk ucu morfogenezi sırasında gen ekspresyonunun incelenmesi için bireysel nematod kuyruk uçlarını izole etmek için optimize edilmiştir.

LMD, hücresel bozulmaya veya türe özgü araç setlerine ihtiyaç duymadan hayvanın bir kısmının izole edilmesine izin verir ve bu nedenle herhangi bir türe uygulanabilir. Daha sonra, CEL-Seq2 gibi tek hücreli RNA-seq kütüphanesi hazırlama protokolleri, LMD ile izole edilmiş tek dokulara uygulanabilir ve türler için iyi açıklamalı bir genom veya transkriptomun mevcut olması koşuluyla, standart boru hatları kullanılarak analiz edilebilir. Bu tür veriler, bu dokunun farklı türlerdeki gelişiminin altında yatan transkriptomların ne kadar korunduğunu veya farklı olduğunu belirlemek için kullanılabilir.

Sınırlamalar, ilgilenilen dokuyu ve örneklem büyüklüğünü kesme yeteneğini içerir. Bir güç analizi, %80 güç için koşul başına 70 kadar az kuyruk ucunun gerekli olduğunu göstermektedir. Aynı gelişim aşamasında bu sayıda hayvanı elde etmek için gelişimin sıkı senkronizasyonu gereklidir. Böylece, hayvanları 1 saatlik aralıklarla senkronize etmek için bir yöntem de açıklanmaktadır.

Giriş

Nematodlar – özellikle Caenorhabditis elegans model sistemi ile ilgili rabditid nematodlar – birçok nedenden dolayı evrimsel gelişim biyolojisi (EDB) için harika bir hayvan grubudur ^1,2. Avantajları arasında az sayıda hücre, tanımlanmış ve tutarlı hücre soyları, şeffaflık ve kültür ve hayvancılık kolaylığı sayılabilir. Ayrıca, birden fazla tür için yüksek kaliteli genomlar ve C. elegans için kapsamlı moleküler genetik araçlar ve gelişim, genetik, anatomi ve fizyoloji hakkında bilgi 3,4,5,6 dahil olmak üzere birçok kaynak mevcuttur.

Diğer birçok organizmada olduğu gibi, tek dokularda veya tek hücrelerde transkriptom dinamiklerini karakterize etme yeteneği, C. elegans 7,8,9,10'daki gelişim analizinde devrim yaratmıştır. Nematodlar arasındaki tek hücreli transkriptomları karşılaştırabilmek, bu organizmaları kullanarak EDB'yi benzer şekilde dönüştürecektir. Örneğin, bu tür karşılaştırmalar, gen düzenleyici ağların korunan karakterler (özellikler), ayrılan karakterler veya bağımsız olarak evrimleşen karakterler için nasıl geliştiğine dair fikir verecektir.

Bununla birlikte, belirli dokuları veya hücreleri nematodlardan izole etmek en büyük zorluklardan biridir. Birçok organizma için, tek hücreler dokulardan ayrılabilir ve tarafsız bir şekilde toplanabilir veya bir floresan proteininin dokuya özgü ekspresyonu ile etiketlenebilir ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ¹¹ ile sıralanabilir. C. elegans'ta, hücrelerin yüksek verimli (HTP) izolasyonu çoğunlukla embriyolarla sınırlandırılmıştır, çünkü sert dış kütikül (ve hidrostatik iskelet) larvalardan ve yetişkinlerden hücre izolasyonunu engellemiştir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, bazı yöntemler, dokuya özgü mRNA etiketleme¹² gibi tüm C. elegans solucanlarında genetik araçlar ve bir hücre tipi^13'ü etkileyen vahşi tip ve mutantlar arasındaki diferansiyel ekspresyon karşılaştırmalarını kullanmıştır. Daha yeni yöntemler, çekirdek^14'ü veya tüm hücreleri ^8,9,15 izole etmek için kütikülü çözerek zorluğun üstesinden ^gelmiştir. Bununla birlikte, hücre izolasyonu ve hücre kültürü, hücrelerin doğal gelişimsel veya anatomik bağlamlarından (örneğin, hücre-hücre sinyallemesinden ve hücre dışı matrisle temastan uzak) uzaklaştırılmasının belirgin dezavantajlarına sahiptir ve bunların gen ekspresyon profilini etkilemesi beklenmektedir¹⁵. Dahası, genetik araçlar ve dokuya özgü belirteçler türe özgüdür (yani, sadece C. elegans'ta kullanılabilirler).

LMD, hücrelerin doğal bağlamını bozmadan dokuları izole etmek için alternatif bir yöntem sunar. EDB için önemli ölçüde LMD, bu türlerin genomu veya tüm transkriptom dizileri mevcutsa, türe özgü genetik araç setlerine ihtiyaç duymadan farklı türlerin homolog dokularından transkriptomların karşılaştırılmasına da izin verir. LMD, doğrudan mikroskobik gözlem yoluyla dokuları hedeflemeyi ve ilgilenilen dokuyu kesmek ve hasat etmek (yakalamak) için mikroskopun optiğine entegre edilmiş bir lazer mikroışını kullanmayı içerir¹⁶. LMD'nin sınırlamaları, çok HTP yaklaşımlarına elverişli olmamasıdır (bu protokolde açıklandığı gibi kuyruk uçları için transkripsiyon profilleri ~ 70 numune ile sağlam olmasına rağmen), bazı numunelerin diseksiyonu zor olabilir ve kesikler lazerin hassasiyeti ve mikroskopta görselleştirilebilecek şeylerle sınırlıdır.

Bu protokolün amacı, LMD'nin, ardından tek dokulu RNA-Seq'in, nematodlardan evre ve dokuya özgü transkriptom verilerini elde etmek için nasıl kullanılabileceğini tanımlamaktır. Spesifik olarak, kuyruk uçlarını C. elegans'ın dördüncü aşama larvalarından (L4) izole etmek için LMD'yi gösterir. Bununla birlikte, bu yöntem diğer dokulara ve elbette farklı türlere uyarlanabilir.

C. elegans'ta, hem erkeklerde hem de hermafroditlerde kuyruk ucunu yapan 4 hücre vardır. Erkeklerde L4 aşamasında - ancak hermafroditlerde değil - kuyruk ucu hücreleri şekillerini değiştirir ve ön ve içe doğru göç eder. Bu süreç aynı zamanda diğer tüm rabditid nematod türlerinde değil, bazılarında da görülür. Bu nedenle, kuyruk ucu cinsel dimorfik morfogenezin evrimi için iyi bir modeldir. Konumu nedeniyle, kuyruk ucunun LMD tarafından izole edilmesi de kolaydır.

Kuyruk uçlarından transkriptom profilleri elde etmek için, mevcut protokol tek hücreler için geliştirilmiş bir RNA-seq yöntemi olan CEL-Seq2'yi kullanır^17,18. Bu yöntemin LMD türevi dokular için birçok avantajı vardır. CEL-Seq2, mRNA okumalarının doğrudan nicelleştirilmesine, doğrusal amplifikasyonu sağlamak için in vitro transkripsiyona ve bireysel doku örneklerinin çoğullanmasına izin veren barkodlamaya izin vermek için benzersiz moleküler tanımlayıcılar (UMI'ler) kullanarak oldukça hassas ve verimlidir. CEL-Seq2'nin tek sınırlaması, geri kazanılan okumaların mRNA'ların 3' ucuna önyargılı olması ve bu nedenle çoğu izoformun ayırt edilememesidir.

Protokol

1. Solucan senkronizasyonu

NOT: C. elegans ve diğer rabditid türlerinin gelişimini senkronize etmek için aşağıda iki yöntem açıklanmıştır.

1. Alkali hipoklorit (ağartıcı) tedavisini takiben ilk larva aşaması (L1) tutuklaması ile senkronize edin.
   Not: Bu yöntem daha önce ayrıntılı¹⁹ açıklanmıştır. Bu yöntem, C. elegans'ın diğer bazı rabditid türleri için de geçerli olan iki özelliğine dayanır: (1) Yumurta kabuğu ağartıcıya karşı dirençlidir, oysa yetişkin ve larva solucanlarını çevreleyen kütikül değildir. (2) Birinci aşama larvalar, yiyeceksiz tutulduğunda gelişmeyi durdurur²⁰.
   1. Kütiküllerini parçalamak ve embriyoları serbest bırakmak için gravid hermafroditleri (veya dişileri) seyreltilmiş bir ağartıcı çözeltisi ile tedavi edin.
   2. Embriyoları ağartıcıdan çıkarın ve tüm L1 yumurtadan çıkana kadar yiyeceksiz tutun.
   3. Tutuklanan L1'i, hepsinin aynı anda gelişmeye devam ettiği yiyeceklere yerleştirin.
      NOT: L1 tutuklamasından çıkış bir saat içinde gerçekleşebilir.
2. "Hatch-off" yöntemiyle senkronizasyon (burada kullanılır; Şekil 1 üst):
   NOT: Hatch-off yöntemi, gelişimin kesintiye uğramadan sıkı senkronizasyona izin verir (L1 tutuklaması, daha sonraki aşamaların bile gelişimini etkiler²¹). Protokol Pepper et ^al.22'den uyarlanmıştır. Bu yöntemin amacı, sadece embriyo içeren bir plakadan belirli bir süre boyunca yumurtadan çıkan L1'i toplamaktır.
   1. Anneleri seçin: Kuluçka işlemini gerçekleştirmeden önceki akşam, E. coli OP50 ile tohumlanmış bir tabağa ~ 30 gravid hermafrodit seçin.
   2. Gece boyunca yumurtlamak için 25 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Solucanların sıkışabileceği çatlaklar veya kabarcıklar içermeyen bir plaka seçin. Çok kalın bir bakteri çimi olan plakalardan kaçının, çünkü daha sonra tüm solucanları çıkarmak zor olacaktır. Sıcaklığa duyarlı bir suşla çalışıyorsanız, yumurtlama süresini daha uzun embriyogenezi hesaba katacak şekilde ayarlayın. Anneleri maksimum yumurtlama aşamasında seçin.
   3. Anneleri ve larvaları çıkarın: ertesi sabah, diseksiyon mikroskobu altında (20x büyütme), fışkırtma olmadan plakanın duvarına nazikçe 1-2 mL M9 tamponu pipetin; solucanları yerinden çıkarmak için plakayı döndürün.
   4. Pipet ucunu agarın kenarındaki plakanın duvarına yerleştirerek tüm sıvı ve solucanları çıkarın ve atın. Plakada solucan (ve sadece yumurta / embriyo) kalmadığını, özellikle L1'lerin kalmadığını kontrol edin; aksi takdirde, yıkamayı tekrarlayın.
   5. Plakayı 1 saat boyunca 25 ° C'ye yerleştirin ve bazı L1'lerin yumurtadan çıkmasını bekleyin.
   6. Yeni taranmış L1'leri toplayın: 1 mL M9 tamponunu agarın üzerine dikkatlice bırakın. L1'i yerinden çıkarmak için plakayı döndürün, ancak embriyoları değil. Pipet tamponunu nazikçe tamponlayın ve 1 mL'lik bir santrifüj tüpüne solucanlar yerleştirin.
   7. Tüpü ~ 18.000 × g'da 1 dakika boyunca santrifüj yapın. Süper natantı çıkarın.
   8. Pipet L1 doğrudan tohumlanmış bir plakanın bakteri çimi üzerine. Diseksiyon mikroskobu altında yetişkin solucan veya embriyo bulunmadığını doğrulayın.
   9. Solucanları istenen aşamaya gelene kadar 25 ° C'de tutun.
      NOT: Koşullar uygunsa, aynı plakadan iki L1 partisi daha toplanabilir. L1 olmadığından emin olmak için ilk plakayı inceleyin. Gerekirse tekrar yıkayın. 1.2.5-1.2.9 arasındaki adımları yineleyin.
   10. Gelişimsel zamanlamayı kontrol edin. Aşağı akış uygulamasına geçmeden önce, istenen gelişim aşamasına, burada L3'e ulaştıklarını doğrulamak için bazı solucanları bileşik mikroskop altında 400x büyütmede inceleyin.
       NOT: Distal uç hücrelerinin veya bağlayıcı hücrelerin migrasyon mesafesi, vulva gelişimine ek olarak bir kılavuz olarak kullanılabilir. Vulva gelişimi için, Mock ve ark.23 yararlı bir rehber sağlar, ancak bu çalışmada zamanlama ²⁰ ° C'de belirlenmiştir. 25 ° C'de, vahşi tip C. elegans , yumurtadan çıktıktan 24 saat sonra L3-L4 moltüne maruz kalacaktır.

2. L4 erkeklerinin ve hermafroditlerin toplanması ve fiksasyonu

1. Fiksasyondan önce RNAse-içermeyen, soğuk (-20 °C), %70 metanol hazırlayın.
2. 30-50x büyütmede bir diseksiyon mikroskobu altında, cinsiyetler ayırt edilebilir olur olmaz (yumurtadan çıktıktan ~ 21 saat sonra, Şekil 2) senkronizasyon plakalarından erkekleri ve hermafroditleri ayrı tohumlanmamış plakalara toplamaya başlayın ve 1-2 saat veya 200 hayvan toplanana kadar toplamaya devam edin.
3. Solucanları, deney için istenen aşamaya ulaşana kadar 25 ° C'de tutun.
4. % 0,01 deterjan içeren M9 tamponu ile önceden yıkanmış bir pipet ucu kullanarak (solucanların uca yapışmasını önlemek için) solucanları plakadan 1-2 mL M9 tamponu ile yıkayın.
5. Solucanları 1 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
6. Solucanları peletlemek için 21.000 × g'de 1 dakika boyunca döndürün. Süper natantı çıkarın.
7. 1 mL M9 tamponu ekleyin ve peleti parçalamak için karıştırın.
8. Solucanları peletlemek için 21.000 × g'de 1 dakika boyunca döndürün. Süper natantı çıkarın.
9. Yıkamayı tekrarlayın.
10. 1 mL buz gibi soğuk% 70 metanol ekleyin ve iyice karıştırın.
11. Solucanları peletlemek için 21.000 × g'de 1 dakika boyunca döndürün. Süper natantı çıkarın.
12. 2.10 ve 2.11 numaralı adımları yineleyin.
13. 500 μL% 70 metanol ekleyin, karıştırın ve 1 saat ila gece boyunca 4 ° C'de saklayın.

3. Lazer mikrodiseksiyonu

NOT: Bundan sonra, RNase içermeyen reaktifleri ve sarf malzemelerini kullanın; filtre ipuçlarını kullanın.

1. Numuneleri işlemek için CEL-Seq2 yöntemi kullanılıyorsa, her bir CEL-Seq2 astarı için bir ana karışım hazırlayın (Ek Tablo S1): pipet 2 μL CEL-Seq2 primer, 1 μL 10 mM dNTP ve 9 μL % 1 β-Merkaptoetanol (RNaz içermeyen suda) etiketli bir 200 μL tüpe dönüştürün.
2. Slayta montaj
   1. Bir diseksiyon mikroskobu altında, sabit solucanların 20 μL'sini (adım 2.13'ten 20-40 solucan) bir polietilen naftalat (PEN)-membran cam slaytının mat tarafına (membranın olduğu yer) pipetin.
   2. Metanolün buharlaşmasını bekleyin. Buharlaşmayı hızlandırmak için bir slayt ısıtıcısı kullanın.
      NOT: Ek metanol damlaları uygulanabilir ve solucanlar kurudukça kümelenmeye başlarlarsa solucanları yaymak için bir pipet ucu kullanılır. Solucanlar kümeler halindeyken, diseksiyonları zor olabilir.
3. Mikroskopun kurulması
   NOT: Aşağıdaki protokol, Malzeme Tablosunda listelenen cihaza özgüdür. Farklı bir LMD mikroskobu kullanılıyorsa ayarlanması gerekir.
   1. LMD mikroskobunun yan tarafındaki sahnenin arkasına bir masaüstü nemlendirici yerleştirin. Buharın doğrudan sahneye üflendiğinden emin olun.
      NOT: Nemlendirici, statik elektriği azaltmak için yararlıdır, aksi takdirde küçük membran bölümünün tüp kapağına düşmesini önleyebilir.
   2. Lazer gücü için anahtarı çevirin.
   3. Sahne alanı kontrol gücünü açın.
   4. Mikroskop kontrol kutusunu açın.
   5. Lazer Mikrodiseksiyon yazılımını açın.
   6. Plastik kalkanı sahnenin üzerinden çıkarın.
   7. Membran kızaklarını yüklemek için yukarı ok ile boşalt düğmesine tıklayın.
   8. Kızağın tamamen kuru olduğundan emin olun, membran aşağı bakacak şekilde çevirin.
   9. Slaytı ekleyin ve örneği değiştir penceresinde devam'ı tıklatın.
   10. Plastik kalkanı değiştirin.
   11. Ekranın alt kısmında, slaytın hangi slayt tutucuyu içerdiğini seçin.
   12. Tüpleri yüklemek için, aşağı doğru oku içeren boşaltma düğmesine tıklayın.
   13. Tepsiyi dışarı çekin ve tüp bloğunu çıkarın.
       NOT: Bu deney için kullanılan tüp bloğu 500 μL PCR tüpleri içindir.
   14. 500 μL PCR tüplerinin tüp kapaklarını tutucuya yerleştirin ve tüpü altına katlayın.
   15. Bloğu tepsiye geri döndürün ve tepsiyi mikroskop aşamasına geri kaydırın.
   16. Toplayıcı cihazı değiştir açılır penceresinde, PCR tüpleri'ni seçin ve Tamam'ı tıklatın.
   17. Toplayıcı cihaz tüp kapaklarının altındaki ekranın sol alt köşesindeki boş tüp konumuna tıklayın.
   18. Mikroskop kontrol panelinde, iletilen ışık parlak alan aydınlatması için TL-BF'yi seçin.
4. Kesim
   NOT: Bu protokol, Malzeme Tablosunda listelenen enstrümana özgüdür.
   1. 2,5x lensi kullanarak, solucanlar ve membranın yapısı görünene kadar odağı ayarlayın.
   2. 20x lense geçin.
   3. Sahneyi solucanların olmadığı bir bölgeye taşıyın. Lazeri doğru odak düzlemine odaklamak için membrandaki kabarcık benzeri yapıların sarımsı bir renge sahip olması için odağı ayarlayın (Şekil 3A, B).
   4. Lazer parametrelerini ayarlayın; kuyruk uçları için Power 45, diyafram açıklığı 30 ve hız 20 ile başlayın.
   5. Lazer Kontrol panelinde kalibre et'i seçin. Talimatları izleyin.
      NOT: Cihaz bu adımı otomatik olarak gerçekleştirir. Ekranda fare ile çizilen bir şeklin lazer tarafından kesilen şekille aynı olmasını sağlayacaktır.
   6. Kollektör cihazı tüp kapaklarındaki ekranın alt kısmında, A konumuna tıklayın.
   7. Ekranın sağ tarafında, tek şekli seçin | Çiz + Kes. Ekranın sol tarafında PtoP'yi seçin.
   8. Bir çizgi çizin.
   9. Lazerin membranı kesmesi için Start Cut (Kesimi Başlat) düğmesini tıklatın.
      NOT: Ayrıca camın içine bir çizgi kazıyabilir.
   10. Bu test kesimi iyi görünüyorsa (membran kesilir, kesimin kenarları pürüzsüz görünür), bir sonraki adımla devam edin. Aksi takdirde, odağı ayarlayın ve başka bir çizgi kesin.
   11. Bir solucan bul. Taşı + Kes seçeneğine geçin ve kuyruğu kesmek için fareyi kullanın.
       NOT: Lazer kuyruğu kesmezse, odağı ayarlayın ve lazer gücünü artırın. Daha kalın dokular için, lazer gücünün 60 olarak ayarlanması gerekebilir.
   12. Parametreleri kaydetme: Dosya sekmesi | Uygulama Yapılandırmasını Kaydet; daha sonra almak için, Uygulama Yapılandırmasını Geri Yükle.
   13. Numuneyi toplamak için, PtoP işleviyle Draw + Cut ayarına geçin ve bir membran bölümünün kesimini tamamlamak için bir şekil çizin (Şekil 3C).
       NOT: Daha büyük membran kesitleri ve daire veya oval yerine dikdörtgen veya üçgen şeklinde bölümlerin kolektör tüp kapağında bulunması daha kolaydır.
   14. Ekranın altındaki Collector Device Tube Cap'te bir sonraki tüpü seçin ve bir sonraki kuyruk ucunu kesin.
   15. Dört kuyruk kesildikten sonra, tüp rafını boşaltın (aşağı doğru okla boşalt'a tıklayın) ve membran bölümlerini diseksiyon mikroskobu altında bulun (Şekil 3D).
       NOT: Bölümler boru kapağının ortasına yerleştirilmiş veya kapağın yan tarafına yapıştırılmış olabilir.
   16. Aşağı akış uygulamasıyla devam edin. CEL-Seq2 için, doğrudan numunenin üzerine bir CEL-Seq2 astar ana karışımından (adım 3.1'den itibaren) 1,2 μL pipet.
   17. Tüpü kapatın, astar numarası ile etiketleyin ve numuneyi flaş dondurmak ve RNA bozulmasını önlemek için tüp kapağını doğrudan bir kuru buz parçasının üzerine yerleştirin.
   18. Daha fazla tüp yükleyin, tüp bloğunu sahneye geri döndürün ve daha fazla numune kesin. Her kuyruk ucuna farklı bir CEL-Seq2 astar karışımı ekleyin.
   19. Tüm tüpleri -70 °C'de saklayın.

4. CEL-Seq2 ile tek kuyruklu RNA dizilimi

NOT: CEL-Seq2 protokolü hakkında tüm ayrıntılar için Yanai ve Hashimshony^18'e bakınız.

1. RNA bozulmasını önlemek için laboratuvar tezgah alanını RNase dekontaminasyon çözeltisi ile temizleyin.
2. Ana karışımlar hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
   1. Ters transkripsiyon ana karışımını hazırlayın: 0.4 μL birinci iplik tamponu, 0.1 μL 0.1M DTT, 0.1 μL RNaz inhibitörü ve numune başına 0.1 μL ters transkriptaz.
   2. İkinci iplik reaksiyonu ana karışımını hazırlayın: 7 μL su, 2.31 μL ikinci iplik tamponu, 0.23 μL dNTP, 0.08 μL E. coli ligaz, 0.3 μL E. coli DNA polimeraz, numune başına 0.08 μL RNaseH.
3. Açık hücrelerin kırılması ve primerlerle tavlanması (primerlerin tam listesi için Ek Tablo S1'e bakınız):
   1. Termosikler ve kapağını 65 °C'ye programlayın.
   2. Numuneleri -70 °C'den alın ve termosikler içinde 2,5 dakika boyunca inkübe edin.
   3. 30-40 s için 21.000 × g'da döndürün.
   4. 2,5 dakika boyunca 65 °C'de inkübe edin.
   5. Onları hemen buza taşıyın.
   6. 30-40 s için 21.000 × g'da döndürün ve buza geri döndürün.
4. RNA'yı cDNA'ya dönüştürme:
   1. Her kuyruk ucuna ters transkripsiyon karışımından 0,8 μL ekleyin.
   2. 1 saat boyunca 42 °C'de inkübe edin.
   3. 70 °C'de 10 dakika boyunca ısıl inaktif.
   4. Hemen buza taşıyın.
   5. Her kuyruk ucuna ikinci iplik karışımından 10 μL ekleyin.
   6. Örnekleri hafifçe kaydırın.
   7. 30-40 s için 21.000 × g'da döndürün.
   8. 2 saat boyunca 16 °C'de inkübe edin.
5. cDNA temizliği:
   1. DNA temizleme boncuklarını oda sıcaklığına önceden ısıtın.
   2. 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpünde (480 μL'ye kadar) 40 adede kadar numuneyi bir araya getirin.
   3. Boncukları iyice dağılana kadar karıştırın ve havuzlanmış numunenin her 100 μL'si için 20 μL boncuk ve 100 μL boncuk bağlama tamponu ekleyin (480 μL numune için 1.056 μL'ye kadar son hacme 480 μL boncuk tamponu ve 96 μL boncuk ekleyin). Pipetleme yaparak iyice karıştırın.
   4. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
   5. Sıvı berrak görünene kadar en az 5 dakika manyetik bir stand üzerine yerleştirin.
   6. Süpernatanın 20 μL hariç hepsini çıkarın ve atın.
   7. 200 μL taze hazırlanmış% 80 etanol ekleyin.
   8. En az 30 saniye boyunca inkübe edin, boncukları rahatsız etmeden pipetleyerek süpernatantı çıkarın. Süper natantı atın.
   9. 4.5.7 ve 4.5.8 numaralı adımları bir kez yineleyin.
   10. Boncukları 15 dakika veya tamamen kuruyana kadar havayla kurulayın.
   11. Boncukları (~ 6.4 μL) 6.4 μL su ile yeniden askıya alın. Tüm ses seviyesini on kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, iyice karıştırın.
   12. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
   13. Doğrudan in vitro transkripsiyona (IVT) gidin.
6. In vitro transkripsiyon ve parçalanma:
   1. 6.4 μL numune ve boncuk içeren tüpe aşağıdaki karışımı (toplam 9.6 μL) ekleyin: 1.6 μL 10x T7 Tampon, 1.6 μL ATP, 1.6 μL UTP, 1.6 μL CTP ve 1.6 μL GTP (75 mM konsantrasyonunda her dNTP) 1.6 μLof T7 enzimi.
   2. 4 °C'lik bir tutuşla 37 °C'de 13 saat boyunca inkübe edin.
   3. 6 μL ekzonükleaz çözeltisi ekleyin (son hacim 22 μL olmalıdır).
   4. 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
   5. Tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin ve 5,5 μL parçalanma tamponu ekleyin (reaksiyon hacmi 0,25 ×).
   6. 94 °C'de 3 dakika kuluçkaya yatırın.
   7. Tüpü hemen buza taşıyın ve 2.75 μL parçalanma durdurma tamponu ekleyin (0.5 × hacimli parçalanma tamponu eklendi).
   8. Sıvı berrak görünene kadar tüpü manyetik stand üzerine en az 5 dakika yerleştirerek boncukları çıkarın.
   9. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.
7. Güçlendirilmiş RNA (aRNA) temizliği:
   1. RNA temizleme boncuklarını oda sıcaklığına önceden ısıtın.
   2. Boncukları iyice dağılana kadar karıştırın.
   3. Pipet 55 μL boncuk (reaksiyon hacmi 1,8 ×).
   4. Onları 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
   5. Sıvı berrak görünene kadar tüpü manyetik standın üzerine en az 5 dakika yerleştirin.
   6. Süpernatanın 80 μL'sini çıkarın ve atın.
   7. 200 μL taze hazırlanmış% 70 etanol ekleyin.
   8. En az 30 s kuluçkaya yatırın, boncukları rahatsız etmeden pipetleyerek süpernatantı çıkarın. Süper natantı atın.
   9. Etanol yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
   10. Boncukları 15 dakika veya tamamen kuruyana kadar havayla kurulayın.
   11. Boncukları 7 μL su ile yeniden askıya alın. İyice karıştırmak için tüm hacmi 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
   12. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
   13. Tüpü, sıvı berrak görünene kadar 5 dakika boyunca boncuklarla manyetik stand üzerine yerleştirin.
   14. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.
       NOT: Durma noktası: numuneler -70 °C'de tutulabilir.
8. İsteğe bağlı: Üreticinin protokolünü takip eden otomatik bir elektroforez sistemi ile aRNA miktarını ve kalitesini kontrol edin.
9. Kütüphane hazırlığı:
   1. 5 μL RNA'ya, 1 μL 100 μM rastgele hexamer RT primer ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 10 mM dNTP'nin 0.5 μL'sini ekleyin.
   2. 5 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edin.
   3. Oda sıcaklığında aşağıdaki karışımdan 4 μL ekleyin: 2 μL Birinci Strand tamponu, 1 μL 0.1 M DDT, 0.5 μL RNaz inhibitörü, 0.5 μL ters transkriptaz.
   4. 10 dakika boyunca 25 °C'de inkübe edin.
   5. 1 saat boyunca 42 °C'de inkübe edin (bir hibridizasyon fırınında veya kapağı 50 °C'ye ayarlanmış önceden ısıtılmış bir termal bisikletçide).
   6. 10 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe edin.
   7. 5 μL'yi yeni bir tüpe aktarın (reaksiyonun geri kalanını -20 ° C'de tutun). 5.5 μL ultra saf su, 1 μL RNA PCR Primer (RP1), 1 μL indekslenmiş RNA PCR Primer (RPIX) ve 12.5 μL PCR karışımı ekleyin.
   8. Termosiklusta aşağıdaki programı kullanın: 98 °C'de 30 sn, 11 çevrim: (98 °C'de 10 sn, 60 °C'de 30 sn, 72 °C'de 30 sn), 72 °C'de 10 dk, 4 °C'de tutun.
      NOT: Durma noktası: numuneler -20 °C'de tutulabilir.
10. Kütüphane temizleme:
    1. DNA temizleme boncuklarını oda sıcaklığına önceden ısıtın.
    2. Boncukları iyice dağılana kadar karıştırın.
    3. PCR reaksiyonuna 25 μL boncuk ekleyin. Pipetleme yaparak iyice karıştırın.
    4. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
    5. Sıvı berrak görünene kadar tüpü manyetik standın üzerine en az 5 dakika yerleştirin.
    6. Supernatant'ın 45 μL'sini çıkarın ve atın.
    7. 200 μL taze hazırlanmış% 80 etanol ekleyin.
    8. En az 30 saniye boyunca inkübe edin, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
    9. Etanol yıkamayı bir kez tekrarlayın.
    10. Boncukları 15 dakika veya tamamen kuruyana kadar havayla kurutun.
    11. Onları 25 μL su ile tekrar askıya alın. Pipetleme yaparak iyice karıştırın.
    12. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
    13. Sıvı berrak görünene kadar tüpü manyetik standın üzerine 5 dakika yerleştirin.
    14. 25 μL süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.
    15. 4.10.2-4.10.10 arasındaki adımları bir kez yineleyin.
    16. 10.5 μL su ile tekrar askıya alın. Pipetleme yaparak iyice karıştırın.
    17. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
    18. Sıvı berrak görünene kadar tüpü manyetik standın üzerine 5 dakika yerleştirin.
    19. Süpernatantın 10 μL'sini yeni bir tüpe aktarın ve -20 ° C'de saklayın.
11. Kütüphane kalite ve niceliğini sıralama tesisinin ihtiyacına göre değerlendirir.

Sonuçlar

Lazer yakalama mikrodiseksiyonunu takiben, erkeklerin ve hermafroditlerin 4 zaman noktasında bireysel kuyruk uçları (L3 Yumurtadan 22 saat sonra; L4 24, 26 ve 28 saat sonra kapak) CEL-Seq2 protokolü kullanılarak RNA dizilimi için hazırlandı. CEL-Seq2 astarları, belirli bir numuneden (bu durumda bireysel bir kuyruk ucundan) gelen sıralama okumalarının biyoinformatik olarak tanımlanmasını sağlayan benzersiz barkodlar içerir. Bu yöntemle toplam 557 kuyruk ucu (4 gelişimsel zaman noktasında 266 hermafrodi...

Tartışmalar

Yöntemin kritik adımları
Doğru şekilde gerçekleştirilirse, burada açıklanan yöntem, nispeten az sayıda lazerle disseke edilmiş numune içeren sağlam RNA profilleri elde edecektir (bu örnekte 70 kuyruk ucu). Bununla birlikte, gelişmekte olan hayvanlardan alınan örnekler için, sıkı senkronizasyon, numuneler arasındaki değişkenliği azaltmak için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, protokol solucan eşitlemesi için ambar kapatma yöntemini önerir. Burada, araştırmacı bireyler...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 µM PEN membrane glass slides RNase free	Leica	11600288	for LMD
500 µL PCR tubes (nuclease-free)	Axygen	732-0675	to cut the tail tips into
Compound microscope with 40x objective and DIC	any		to check age of worms
Desktop humidifier	any
Dissection microscope with transmitted light base	any		for all worm work
glass pasteur pipets	any		handle of worm pick
glass slides and coverslips	any		to check age of worms
LMD6 microdissection system	Leica	multiple	to cut tail tips
LoBind tubes 0.5 mL	Eppendorf	22431005
M9 Buffer			Recipe in WormBook
Methanol 99.8%	Sigma	322415	to fix worms
NGM growth medium	US Biological	N1000	Buffers and salts need to be added: Recipe in WormBook
P10 pipette variablle volume	e.g. Gilson
P1000 pipette variable volume	e.g. Gilson
P2 pipette variable volume	e.g. Gilson
Pipette tips 1,000 µL	any
Pipette tips 1-10 µL filtered	any
platinum iridium wire	Tritech	PT-9010	to make worm pick
sterile and nuclease-free 1 mL centrfuge tubes	any
Tween 20	Sigma	P9416	Add a very small amount to M9 buffer to prevent worms from sticking to the pipet tips
vented 6 mm plastic Petri dishes	any
For CEL-Seq2
4200 TapeStation System with reagents for high-sensitivity RNA and DNA detection	Aligent		automated electrophoresis system
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63880	DNA cleanup beads
Bead binding buffer  20% PEG8000, 2.5 M NaCl
CEL-Seq2 primers (see Table S1)	Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf	6335000020	Thermal cycler with programmable lid and block for 200 µl tubes.
DNA Polymerase I (E. coli)	Invitrogen	18052-025
dNTP mix 10 mM	any
E. coli DNA ligase	Invitrogen	18052-019
Ethanol
ExoSAP-IT For PCR Product Clean-Up	Affymetrix	78200	exonuclease solution
MEGAscript T7 Transcription Kit	Ambion	AM1334	For step 4.6.1
Nuclease-free water	any
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	NEB	M0531	PCR mix step 4.9.7
random hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN	IDT		a primer with 6 nucleotides that are random
RNA Fragmentation buffer	NEB	E6150S
RNA Fragmentation stop buffer	NEB	E6150S
RNA PCR Index Primers (RPI1–RPI48)	Illumina, NEB, or IDT		RPIX in protocol step 4.9.7, sequences available from Illumina
RNAClean XP beads	Beckman Coulter	A63987
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Scientific	7000TS1	or any other similar product
RNaseH (E. coli)	Invitrogen	18021-071
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Invitrogen	10777-019
Second strand buffer	Invitrogen	10812-014
Superscripit II	Invitrogen	18064-014	reverse transcriptase