Laser-Mikrodissektion für speziesunabhängige Einzelgewebeanwendungen

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll beschrieben, das Laser-Mikrodissektion verwendet, um einzelne Nematodengewebe für die RNA-Sequenzierung zu isolieren. Das Protokoll erfordert keine artspezifischen genetischen Toolkits, so dass Genexpressionsprofile zwischen verschiedenen Spezies auf der Ebene von Einzelgewebeproben verglichen werden können.

Zusammenfassung

Einzelzellmethoden haben die Analyse der Transkriptome bestimmter Zelltypen revolutioniert. Sie erfordern jedoch oft speziesspezifische genetische "Toolkits", wie z.B. Promotoren, die die gewebespezifische Expression fluoreszierender Proteine vorantreiben. Darüber hinaus entfernen Protokolle, die Gewebe stören, um einzelne Zellen zu isolieren, Zellen aus ihrer nativen Umgebung (z. B. Signalisierung von Nachbarn) und können zu Stressreaktionen oder anderen Unterschieden von nativen Genexpressionszuständen führen. Im vorliegenden Protokoll ist die Lasermikrodissektion (LMD) optimiert, um einzelne Nematodenschwanzspitzen für die Untersuchung der Genexpression während der Morphogenese der männlichen Schwanzspitze zu isolieren.

LMD ermöglicht die Isolierung eines Teils des Tieres ohne zelluläre Störung oder artspezifische Toolkits und ist somit auf jede Art anwendbar. Anschließend können einzellige RNA-seq-Bibliotheksvorbereitungsprotokolle wie CEL-Seq2 auf LMD-isolierte Einzelgewebe angewendet und mithilfe von Standardpipelines analysiert werden, vorausgesetzt, dass ein gut annotiertes Genom oder Transkriptom für die Spezies verfügbar ist. Solche Daten können verwendet werden, um festzustellen, wie konserviert oder unterschiedlich die Transkriptome sind, die der Entwicklung dieses Gewebes bei verschiedenen Arten zugrunde liegen.

Zu den Einschränkungen gehört die Möglichkeit, das interessierende Gewebe und die Stichprobengröße auszuschneiden. Eine Leistungsanalyse zeigt, dass nur 70 Heckspitzen pro Bedingung für 80% Leistung benötigt werden. Eine enge Synchronisation der Entwicklung ist erforderlich, um diese Anzahl von Tieren im gleichen Entwicklungsstadium zu erhalten. Somit wird auch eine Methode beschrieben, Tiere in 1-Stunden-Intervallen zu synchronisieren.

Einleitung

Nematoden – insbesondere die Rhabditiden-Nematoden, die mit dem Modellsystem Caenorhabditis elegans verwandt sind – sind aus vielen Gründen eine wunderbare Gruppe von Tieren für die evolutionäre Entwicklungsbiologie (EDB) ^1,2. Zu den Vorteilen gehören die geringe Anzahl von Zellen, definierte und konsistente Zelllinien, Transparenz und einfache Kultur und Haltung. Es gibt auch viele Ressourcen, darunter hochwertige Genome für mehrere Arten und für C. elegans, umfangreiche molekulargenetische Werkzeuge und Wissen über Entwicklung, Genetik, Anatomie und Physiologie 3,4,5,6.

Wie bei vielen anderen Organismen hat die Fähigkeit, die Transkriptomdynamik in einzelnen Geweben oder einzelnen Zellen zu charakterisieren, die Analyse der Entwicklung in C. elegans 7,8,9,10 revolutioniert. In der Lage zu sein, einzellige Transkriptome über Nematoden hinweg zu vergleichen, würde EDB in ähnlicher Weise mit diesen Organismen transformieren. Zum Beispiel würden solche Vergleiche Aufschluss darüber geben, wie sich genregulatorische Netzwerke für Charaktere (Merkmale) entwickelt haben, die konserviert wurden, für Charaktere, die divergiert sind, oder für Charaktere, die sich unabhängig voneinander entwickelt haben.

Die Isolierung bestimmter Gewebe oder Zellen von Nematoden ist jedoch eine der großen Herausforderungen. Für viele Organismen können einzelne Zellen aus Geweben dissoziiert und unvoreingenommen geerntet oder mit gewebespezifischer Expression eines fluoreszierenden Proteins markiert und durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)¹¹ sortiert werden. Bei C. elegans war die Hochdurchsatzisolierung (HTP) von Zellen hauptsächlich auf Embryonen beschränkt, da die zähe äußere Kutikula (und das hydrostatische Skelett) die Zellisolierung von Larven und Erwachsenen behindert hat. Um diese Herausforderung zu umgehen, haben einige Methoden genetische Werkzeuge in ganzen C. elegans-Würmern eingesetzt, wie z.B. gewebespezifisches mRNA-Tagging¹² und differentielle Expressionsvergleiche zwischen Wildtyp und Mutanten, die einen Zelltyp¹³ beeinflussen. Neuere Methoden haben die Herausforderung überwunden, indem sie die Kutikula aufgelöst haben, um Kerne 14 oder ganze Zellen ^8,9,15 zu isolieren. Zellisolierung und Zellkultur haben jedoch die offensichtlichen Nachteile, dass Zellen aus ihrem natürlichen Entwicklungs- oder anatomischen Kontext entfernt werden - z. B. weg von der Zell-Zell-Signalisierung und dem Kontakt mit der extrazellulären Matrix -, von denen erwartet wird, dass sie das Genexpressionsprofil^{beeinflussen 15}. Darüber hinaus sind die genetischen Werkzeuge und gewebespezifischen Marker artspezifisch (d.h. sie können nur in C. elegans verwendet werden).

LMD bietet eine alternative Methode zur Isolierung von Geweben, ohne den natürlichen Kontext von Zellen zu stören. Bezeichnend für EDB ist, dass LMD es auch ermöglicht, Transkriptome aus homologen Geweben verschiedener Spezies zu vergleichen, ohne dass speziesspezifische genetische Toolkits erforderlich sind, wenn Genom- oder ganze Transkriptomsequenzen dieser Spezies verfügbar sind. LMD beinhaltet das Targeting von Geweben durch direkte mikroskopische Beobachtung und die Verwendung eines Laser-Mikrostrahls - integriert in die Optik des Mikroskops -, um das Gewebe von Interesse auszuschneiden und zu ernten (^{einzufangen) 16}. Einschränkungen von LMD sind, dass es für sehr HTP-Ansätze nicht förderlich ist (obwohl die Transkriptionsprofile für Schwanzspitzen, wie in diesem Protokoll beschrieben, mit ~ 70 Proben robust waren), bestimmte Proben könnten schwierig zu sezieren sein, und Schnitte sind auf die Präzision des Lasers beschränkt und was im Mikroskop visualisiert werden kann.

Der Zweck des vorliegenden Protokolls ist es, zu beschreiben, wie LMD, gefolgt von RNA-Seq aus Einzelgewebe, verwendet werden kann, um stadien- und gewebespezifische Transkriptomdaten von Nematoden zu erhalten. Insbesondere zeigt es LMD zur Isolierung von Schwanzspitzen aus Larven der vierten Stufe (L4) von C. elegans. Diese Methode kann jedoch an andere Gewebe und natürlich an verschiedene Arten angepasst werden.

Bei C. elegans gibt es 4 Zellen, die sowohl bei Männchen als auch bei Hermaphroditen die Schwanzspitze bilden. Während des L4-Stadiums bei Männern - aber nicht bei Hermaphroditen - verändern die Schwanzspitzenzellen ihre Form und wandern anterior und innerlich. Dieser Prozess tritt auch bei einigen, aber nicht allen anderen Rhabditiden-Nematodenarten auf. Daher ist die Schwanzspitze ein gutes Modell für die Evolution der sexuell-dimorphen Morphogenese. Aufgrund ihrer Position ist die Heckspitze auch leicht mit LMD zu isolieren.

Um Transkriptomprofile von Schwanzspitzen zu erhalten, verwendet das vorliegende Protokoll CEL-Seq2, eine RNA-Seq-Methode, die für einzelne Zellen^17,18 entwickelt wurde. Diese Methode hat mehrere Vorteile für LMD-abgeleitete Gewebe. CEL-Seq2 ist hochempfindlich und effizient und verwendet eindeutige molekulare Identifikatoren (UMIs), um eine einfache Quantifizierung von mRNA-Lesevorgängen zu ermöglichen, In-vitro-Transkription, um eine lineare Amplifikation zu gewährleisten, und Barcodes, die das Multiplexen einzelner Gewebeproben ermöglichen. Die einzige Einschränkung von CEL-Seq2 besteht darin, dass wiederhergestellte Lesevorgänge auf das 3'-Ende von mRNAs verzerrt sind und die meisten Isoformen daher nicht unterschieden werden können.

Protokoll

1. Wurmsynchronisation

HINWEIS: Im Folgenden werden zwei Methoden beschrieben, um die Entwicklung von C. elegans und anderen rhabditidischen Arten zu synchronisieren.

1. Synchronisieren Sie durch den ersten Larvenstadium (L1) nach der alkalischen Hypochloritbehandlung (Bleichmittel).
   HINWEIS: Diese Methode wurde zuvor ausführlich^{beschrieben 19}. Diese Methode beruht auf zwei Merkmalen von C. elegans , die auch für mehrere andere Rhabditid-Arten gelten: (1) Die Eierschale ist resistent gegen Bleichmittel, während die Kutikula, die erwachsene und Larvenwürmer umgibt, dies nicht tut. (2) Larven im ersten Stadium halten die Entwicklung fest, wenn sie ohne Nahrung gehalten^{werden 20}.
   1. Behandeln Sie gravide Hermaphroditen (oder Frauen) mit einer verdünnten Bleichlösung, um ihre Nagelhaut aufzubrechen und Embryonen freizusetzen.
   2. Entfernen Sie die Embryonen aus dem Bleichmittel und bewahren Sie sie ohne Nahrung auf, bis alle L1 geschlüpft sind.
   3. Legen Sie die verhafteten L1 auf Lebensmittel, wo alle die Entwicklung ungefähr zur gleichen Zeit wieder aufnehmen.
      HINWEIS: Der Ausstieg aus der L1-Verhaftung kann innerhalb einer Stunde erfolgen.
2. Synchronisation mit der "Hatch-off"-Methode (hier verwendet; Abbildung 1 oben):
   HINWEIS: Die Hatch-Off-Methode ermöglicht eine enge Synchronisation ohne Unterbrechung der Entwicklung (L1-Arrest wirkt sich auch auf die Entwicklung späterer Stadien²¹ aus). Das Protokoll ist von Pepper et ^al.22 adaptiert. Das Ziel dieser Methode ist es, L1, die über einen bestimmten Zeitraum geschlüpft sind, von einer Platte zu sammeln, die nur Embryonen enthält.
   1. Wähle Mütter: Am Abend vor dem Hatch-Off pflücken Sie ~ 30 gravide Hermaphroditen auf eine Platte, die mit E. coli OP50 gesät ist.
   2. Bei 25 °C für die Eiablage über Nacht inkubieren.
      HINWEIS: Wählen Sie eine Platte ohne Risse oder Blasen, auf der Würmer stecken bleiben könnten. Vermeiden Sie Platten mit einem sehr dicken Bakterienrasen, da es schwierig sein wird, alle Würmer später zu entfernen. Wenn Sie mit einem temperaturempfindlichen Stamm arbeiten, passen Sie die Eiablagezeit an, um eine längere Embryogenese zu berücksichtigen. Wählen Sie Mütter in der maximalen Eiablagephase.
   3. Entfernen Sie Mütter und Larven: Am nächsten Morgen unter dem Seziermikroskop (20-fache Vergrößerung) pipettieren Sie vorsichtig 1-2 ml M9-Puffer gegen die Wand der Platte, ohne zu spritzen; Wirbeln Sie die Platte, um die Würmer zu entfernen.
   4. Entfernen und entsorgen Sie alle Flüssigkeiten und Würmer, indem Sie die Pipettenspitze an die Wand der Platte am Rand des Agars legen, um zu vermeiden, dass Löcher stechen. Stellen Sie sicher, dass keine Würmer (und nur Eier / Embryonen) auf dem Teller verbleiben, insbesondere keine L1s; Andernfalls wiederholen Sie die Wäsche.
   5. Legen Sie die Platte für 1 h auf 25 °C und warten Sie, bis einige L1 schlüpfen.
   6. Sammeln Sie frisch geschlüpfte L1s: Lassen Sie vorsichtig 1 ml M9-Puffer auf den Agar fallen. Schwenken Sie die Platte, um L1, aber nicht Embryonen zu entfernen. Pipettieren Sie vorsichtig Puffer und Würmer in ein 1 ml Zentrifugenröhrchen.
   7. Zentrifen Sie das Röhrchen für 1 min bei ~18.000 × g. Entfernen Sie den Überstand.
   8. Pipette L1 direkt auf den Bakterienrasen einer ausgesäten Platte. Überprüfen Sie unter dem Seziermikroskop, dass keine erwachsenen Würmer oder Embryonen vorhanden sind.
   9. Halten Sie Würmer bei 25 °C, bis sie sich auf das gewünschte Stadium entwickelt haben.
      HINWEIS: Wenn die Bedingungen optimal sind, können zwei weitere Chargen L1 von derselben Platte gesammelt werden. Überprüfen Sie die ursprüngliche Platte, um sicherzustellen, dass keine L1 vorhanden sind. Bei Bedarf erneut waschen. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.5-1.2.9.
   10. Überprüfen Sie das Entwicklungstiming. Bevor Sie mit der nachgeschalteten Anwendung fortfahren, untersuchen Sie einige Würmer unter einem zusammengesetzten Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung, um zu bestätigen, dass sie das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht haben, hier L3.
       HINWEIS: Die Migrationsentfernung von distalen Spitzenzellen oder Linkerzellen kann zusätzlich zur Vulvaentwicklung als Leitfaden verwendet werden. Für die Vulva-Entwicklung bieten Mock et al.23 einen nützlichen Leitfaden, obwohl das Timing in dieser Studie bei ²⁰ ° C bestimmt wurde. Bei 25 °C werden Wildtyp-C. elegans nach dem Schlüpfen 24 h der L3-L4-Häutung unterzogen.

2. Sammeln von L4-Männchen und Hermaphroditen und Fixierung

1. Vor der Fixierung RNAsefreies, kaltes (-20 °C), 70% Methanol herstellen.
2. Beginnen Sie unter einem Seziermikroskop bei 30-50-facher Vergrößerung mit der Ernte von Männchen und Hermaphroditen von den Synchronisationsplatten auf separaten ungesäten Platten, sobald die Geschlechter unterschieden werden können (~ 21 h nach dem Schlüpfen, Abbildung 2), und pflücken Sie für 1-2 h oder bis 200 Tiere gesammelt werden.
3. Halten Sie die Würmer bei 25 ° C, bis sie das gewünschte Stadium für das Experiment erreicht haben.
4. Waschen Sie die Würmer mit 1-2 ml M9-Puffer von der Platte mit einer Pipettenspitze, die mit M9-Puffer vorgewaschen wurde, der 0,01% Reinigungsmittel enthält (um zu verhindern, dass Würmer an der Spitze haften bleiben).
5. Überführen Sie die Würmer in ein 1 ml Zentrifugenröhrchen.
6. Drehen Sie für 1 min bei 21.000 × g , um die Würmer zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand.
7. Fügen Sie 1 ml M9-Puffer hinzu und mischen Sie, um das Pellet aufzubrechen.
8. Drehen Sie für 1 min bei 21.000 × g , um die Würmer zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand.
9. Wiederholen Sie die Wäsche.
10. Fügen Sie 1 ml eiskaltes 70% Methanol hinzu und mischen Sie gut.
11. Drehen Sie für 1 min bei 21.000 × g , um die Würmer zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand.
12. Wiederholen Sie die Schritte 2.10 und 2.11.
13. Fügen Sie 500 μL 70% Methanol hinzu, mischen Sie und lagern Sie es bei 4 °C für 1 h bis über Nacht.

3. Laser-Mikrodissektion

HINWEIS: Verwenden Sie von nun an RNase-freie Reagenzien und Verbrauchsmaterialien. Verwenden Sie Filtertipps.

1. Wenn die CEL-Seq2-Methode zur Verarbeitung der Proben verwendet wird, bereiten Sie eine Mastermischung für jeden CEL-Seq2-Primer vor (Zusatztabelle S1): Pipetten Sie 2 μL CEL-Seq2-Primer, 1 μL 10 mM dNTP und 9 μL 1% β-Mercaptoethanol (in RNase-freiem Wasser) in ein markiertes 200-μL-Röhrchen.
2. Montage auf Rutsche
   1. Unter einem Seziermikroskop werden 20 μL der fixierten Würmer (20-40 Würmer aus Schritt 2.13) auf die matte Seite eines Polyethylennaphthalat (PEN)-Membranglasobjektträgers pipettiert (wo sich die Membran befindet).
   2. Warten Sie, bis das Methanol verdampft ist. Verwenden Sie einen Schieberwärmer, um die Verdunstung zu beschleunigen.
      HINWEIS: Zusätzliche Tropfen Methanol können aufgetragen werden, und eine Pipettenspitze wird verwendet, um die Würmer auszubreiten, wenn sie beim Trocknen zu verklumpen beginnen. Wenn sich Würmer in Klumpen befinden, können sie schwer zu sezieren sein.
3. Einrichten des Mikroskops
   HINWEIS: Das folgende Protokoll ist spezifisch für das in der Materialtabelle aufgeführte Instrument. Es muss angepasst werden, wenn ein anderes LMD-Mikroskop verwendet wird.
   1. Stellen Sie einen Desktop-Luftbefeuchter hinter der Bühne an der Seite des LMD-Mikroskops auf. Stellen Sie sicher, dass der Dampf direkt auf die Bühne bläst.
      HINWEIS: Der Luftbefeuchter ist hilfreich, um statische Elektrizität zu reduzieren, die sonst verhindern kann, dass der kleine Membranabschnitt in die Rohrkappe fällt.
   2. Drehen Sie den Schlüssel für Laserleistung.
   3. Schalten Sie die Bühnensteuerung ein.
   4. Schalten Sie die Mikroskop-Steuerbox ein.
   5. Öffnen Sie die Laser-Mikrodissektionssoftware .
   6. Entfernen Sie die Kunststoffabschirmung über der Bühne.
   7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Entladen mit dem Aufwärtspfeil, um die Membranschienen zu laden.
   8. Stellen Sie sicher, dass der Objektträger vollständig trocken ist, drehen Sie ihn um, so dass die Membran nach unten zeigt.
   9. Fügen Sie die Folie ein, und klicken Sie im Fenster "Muster ändern" auf "Weiter".
   10. Ersetzen Sie die Kunststoffabschirmung (plastic shield).
   11. Wählen Sie unten auf dem Bildschirm aus, welcher Folienhalter die Folie enthält.
   12. Um die Rohre zu laden, klicken Sie auf die Schaltfläche Entladen mit dem Abwärtspfeil.
   13. Ziehen Sie das Fach heraus und entfernen Sie den Rohrblock.
       HINWEIS: Der für dieses Experiment verwendete Röhrchenblock ist für 500 μL PCR-Röhren.
   14. Stecken Sie die Röhrchenkappen von 500 μL PCR-Röhrchen in den Halter und falten Sie das Röhrchen darunter.
   15. Bringen Sie den Block in das Fach zurück und schieben Sie das Fach zurück in den Mikroskoptisch.
   16. Wählen Sie im Popup-Fenster des Change Collector Device die Option PCR-Röhren aus und klicken Sie auf OK.
   17. Klicken Sie auf die leere Röhrenposition unten links auf dem Bildschirm unter den Röhrenkappen des Kollektorgeräts.
   18. Wählen Sie im Bedienfeld des Mikroskops TL-BF für die Hellfeldbeleuchtung des Durchlichts aus.
4. Schneiden
   HINWEIS: Dieses Protokoll ist spezifisch für das in der Materialtabelle aufgeführte Instrument.
   1. Stellen Sie mit dem 2,5-fachen Objektiv den Fokus ein, bis die Würmer und die Struktur der Membran sichtbar sind.
   2. Wechseln Sie zum 20-fachen Objektiv.
   3. Verschieben der Bühne in einen Bereich ohne Würmer Stellen Sie den Fokus so ein, dass die blasenartigen Strukturen in der Membran eine gelbliche Farbe haben (Abbildung 3A,B), um den Laser auf die richtige Fokusebene zu fokussieren.
   4. Stellen Sie die Laserparameter ein; Für Heckspitzen beginnen Sie mit Power 45, Aperture 30 und Speed 20.
   5. Wählen Sie im Bedienfeld "Lasersteuerung" die Option "Kalibrieren". Folgen Sie den Anweisungen.
      HINWEIS: Das Instrument führt diesen Schritt automatisch aus. Dadurch wird sichergestellt, dass eine mit der Maus auf dem Bildschirm gezeichnete Form mit der vom Laser ausgeschnittenen Form identisch ist.
   6. Klicken Sie unten auf dem Bildschirm an den Röhrenkappen des Kollektorgeräts auf Position A.
   7. Wählen Sie auf der rechten Seite des Bildschirms eine einzelne Form | Zeichnen + Schneiden. Wählen Sie auf der linken Seite des Bildschirms PtoP aus.
   8. Zeichnen Sie eine Linie.
   9. Klicken Sie auf Start Cut , damit der Laser die Membran durchschneidet.
      HINWEIS: Es kann auch eine Linie in das Glas ätzen.
   10. Wenn dieser Testschnitt gut aussieht (die Membran ist geschnitten, die Schnittkanten sehen glatt aus), fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Andernfalls passen Sie den Fokus an und schneiden Sie eine andere Linie aus.
   11. Finde einen Wurm. Wechseln Sie zu Move + Cut und verwenden Sie die Maus, um den Schwanz zu durchschneiden.
       HINWEIS: Wenn der Laser den Schwanz nicht durchschneidet, passen Sie den Fokus an und erhöhen Sie die Laserleistung. Für dickeres Gewebe muss die Laserleistung möglicherweise auf 60 eingestellt werden.
   12. Speichern Sie die Parameter: Registerkarte Datei | Anwendungskonfiguration speichern; für den späteren Abruf die Anwendungskonfiguration wiederherstellen.
   13. Um die Probe zu erfassen, wechseln Sie mit der Funktion "PtoP" zur Einstellung "Zeichnen + Schneiden" und zeichnen Sie eine Form, um den Schnitt eines Membranabschnitts abzuschließen (Abbildung 3C).
       HINWEIS: Größere Membranabschnitte und Abschnitte, die wie Rechtecke oder Dreiecke anstelle von Kreisen oder Ovalen geformt sind, sind in der Kollektorrohrkappe leichter zu finden.
   14. Wählen Sie die nächste Röhre unter Collector Device Tube Cap am unteren Bildschirmrand aus und schneiden Sie die nächste Heckspitze ab.
   15. Sobald vier Schwänze geschnitten sind, entladen Sie das Rohrgestell (klicken Sie auf Entladen mit Pfeil nach unten) und suchen Sie die Membranabschnitte unter einem Seziermikroskop (Abbildung 3D).
       HINWEIS: Die Abschnitte können sich in der Mitte der Rohrkappe befinden oder an der Seite der Kappe haften.
   16. Fahren Sie mit der nachgelagerten Anwendung fort. Für CEL-Seq2 pipettieren Sie 1,2 μL eines CEL-Seq2-Primer-Mastermixes (aus Schritt 3.1) direkt auf die Probe.
   17. Schließen Sie das Röhrchen, beschriften Sie es mit der Primernummer und legen Sie die Tubenkappe sofort direkt auf ein Stück Trockeneis, um die Probe schockgefrieren zu lassen und den RNA-Abbau zu verhindern.
   18. Laden Sie weitere Röhrchen, bringen Sie den Röhrenblock auf die Bühne zurück und schneiden Sie weitere Proben. Fügen Sie jeder Heckspitze eine andere CEL-Seq2-Primermischung hinzu.
   19. Lagern Sie alle Rohre bei -70 °C.

4. Single-Tail-RNA-Sequenzierung mit CEL-Seq2

HINWEIS: Ausführliche Informationen zum CEL-Seq2-Protokoll finden Sie unter Yanai und Hashimshony¹⁸.

1. Reinigen Sie den Labortisch mit RNase-Dekontaminationslösung, um den RNA-Abbau zu verhindern.
2. Bereiten Sie Master-Mixe vor und bewahren Sie sie auf Eis auf.
   1. Bereiten Sie den Reverse-Transkriptions-Mastermix vor: 0,4 μL Puffer des ersten Strangs, 0,1 μL 0,1 M DTT, 0,1 μL RNase-Inhibitor und 0,1 μL Reverse-Transkriptase pro Probe.
   2. Es wird die Mastermischung der zweiten Strangreaktion hergestellt: 7 μL Wasser, 2,31 μL zweiter Strangpuffer, 0,23 μL dNTP, 0,08 μL E. coli-Ligase, 0,3 μL E. coli-DNA-Polymerase, 0,08 μL RNaseH pro Probe.
3. Aufbrechen von Zellen und Glühen mit Primern (siehe Zusatztabelle S1 für die vollständige Liste der Primer):
   1. Programmieren Sie den Thermocycler und seinen Deckel auf 65 °C.
   2. Entnehmen Sie die Proben bei -70 °C und inkubieren Sie sie im Thermocycler für 2,5 min.
   3. Drehen Sie mit 21.000 × g für 30-40 s.
   4. 2,5 min bei 65 °C inkubieren.
   5. Bewegen Sie sie sofort auf Eis.
   6. Drehen Sie sich bei 21.000 × g für 30-40 s und bringen Sie sie auf Eis zurück.
4. Umwandlung von RNA in cDNA:
   1. Geben Sie 0,8 μL der umgekehrten Transkriptionsmischung zu jeder Schwanzspitze.
   2. Bei 42 °C für 1 h inkubieren.
   3. Hitzeinaktivierung bei 70 °C Für 10 min.
   4. Bewegen Sie es sofort auf Eis.
   5. Fügen Sie 10 μL der zweiten Strangmischung zu jeder Schwanzspitze hinzu.
   6. Streichen Sie durch die Beispiele.
   7. Drehen Sie bei 21.000 × g für 30-40 s.
   8. 2 h bei 16 °C inkubieren.
5. cDNA-Bereinigung:
   1. Erwärmen Sie die DNA-Reinigungsperlen auf Raumtemperatur.
   2. Sammeln Sie bis zu 40 Proben in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen (bis zu 480 μL).
   3. Mischen Sie die Perlen, bis sie gut verteilt sind, und fügen Sie 20 μL Perlen und 100 μL Perlenbindungspuffer für jeweils 100 μL der gepoolten Probe hinzu (für 480 μL Probe 480 μL Perlenpuffer und 96 μL Perlen zu einem Endvolumen von bis zu 1.056 μL hinzufügen). Durch Pipettieren gut mischen.
   4. Bei Raumtemperatur 15 min inkubieren.
   5. Mindestens 5 Minuten auf einen Magnetständer stellen, bis die Flüssigkeit klar erscheint.
   6. Entfernen und verwerfen Sie alle bis auf 20 μL des Überstandes.
   7. 200 μL frisch zubereitetes 80% Ethanol hinzufügen.
   8. Inkubieren Sie für mindestens 30 s, entfernen Sie den Überstand, indem Sie ihn abpipettieren, ohne die Perlen zu stören. Verwerfen Sie den Überstand.
   9. Wiederholen Sie die Schritte 4.5.7 und 4.5.8 einmal.
   10. Trocknen Sie die Perlen für 15 Minuten an der Luft oder bis sie vollständig trocken sind.
   11. Resuspendieren Sie die Perlen (~ 6,4 μL) mit 6,4 μL Wasser. Mischen Sie gründlich, indem Sie die gesamte Lautstärke zehnmal nach oben und unten pipettieren.
   12. Bei Raumtemperatur 2 min inkubieren.
   13. Gehen Sie direkt zur In-vitro-Transkription (IVT).
6. In-vitro-Transkription und - Fragmentierung:
   1. Zu dem Röhrchen, das 6,4 μL Probe und die Kügelchen enthält, wird die folgende Mischung (insgesamt 9,6 μL) zugegeben: 1,6 μL 10x T7-Puffer, 1,6 μL ATP, 1,6 μL UTP, 1,6 μL CTP und 1,6 μL GTP (jedes dNTP bei 75 mM-Konzentration) 1,6 μL T7-Enzym.
   2. Inkubieren Sie für 13 h bei 37 °C mit einem 4 °C Halt.
   3. Fügen Sie 6 μL Exonuklease-Lösung hinzu (das Endvolumen sollte 22 μL betragen).
   4. 15 min bei 37 °C inkubieren.
   5. Legen Sie das Röhrchen wieder auf Eis und fügen Sie 5,5 μL Fragmentierungspuffer (0,25 × Reaktionsvolumen) hinzu.
   6. 3 min bei 94 °C inkubieren.
   7. Bewegen Sie die Röhre sofort auf Eis und fügen Sie 2,75 μL Fragmentierungsstopppuffer hinzu (0,5 × Volumen des Fragmentierungspuffers hinzugefügt).
   8. Entfernen Sie die Perlen, indem Sie das Rohr mindestens 5 Minuten lang auf den Magnetständer legen, bis die Flüssigkeit klar erscheint.
   9. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre.
7. Amplifizierte RNA (aRNA) Bereinigung:
   1. Erwärmen Sie die RNA-Reinigungsperlen auf Raumtemperatur.
   2. Mischen Sie die Perlen, bis sie gut verteilt sind.
   3. Pipette 55 μL Kügelchen (1,8 × Reaktionsvolumen).
   4. Inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 10 min.
   5. Legen Sie das Rohr mindestens 5 Minuten lang auf den Magnetständer, bis die Flüssigkeit klar erscheint.
   6. Entfernen und verwerfen Sie 80 μL des Überstandes.
   7. 200 μL frisch zubereitetes 70% Ethanol hinzufügen.
   8. Mindestens 30 s inkubieren, den Überstand durch Pipettieren entfernen, ohne die Perlen zu stören. Verwerfen Sie den Überstand.
   9. Wiederholen Sie die Ethanolwäsche noch zwei weitere Male.
   10. Trocknen Sie die Perlen für 15 Minuten an der Luft oder bis sie vollständig trocken sind.
   11. Suspendieren Sie die Perlen mit 7 μL Wasser. Pippen Sie die gesamte Lautstärke 10 Mal auf und ab, um sie gründlich zu mischen.
   12. Bei Raumtemperatur 2 min inkubieren.
   13. Legen Sie das Rohr mit den Perlen für 5 Minuten auf den Magnetständer, bis die Flüssigkeit klar erscheint.
   14. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre.
       HINWEIS: Haltepunkt: Proben können bei -70 °C aufbewahrt werden.
8. Optional: Überprüfen Sie die aRNA-Menge und -Qualität mit einem automatisierten Elektrophoresesystem gemäß dem Protokoll des Herstellers.
9. Bibliotheksvorbereitung:
   1. Zu 5 μL RNA fügen Sie 1 μL 100 μM zufälligen Hexamer RT-Primer (siehe Materialtabelle) und 0,5 μL 10 mM dNTP hinzu.
   2. 5 min bei 65 °C inkubieren.
   3. Fügen Sie 4 μL der folgenden Mischung bei Raumtemperatur hinzu: 2 μL First Strand Puffer, 1 μL 0,1 M DDT, 0,5 μL RNase-Inhibitor, 0,5 μL Reverse Transkriptase.
   4. Bei 25 °C 10 min inkubieren.
   5. Inkubieren bei 42 °C für 1 h (in einem Hybridisierungsofen oder einem vorgeheizten Thermocycler mit einem auf 50 °C eingestellten Deckel).
   6. Bei 70 °C 10 min inkubieren.
   7. Übertragen Sie 5 μL auf ein neues Röhrchen (halten Sie den Rest der Reaktion bei -20 ° C). Fügen Sie 5,5 μL Reinstwasser, 1 μL RNA PCR Primer (RP1), 1 μL indizierten RNA PCR Primer (RPIX) und 12,5 μL PCR-Mix hinzu.
   8. Verwenden Sie das folgende Programm auf dem Thermocycler: 30 s bei 98 °C, 11 Zyklen von: (10 s bei 98 °C, 30 s bei 60 °C, 30 s bei 72 °C), 10 min bei 72 °C, halten bei 4 °C.
      HINWEIS: Haltepunkt: Proben können bei -20 °C aufbewahrt werden.
10. Bibliotheksbereinigung:
    1. Erwärmen Sie die DNA-Reinigungsperlen auf Raumtemperatur.
    2. Mischen Sie die Perlen, bis sie gut verteilt sind.
    3. Geben Sie 25 μL der Perlen zur PCR-Reaktion. Durch Pipettieren gut mischen.
    4. Bei Raumtemperatur 15 min inkubieren.
    5. Legen Sie das Rohr mindestens 5 Minuten lang auf den Magnetständer, bis die Flüssigkeit klar erscheint.
    6. Entfernen und verwerfen Sie 45 μL des Überstandes.
    7. 200 μL frisch zubereitetes 80% Ethanol hinzufügen.
    8. Inkubieren Sie für mindestens 30 s, entfernen und entsorgen Sie den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
    9. Wiederholen Sie die Ethanolwäsche einmal.
    10. Lufttrockene Perlen für 15 min oder bis sie vollständig trocken sind.
    11. Resuspendieren Sie mit 25 μL Wasser. Durch Pipettieren gut mischen.
    12. Bei Raumtemperatur 2 min inkubieren.
    13. Legen Sie das Rohr für 5 Minuten auf den Magnetständer, bis die Flüssigkeit klar erscheint.
    14. Übertragen Sie 25 μL Überstand auf eine neue Röhre.
    15. Wiederholen Sie die Schritte 4.10.2-4.10.10 einmal.
    16. Resuspendieren Sie mit 10,5 μL Wasser. Durch Pipettieren gut mischen.
    17. Bei Raumtemperatur 2 min inkubieren.
    18. Legen Sie das Rohr für 5 Minuten auf den Magnetständer, bis die Flüssigkeit klar erscheint.
    19. 10 μL des Überstands auf ein neues Röhrchen übertragen und bei -20 °C lagern.
11. Bewerten Sie die Qualität und Quantität der Bibliothek entsprechend den Anforderungen der Sequenzierungseinrichtung.

Ergebnisse

Nach der Laser-Capture-Mikrodissektion einzelne Schwanzspitzen von Männchen und Hermaphroditen an 4 Zeitpunkten (L3 22 h nach dem Schlüpfen; L4 24, 26 und 28 h nach dem Schlüpfen) wurden für die RNA-Sequenzierung unter Verwendung des CEL-Seq2-Protokolls hergestellt. CEL-Seq2-Primer enthalten eindeutige Barcodes, mit denen Sequenzlesevorgänge aus einer bestimmten Probe (in diesem Fall einer einzelnen Schwanzspitze) bioinformatisch identifiziert werden können. Sequenzierungsdaten wurden mit dieser Methode für insges...

Diskussion

Kritische Schritte der Methode
Bei korrekter Durchführung erhält die hier beschriebene Methode robuste RNA-Profile mit einer relativ kleinen Anzahl laserdissektierter Proben (70 Schwanzspitzen in diesem Beispiel). Für Proben von sich entwickelnden Tieren ist jedoch eine enge Synchronisation entscheidend, um die Variabilität zwischen den Proben zu reduzieren. Aus diesem Grund empfiehlt das Protokoll die Hatch-Off-Methode für die Wurmsynchronisation. Hier kann der Forscher den Altersunterschied zwi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 µM PEN membrane glass slides RNase free	Leica	11600288	for LMD
500 µL PCR tubes (nuclease-free)	Axygen	732-0675	to cut the tail tips into
Compound microscope with 40x objective and DIC	any		to check age of worms
Desktop humidifier	any
Dissection microscope with transmitted light base	any		for all worm work
glass pasteur pipets	any		handle of worm pick
glass slides and coverslips	any		to check age of worms
LMD6 microdissection system	Leica	multiple	to cut tail tips
LoBind tubes 0.5 mL	Eppendorf	22431005
M9 Buffer			Recipe in WormBook
Methanol 99.8%	Sigma	322415	to fix worms
NGM growth medium	US Biological	N1000	Buffers and salts need to be added: Recipe in WormBook
P10 pipette variablle volume	e.g. Gilson
P1000 pipette variable volume	e.g. Gilson
P2 pipette variable volume	e.g. Gilson
Pipette tips 1,000 µL	any
Pipette tips 1-10 µL filtered	any
platinum iridium wire	Tritech	PT-9010	to make worm pick
sterile and nuclease-free 1 mL centrfuge tubes	any
Tween 20	Sigma	P9416	Add a very small amount to M9 buffer to prevent worms from sticking to the pipet tips
vented 6 mm plastic Petri dishes	any
For CEL-Seq2
4200 TapeStation System with reagents for high-sensitivity RNA and DNA detection	Aligent		automated electrophoresis system
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63880	DNA cleanup beads
Bead binding buffer  20% PEG8000, 2.5 M NaCl
CEL-Seq2 primers (see Table S1)	Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf	6335000020	Thermal cycler with programmable lid and block for 200 µl tubes.
DNA Polymerase I (E. coli)	Invitrogen	18052-025
dNTP mix 10 mM	any
E. coli DNA ligase	Invitrogen	18052-019
Ethanol
ExoSAP-IT For PCR Product Clean-Up	Affymetrix	78200	exonuclease solution
MEGAscript T7 Transcription Kit	Ambion	AM1334	For step 4.6.1
Nuclease-free water	any
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	NEB	M0531	PCR mix step 4.9.7
random hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN	IDT		a primer with 6 nucleotides that are random
RNA Fragmentation buffer	NEB	E6150S
RNA Fragmentation stop buffer	NEB	E6150S
RNA PCR Index Primers (RPI1–RPI48)	Illumina, NEB, or IDT		RPIX in protocol step 4.9.7, sequences available from Illumina
RNAClean XP beads	Beckman Coulter	A63987
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Scientific	7000TS1	or any other similar product
RNaseH (E. coli)	Invitrogen	18021-071
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Invitrogen	10777-019
Second strand buffer	Invitrogen	10812-014
Superscripit II	Invitrogen	18064-014	reverse transcriptase