乳腺活体亚细胞显微镜检查

摘要

本方案描述了一种通过激光扫描共聚焦和多光子显微镜对哺乳期小鼠乳腺进行活体成像的简单技术。

摘要

乳腺构成了研究上皮功能（包括组织重塑、细胞极性和分泌机制）的 卓越 模型。在怀孕期间，腺体从嵌入脂肪垫的原始导管树扩展到高度分枝的肺泡网络，为初乳和乳汁的形成和分泌做好准备。产后，腺体提供新生儿存活所需的所有营养物质，包括膜涂层的脂滴 （LDs）、蛋白质、碳水化合物、离子和水。各种乳成分，包括乳糖、酪蛋白胶束和脱脂牛奶蛋白，在肺泡细胞内合成，并通过顶端表面的胞吐作用从囊泡分泌。LD 从粗面内质网中的合成位点转运到细胞顶端，被细胞膜覆盖，并通过独特的顶泌机制分泌。其他预先形成的成分，包括抗体和激素，通过转胞吞作用从上皮浆膜侧运输到牛奶中。这些过程适合活体显微镜检查，因为乳腺是一个皮肤腺，因此可以直接进行实验操作。在本文中，描述了一种简单的程序来研究活麻醉小鼠原 位、实时地分泌 LD 的动力学。硼 - 二吡咯甲烯 （BODIPY）_665/676 或单丹酰戊烷用于标记转基因小鼠的中性脂质组分，这些小鼠在细胞质中表达可溶性 EGFP （增强的绿色荧光蛋白），或与 EGFP 或 tdTomato 融合的膜靶向肽。膜标记的融合蛋白用作细胞表面的标志物，脂质染料可分辨 0.7 μm ≥ LD。延时图像可以通过标准激光扫描共聚焦显微镜记录，深度可达 15-25 μm，或者通过多光子显微镜记录，以便在组织更深处进行成像。在整个手术过程中，乳腺可能会用药理学试剂或荧光染料沐浴，为根据需要进行急性实验操作提供平台。

引言

小鼠乳腺的活体显微镜检查作为分析一系列生物现象的有力方法而受到越来越多的关注，包括干细胞的起源和分化 ^1,2、转移性肿瘤的进展 ^3,4,5 以及导管巨噬细胞在整个乳腺发育和消退过程中的作用⁶。通过活体亚细胞显微镜 （ISMic）⁷ 的发展，研究已扩展到哺乳期的膜运输和分泌机制 ^8,9，以及催产素介导的肌上皮细胞收缩 ^9,10。已经开发了两种主要方法，利用腺体在皮肤和体壁之间的可及性。

在第一种方法中，将亚克力或玻璃窗插入皮肤并用金属固定环 ^1,3,11。小鼠对手术的耐受性很好，并且可以在几周内间歇性地分析同一只动物的各种现象。这种方法已被证明对于谱系追踪 ^1,12 和原位监测乳腺肿瘤的侵袭和进展特别有用 ^3,11。然而，事实证明，低于全细胞水平的分辨率是困难的，因为腺体仍然附着在体壁上，因此会受到呼吸和心跳引起的运动伪影的影响。

在第二种方法中，腺体通过手术暴露在脉管系统完整的皮瓣上，并用垫片 ^4,9,13 稳定在显微镜载物台上。因此，一部分腺体与腹壁有效分离，运动伪影降至最低。在大多数情况下，暴露的薄壁组织直接放在盖玻片上，小鼠腹侧朝下在倒置显微镜上。在最近的一次修改中，将小鼠仰卧在正置显微镜上，暴露的腺体被保护在用盖玻片² 密封的充满液体的细胞中。后一种配置允许进入实质表面，以便在成像过程中进行实验操作。无论哪种情况，分辨率低至 <1 μm，都允许分析细胞内过程，如乳腺上皮细胞中脂滴 （LD） 的跟踪所示⁹。

本方案详细介绍了一种在亚细胞水平对乳腺上皮细胞进行活体成像的简单方法，以哺乳期间 LD 的生物发生、运输和分泌为例。这种方法广泛适用于许多其他过程，包括牛奶蛋白的运输和分泌¹⁴、蛋白质从上皮浆膜侧到肺泡腔的转胞吞作用^15,16，^以及退化过程中腺体的重塑^17,18。

表达荧光蛋白的小鼠是大多数活体实验的首选，以促进选择合适的成像区域和作为形态学参考标记物。有多种合适的转基因和敲入小鼠可供选择，它们在细胞区室、细胞骨架元件、膜和细胞器中表达荧光蛋白标志物¹⁹。在给出的示例中，使用了 EGFP_细胞 FvB 小鼠，其中增强型绿色荧光蛋白 （EGFP） 靶向大多数细胞²⁰ 中的细胞质（表示为 EGFP_细胞），以及 C57BL/6J 番茄 （mT/mG） 小鼠²¹，它是编码 tdTomato 和 EGFP 基因的双荧光 Cre 系。EGFP 表达是通过 Cre 介导的 tdTomato 基因切除来实现的。在大多数细胞中，任一荧光基团都通过源自 MARCKS 蛋白²¹ 的序列靶向质膜。在这项工作中，表达红色 tdTomato 荧光团的小鼠表示为 tdTomato_membr （mT），表达 EGFP 的小鼠，在切除 tdTomato 基因后表示为 EGFP_membr （mG）。

小鼠在腹侧中线的两侧有五对乳腺，三对在胸部区域（编号 1-3），两对在腹股沟区域（编号 4-5）（图 1A）。对于 ISMic，腹股沟腺是最容易接近和最容易稳定的，因为它们离与胸部呼吸和心跳相关的整体运动最远。

研究方案

所有动物程序均已获得美国国家研究委员会的实验动物护理和使用指南、美国公共卫生服务局关于实验动物人道护理和使用政策、 以及《实验动物护理和使用指南》。在这项工作中，在右侧仰卧位手术准备雌性初产小鼠 （4-5 个月大，哺乳期第 10 天） 的 4 个腺体（图 1A）。

1. 动物准备

1. 在顶部装载天平上称量鼠标，以计算所需的麻醉剂量。
2. 在使用麻醉剂期间和之后，通过将鼠标放在加热垫上来保持体温。
3. 通过在氧饱和呼吸室中短暂暴露于异氟醚 （3.0%-3.5%） 1-2 分钟（参见 材料表） 来麻醉小鼠，然后腹膜内注射 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 甲苯噻嗪的混合物。
4. 在手术和成像期间，通过留置导管（参见步骤 3.4）每 45 分钟左右进一步施用滴定剂量的甲苯噻嗪和氯胺酮（步骤 1.3 中概述的初始剂量的一半到四分之一），将动物保持在深麻醉平面下，根据需要。
   注意:每 10-20 分钟检查一次睑板和脚趾捏反射，最容易维持最佳麻醉平面。清醒小鼠的温度为 36.5-38 °C，麻醉下降至 34.5 °C。
5. 如果有处于相似哺乳阶段的供体小鼠，则交叉寄养幼崽²² ;否则，对猫砂实施安乐死。
   注意:<10 天大的幼崽应通过暴露于 3.0% 异氟醚，然后斩首来实施安乐死。≥10 日龄的幼崽应通过吸入 CO₂ 实施安乐死，然后进行宫颈脱位。

2. 手术程序

1. 在整个手术过程中，将鼠标放在加热垫上保持温暖。使用手持式电动剃须刀剃掉 4 号和 5 号乳腺（仰卧，右侧）周围皮肤的皮毛。用三种交替的 betadine 和酒精磨砂膏清洁剃须区域。
2. 用 70% 酒精擦拭所有手术器械。用镊子捏住皮肤，用锋利的剪刀剪开凸起的皮肤，在靠近第四个的地方做一个 ~1 厘米的中线切口。在腺体周围向颅部和尾部做一个圆形切口，然后小心地将皮肤从腹部剥离。用生理盐水保持裸露的皮肤湿润。
3. 为了尽量减少失血，在切开任何突出的血管之前，用手持式烧灼器密封它们（见 材料表）。应立即用生理盐水去除任何外源性血液，以避免随后的光学分辨率损失。
4. 用细镊子轻轻梳理表层，去除浅表结缔组织和脂肪组织。
5. 用生理盐水保持暴露的腺体湿润，并用凝胶和半透明、柔性的热塑性薄膜保护腹壁（见 材料表）。
   注意:步骤 2.2-2.5 创建一个皮瓣，其中一部分腺体和相关脉管系统与腹壁分离（图 1Bi-iv）。
6. 如果需要，在手术过程中对暴露的腺体进行沐浴，用外源性试剂（例如药物或细胞器特异性染料）处理腺体。
   注:在给出的示例中，EGFP_细胞 或 EGFP_membr （mG） 小鼠中的 LD 用 1.0 mL 硼-二吡咯烯 （BODIPY）_665/676 （10 mM 在二甲基亚砜中的储备溶液在盐水中稀释 1 至 1,000 倍并施用 <1 h）和 tdTomato_membr （mT） 或 EGFP_membr （mG） 小鼠， 加入 0.5 mL 单丹酰戊烷²³ （0.1M 二甲基亚砜储备液，溶于用生理盐水稀释 1 至 1,000 倍，然后应用 5 分钟）。

3. 成像准备

1. 小心地将小鼠腹部朝下放置在加热 （37 °C） 倒置显微镜载物台上，使皮瓣延伸到中央盖玻片 （30 mm） 上（图 1Biv）。用一层薄薄的凝胶保护暴露区域。
2. 使用定制的垫片稳定皮瓣，以缓冲腺体免受呼吸和心跳引起的运动伪影的影响。为此，在皮瓣和体壁之间放置一个由三根胶带棉棒制成的缺口垫片（图 1Ci），并将后腿和尾巴用胶带固定在垫片后面的舞台上（图 1Bv）。
3. 通过在载物台开口的两端牢固地贴上塑料盖（图 1Cii）来防止皮瓣在成像过程中滑动（图 1Bv）。
4. 在背皮下插入留置导管，该导管连接到管子、注射器和泵（见 材料表）。
5. 通过常规荧光显微镜确认皮瓣稳定且血流充足（图 1Bvi）。
6. 用海绵纱布盖住鼠标（见 材料表）以在成像过程中保持温暖，
   注:步骤 3.1-3.5 是确保采集适合定量分析的高分辨率视频的最关键步骤。除非已确认组织稳定性，否则在此阶段之后继续进行是没有意义的。

4. 显微镜

1. 对于用BODIPY_665/676标记的EGFP_细胞或EGFP_membr（mG）小鼠的常规共聚焦显微镜（图2，视频1和视频2），请使用配备预热的60倍油浸物镜的倒置显微镜，保持在37°C（参见材料表）。
   1. 分别使用_{488 和 633} 激光器分别检测 EGFP 和 BODIPY 666/633;对于 EGFP，激发波长为 488 nm，发射波长为 560 nm，使用带通滤光片 BA 505-605;对于 BODIPY_665/676，激发波长为 633 nm，发射波长为 668 nm，使用带通滤光片 BA 655-755。
   2. 每 5 秒或 10 秒以 4 或 8 μs/像素（512 x 512 像素;每像素 12 位）的线扫描方式收集图像，持续 1-2 小时，并存储为 TIFF 文件。通过在整个成像周期中校正 x/y 漂移，手动维护帧内的扫描区域。使用与显微镜相关的软件从 z 扫描构建 3-D 图像（参见 材料表）。
2. 对于用单丹酰戊烷标记的EGFP_membr （mG）小鼠的双光子显微镜（图3，视频3），使用配备有可调谐激光器和37°C预热30倍物镜的倒置显微镜（参见 材料表）。
   1. 在 910 nm 处激发腺体，并使用两个 GaAs 检测器检测单丹酰戊烷和 EGFP，分别使用 410-460 nm 和 495-540 nm 带通滤光片进行蓝色和绿色发射。
   2. 通过 2 μs/像素（320 x 320 像素;每像素 16 位）的线扫描收集图像，并将其存储为 OIR 文件。通过在整个成像周期中校正 x/y 漂移，手动维护帧内的扫描区域。使用与显微镜相关的软件从 z 扫描构建 3-D 图像。
3. 对于用单丹酰戊烷标记的tdTomato_membr （mT）小鼠的双光子显微镜（图4，视频4），请使用带有可调谐激光器的倒置显微镜和37°C预热的63倍物镜（参见 材料表）。
   1. 同时在 800 nm 和 1,060 nm 处激发样品，并使用发射波长为 418-471 nm 的 HyD 杂化检测器检测单丹酰戊烷，使用发射波长为 595-667 nm 的另一个 HyD 杂化检测器检测 TdTomato。
   2. 通过线扫描收集图像，其中四行平均为 200 Hz（512 x 512 像素;每像素 12 位），并将它们存储为 LIF 文件。通过在整个成像周期中校正 x/y 漂移，手动维护帧内的扫描区域。使用与显微镜相关的软件从 z 扫描中构建 3-D 图像。

5. 安乐死

1. 按照机构批准的方案，在成像结束时通过 CO₂ 吸入对小鼠实施安乐死。

6. 创建实时视频

1. 将时间序列转换为 TIFF 文件，然后使用适当的软件转换为视频（请参阅 材料表）。
   注意:特定视频的定量分析超出了本文的范围，需要特定的方法来解决特定问题。例如，参见 Ebrahim 等人 ²⁴ 了解放线肌球蛋白复合物在唾液腺唾液胞吐作用中的作用，参见 Meyer 等人²⁵ 了解肝脏胆汁分泌的动力学，以及 Masedunskas 等人 ⁹ 了解乳腺上皮细胞 LD 分泌的分析。

结果

乳汁由极化的肺泡上皮细胞分泌，这些细胞在怀孕期间从广泛的导管树的芽分化²⁶（图 2A）。牛奶合成的前体被基底/侧膜同化，完成的产物通过顶端表面分泌到中央"牛奶空间"。每个肺泡的基底侧被一个星状的肌上皮细胞阵列覆盖（图 2A），这些细胞在浆膜侧受到基底膜的保护（图 2A 中...

讨论

使用单光子显微镜还是多光子显微镜取决于所提出的问题、要成像的组织的性质和位置以及所需的分辨率。多光子显微镜基于在近红外中产生两个或多个低能光子，与单光子显微镜相比，它可以穿透组织到更深的地方，光毒性更小^29,30。此外，荧光团仅在焦点处被激发，从而减少了来自周围组织的光散射。因此，多光子显微镜?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
488 laser	Melles-Griot	-	CW  laser 50 mW
60x PLAPON oil immersion objective (NA 1.42)	Olympus	1-U2B933	Lens Confocal microscope
633 laser	Melles-Griot	-	CW He-Ne laser 12 mW
63x objective (NA 1.40, HC PL APO CS2)	Leica	11506350	Lens Two-photon microscope
BA 410-460 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 495-540 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 505-605 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 655-755 nm	Chroma	-	Band-pass filter
Boron-dipyrromethane (BODIPY) 665/676	Thermo Fisher Scientific	B3932	Lipid peroxiation sensor
Carbomer-940	Snowdrift Farm	739601480651	Gel
Catheter	Terumo	SV27EL	Winged infusion sets
Cauterizer	Braintree Scientific, Inc	GEM 5917	Cautery system
CMV-Cre mouse	Jackson lab	006054	Mouse line
Coverslip	Bioptechs	-	30mm diameter coverlip for inverted microscope
Curity 4x4 inch all purpose sponge gauze	Covidien	9024	Sponge
EGFPcyto mouse	Jackson lab	003291	Mouse line
Fiji/ImageJ software	Open source	-	Free software tool
Fine forceps	Braintree Scientific, Inc	FC003 8	Tissue forceps
Fluoview 1000 microscope	Olympus	FV1000	Confocal microscope
FluoView software	Olympus	-	Confocal microscope and Two-photon microscope
Hand-held electric razor	Braintree Scientific, Inc	CLP-8786-451A	Cordless clipper
Heat pad	Braintree Scientific, Inc	DPIP	Heat pad for animals
HyD detectors	Leica	-	Leica 4Tune spectral detector
Imaris software	Bitplane / Oxford instruments	-	Commercial software tool
Ingisht X3 tunable laser	Spectra Physics	Insight X3	Tunable Pulse-Laser
Isoflurane	VetOne	13985-046-40	Anesthetic
Ketamine	VetOne	13985-702-10	Anesthetic
LAS X Software	Leica	-	Two-photon microscope software tool
Mai-Tai tunable laser	Spectra Physics	Mai-Tai	Laser
MetaMorph	Molecular Devices	-	Commercial software tool
Monodansylpentane AUTODOT	Abcepta	Sm1000a	Lipid droplet dye
MPE-RS microscope	Olympus	IX70	Two-photon microscope
mT/mG mouse	Jackson lab	007676	Mouse line
Objective heater	Bioptechs	150819	Objective heater for both confocal and two-photon microscopes
Oxygen-saturated respiration chamber	Patterson Scientific	78933385, SAS3 and EVAC4	Gas Anesthesia and evacuation system
Parafilm	Heathrow Scientific	HS234526B	Semi-transparent, flexible, thermoplastic film
PMT detector	Olympus	-	Descanned   detectors
PMT detector	LSM-Technology	Custom built	Non-Descanned Detectors
Pump	Harvard Apparatus	703602, 704402	Nanomite injector and controller
Saline	Quality Biological	114-055-721EA	Normal saline
Sharp blunt-ended scissors	Braintree Scientific, Inc	SCT-S 508	Surgical scissors
Syringe	Covidien	22-257-150	1mL tuberculin syringe
TCS SP8 Dive Spectral microscope	Leica	SP8	Two-photon microscope
Tweezers	Braintree Scientific, Inc	FC032	Tissue forceps
Xylazine	VetOne	13985-704-10	Anesthetic