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要約

本プロトコルは、授乳中のマウス乳腺の生体内イメージングのための容易な技術を、レーザー走査型共焦点顕微鏡および多光子顕微鏡法によるものとして記述している。

要約

乳腺は、組織のリモデリング、細胞極性、分泌メカニズムなどの上皮機能を調査するための 卓越した モデルを構成しています。妊娠中、腺は脂肪パッドに埋め込まれた原始的な乳管樹から、初乳と牛乳の形成と分泌のために準備された高度に分岐した肺胞ネットワークに拡張します。産後、腺は、膜被覆脂肪滴(LD)、タンパク質、炭水化物、イオン、水など、新生児の生存に必要なすべての栄養素を供給します。乳糖、カゼインミセル、脱脂乳タンパク質など、さまざまな乳成分が肺胞細胞内で合成され、頂端表面のエキソサイトーシスによって小胞から分泌されます。LDは、粗面小胞体の合成部位から細胞頂点に輸送され、細胞膜でコーティングされ、独自のアポクリンメカニズムによって分泌されます。抗体やホルモンなどの他の事前に形成された成分は、トランスサイトーシスによって上皮の漿膜側から牛乳に輸送されます。これらのプロセスは、乳腺が皮膚腺であり、したがって実験的操作に直接アクセスできるため、生体内顕微鏡検査に適しています。この論文では、麻酔をかけた生きたマウスにおけるLD分泌のin situの動態をリアルタイムで調査するための簡単な手順について説明します。ホウ素-ジピロメテン(BODIPY)665/676またはモノダンシルペンタンは、トランスジェニックマウスの中性脂質画分を標識するために使用され、トランスジェニックマウスは細胞質内で可溶性EGFP(増強緑色蛍光タンパク質)を発現するか、またはEGFPまたはtdTomatoのいずれかに融合した膜標的ペプチドを発現します。膜タグ付き融合タンパク質は細胞表面のマーカーとして機能し、脂質色素はLDを0.7μm≥分離します。タイムラプス画像は、標準的なレーザー走査型共焦点顕微鏡で15〜25μmの深さまで記録するか、多光子顕微鏡で組織の深部をイメージングして記録することができます。乳腺は、手術中に薬理学的薬剤または蛍光色素を浴びることがあり、必要に応じて急性の実験的操作のためのプラットフォームを提供します。

概要

マウス乳腺の生体内顕微鏡検査は、幹細胞の起源と分化1,2、転移性腫瘍の進行3,4,5、乳腺の発達と退縮6における乳管マクロファージの役割など、あらゆる生命現象を解析する強力な方法として注目されています。Intravital Subcellular Microscopy(ISMic)7の開発を通じて、授乳中の膜輸送と分泌メカニズム8,9、およびオキシトシンを介した筋上皮細胞の収縮9,10にまで研究が拡大されました。皮膚と体壁の間の腺のアクセシビリティを利用する2つの主要な方法が開発されました。

第1のアプローチでは、アクリルまたはガラス窓が皮膚に挿入され、金属製の保持リング1,3,11で固定される。マウスは手術によく耐え、同じ動物で数週間にわたってさまざまな現象を断続的に分析できます。この方法は、系統追跡1,12および乳腺腫瘍のin situ上皮内浸潤および進行のモニタリングに特に有用であることが証明されています3,11。しかし、全細胞レベルより低い解像度は、腺がまだ体壁に付着しているため、呼吸や心拍によって引き起こされる運動アーチファクトの影響を受けやすいため、困難であることが証明されています。

第2のアプローチでは、腺は無傷の血管系を有する皮膚フラップ上に外科的に露出し、スペーサー4,9,13を用いて顕微鏡ステージ上で安定化される。したがって、腺の一部が腹壁から効果的に分離され、運動アーチファクトが最小限に抑えられます。ほとんどの場合、露出した実質は、倒立顕微鏡でマウスの腹側を下にしてカバーガラスに直接配置されます。最近の修正では、マウスを直立顕微鏡上に仰臥位に置き、露出した腺をカバースリップ2で密封した液体で満たされたセルで保護した。この後者の構成により、イメージング中の実験的操作のために実質表面にアクセスできます。いずれの場合も、<1μmまでの分解能により、乳腺上皮細胞の脂肪滴(LD)の追跡に例示されるように、細胞内プロセスの分析が可能になります9。

本プロトコールは、授乳中のLDの生合成、輸送、および分泌を例に、細胞内レベルでの乳腺上皮細胞の生体内イメージングのための容易な方法を詳述しています。このアプローチは、乳タンパク質の輸送と分泌14、上皮の漿膜側から肺胞内腔へのタンパク質のトランスサイトーシス15,16、退縮中の腺のリモデリング17,18など、他の多くのプロセスに広く適用できます。

蛍光タンパク質を発現するマウスは、イメージングのための適切な領域の選択を容易にするため、また形態学的参照マーカーとして、ほとんどの生体内実験に好まれます。細胞コンパートメント、細胞骨格要素、膜、およびオルガネラ19に蛍光タンパク質マーカーを発現する、適切なトランスジェニックマウスおよびノックインマウスの広範囲が利用可能である。与えられた例では、ほとんどの細胞20(EGFP細胞と表記)において、増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)が細胞質を標的とするEGFP細胞FvBマウスと、tdTomato遺伝子とEGFP遺伝子をコードする二重蛍光Cre系統であるC57BL/6Jトマト(mT/mG)マウス21を用いた。EGFPの発現は、tdTomato遺伝子のCre媒介切除によって可能になります。どちらの蛍光色素も、MARCKSタンパク質に由来するシークオンを介して、ほとんどの細胞で原形質膜を標的としています21。本研究では、赤色のtdTomatoフルオロフォアを発現するマウスをtdTomatomembr(mT)と、EGFPを発現するマウスを、tdTomato遺伝子の切除後にEGFPを発現するマウスをEGFPmembr(mG)と表記する。

マウスは、腹側正中線の両側に5対の乳腺を持ち、胸部に3つ(1-3の番号)、鼠径部に2つ(4-5の番号)を持っています(図1A)。ISMicの場合、鼠径腺は、胸部の呼吸と心拍に関連する全体的な動きから最も離れているため、最もアクセスしやすく、安定するのが最も簡単です。

プロトコル

すべての動物の手順は、米国国立研究評議会の実験動物の世話と使用に関するガイド、実験動物の人道的ケアと使用に関する米国公衆衛生局の方針に準拠して、国立がん研究所、国立衛生研究所の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。 実験動物の世話と使用のためのガイド。この研究では、雌の初産マウス(生後4〜5ヶ月、授乳10日目)の4番目の腺を右仰臥位で外科的に準備しました(図1A)。

1.動物の調理

  1. トップローディング天びんの上でマウスの体重を量り、必要な麻酔薬の量を計算します。
  2. 麻酔薬を塗布中および適用した後は、マウスをウォーミングパッドに置いて体温を維持します。
  3. 酸素飽和呼吸室( 材料の表を参照) でイソフルラン(3.0%-3.5%)に1〜2分間短時間さらし、続いて100 mg / kgのケタミンと10 mg / kgのキシラジンの混合物の腹腔内注射により、マウスを麻酔します。.
  4. 必要に応じて、必要に応じて45分ごとに留置カテーテル(ステップ3.4を参照)を介してキシラジンとケタミンの滴定用量(ステップ1.3で概説した初期用量の半分から4分の1)をさらに適用することにより、手術とイメージングの両方で動物を深い麻酔面下に維持します。.
    注:最適な麻酔面は、10〜20分ごとに眼瞼とつま先のつま先挟み反射をチェックすることによって最も簡単に維持されます。意識のあるマウスの温度は36.5〜38°Cで、麻酔下では34.5°Cに下がります。
  5. 授乳の同様の段階にあるドナーマウスが利用可能な場合、子犬22 をクロスフォスターします。それ以外の場合は、ゴミを安楽死させます。
    注:生後<10日の子犬は、3.0%イソフルランへの曝露とそれに続く斬首によって安楽死させる必要があります。生後≥10日の子犬は、CO2 吸入とそれに続く頸部脱臼によって安楽死させる必要があります。

2. 手術の手順

  1. 手術中は、ウォーミングパッドでマウスを温めてください。ハンドヘルド電気カミソリを使用して、4番と5番の乳腺(仰臥位、右側)の周囲の皮膚から毛皮を剃ります。3つの交互のベタジンとアルコールスクラブで剃った部分をきれいにします。
  2. すべての手術器具を70%アルコールで拭きます。ピンセットで皮膚をつまみ、隆起した皮膚を鋭利なハサミで切開して、第4乳首の近くに~1cmの正中線切開を行います。頭蓋方向と尾側の両方の方向に腺の周りに円形の切開を行い、腹部から皮膚を慎重に剥がします。露出した肌を生理食塩水で潤いに保ちます。
  3. 失血を最小限に抑えるために、目立つ血管を手持ちの焼灼器( 材料の表を参照)で密封してから切断します。外因性の血液は、その後の光学分解能の損失を避けるために、生理食塩水で迅速に除去する必要があります。
  4. 細かい鉗子で表層を優しくからかうことにより、表在性の結合組織と脂肪組織を取り除きます。
  5. 露出した腺を生理食塩水で湿らせ、腹壁をゲルと半透明で柔軟な熱可塑性フィルムで保護します( 材料の表を参照)。
    注:ステップ2.2-2.5は、腺と関連する血管系の一部が腹壁から分離された皮膚のフラップを作成します(図1Bi-iv)。
  6. 必要に応じて、外因性薬剤、例えば、薬理学的薬剤またはオルガネラ特異的色素で腺を治療し、手術中に露出した腺を入浴させます。
    注:示された例では、EGFP細胞 またはEGFPmembr (mG)マウスのいずれかのLDを1.0 mLのホウ素-ジピロメテン(BODIPY)665/676 (生理食塩水で1〜1,000倍に希釈したジメチルスルホキシド中の10 mMストック溶液)で標識し、<1時間)およびtdTomatomembr (mT)またはEGFPmembr (mG)マウスに適用しました。 0.5 mLのモノダンシルペンタン23 (ジメチルスルホキシド中の0.1 Mストック溶液を生理食塩水で1〜1,000倍に希釈し、5分間適用)を加えます。

3. イメージングの準備

  1. 腹部を下にしてマウスを加熱(37°C)倒立顕微鏡ステージに慎重に置き、皮膚フラップが中央のカバーガラス(30 mm)に伸びるようにします(図1Biv)。露出した領域をゲルの薄い層で保護します。
  2. カスタムメイドのスペーサーで皮膚のフラップを安定させ、呼吸や心拍によって引き起こされる運動アーチファクトから腺をクッションします。これを実現するには、3本のテープで留めた綿棒(図1Ci)で作られたノッチ付きスペーサーをスキンフラップとボディウォールの間に置き、後脚とテールをスペーサーの後ろのステージにテープで固定します(図1Bv)。
  3. イメージング中に皮膚フラップが滑らないようにするには、ステージ開口部(図1Bv)の両端にプラスチックカバー(図1Cii)をしっかりとテープで留めます。
  4. チューブ、シリンジ、ポンプに取り付けられた背側皮の下に皮下留置カテーテルを挿入します( 材料の表を参照)。
  5. 従来の蛍光顕微鏡法により、皮膚弁が十分な血流で安定していることを確認します(図1Bvi)。
  6. マウスをスポンジガーゼ( 材料の表を参照)で覆い、イメージング中に暖かく保ちます。
    注:ステップ3.1〜3.5は、定量分析に適した高解像度ビデオを確実に取得するために最も重要です。この段階を超えて進める意味は、組織の安定性が確認されていない限り意味がありません。

4. 顕微鏡検査

  1. BODIPY665/676で標識したEGFP細胞またはEGFPmembr(mG)マウスの従来の共焦点顕微鏡(図2、ビデオ1、およびビデオ2)では、予熱した60倍油浸対物レンズを装備した倒立顕微鏡を使用し、37°Cに維持します(材料の表を参照)。
    1. EGFPとBODIPY665/676 をそれぞれ488レーザーと633レーザーを使用して別々に検出します。EGFPの場合、励起488 nm、発光560 nm、バンドパスフィルターBA 505-605付き。BODIPY665/676、励起633 nm、発光668 nm、バンドパスフィルターBA 655-755付き。
    2. 5秒または10秒ごとに4または8μs/ピクセル(512 x 512ピクセル、12ビット/ピクセル)のラインスキャンで画像を1〜2時間収集し、TIFFファイルとして保存します。スキャンした領域をフレーム内で手動で維持し、イメージングサイクル全体でx/yのドリフトを補正します。顕微鏡に関連付けられたソフトウェアを使用して、z-スキャンから3D画像を作成します( 材料の表を参照)。
  2. モノダンシルペンタンで標識したEGFPmembr (mG)マウスの2光子顕微鏡(図3、ビデオ3)では、チューナブルレーザーと37°Cに予熱した30倍対物レンズを装備した倒立顕微鏡を使用します( 材料の表を参照)。
    1. 910 nmでグランドを励起し、410-460 nmと495-540 nmのバンドパスフィルターを使用して、それぞれ青色と緑色の発光にモノダンシルペンタンとEGFPを2つのGaAs検出器で検出します。
    2. 2 μs/ピクセル(320 x 320ピクセル、16ビット/ピクセル)のラインスキャンで画像を収集し、OIRファイルとして保存します。スキャンした領域をフレーム内で手動で維持し、イメージングサイクル全体でx/yドリフトを補正します。顕微鏡に関連付けられたソフトウェアを使用して、z-スキャンから3D画像を構築します。
  3. モノダンシルペンタンで標識したtdTomatomembr (mT)マウスの2光子顕微鏡(図4、ビデオ4)では、波長可変レーザーを備えた倒立顕微鏡と、37°Cに予熱した63倍対物レンズを使用します( 材料の表を参照)。
    1. 800 nmと1,060 nmで試料を同時に励起し、蛍光418-471 nmに設定されたHyDハイブリッド検出器でモノダンシルペンタンを検出し、蛍光595-667 nmに設定された別のHyDハイブリッド検出器でTdTomatoを検出します。
    2. 200 Hz(512 x 512ピクセル、12ビット/ピクセル)で平均する4本のラインでラインスキャンして画像を収集し、LIFファイルとして保存します。スキャンした領域をフレーム内で手動で維持し、イメージングサイクル全体でx/yドリフトを補正します。顕微鏡に関連付けられたソフトウェアを使用して、zスキャンから3D画像を構築します。

5.安楽死

  1. 施設で承認されたプロトコルに従って、CO2 吸入によるイメージングの最後にマウスを安楽死させます。

6. リアルタイム動画の作成

  1. 時系列をTIFFファイルに変換し、適切なソフトウェアを使用してビデオに変換します( 資料の表を参照)。
    注:特定のビデオの定量分析は、このホワイトペーパーの範囲を超えており、特定の問題を解決するための特定の方法が必要になります。例えば、唾液腺からの唾液のエキソサイトーシスにおけるアクチノミオシン複合体の役割についてはEbrahim et al.24 を、肝臓からの胆汁分泌の動態についてはMeyer et al.25 を、乳腺上皮細胞からのLD分泌の解析についてはMasedunskas et al.9 を参照してください。

結果

ミルクは、分極した肺胞上皮細胞から分泌され、妊娠中に広範な管状樹26の芽から分化します26(図2A)。牛乳合成の前駆体は基底/側膜を横切って同化され、完成した製品は頂端表面を横切って中央の「牛乳空間」に分泌されます。各肺胞の基底側は、筋上皮細胞の星状配列(図2A)で覆われており、漿膜側は?...

ディスカッション

一光子顕微鏡と多光子顕微鏡のどちらを使用するかは、問われる問題、イメージングする組織の性質と位置、必要な解像度によって異なります。多光子顕微鏡は、近赤外に2つ以上の低エネルギー光子を生成することに基づいており、1光子顕微鏡29,30よりも少ない光毒性で組織をより深く浸透させることができる。さらに、...

開示事項

著者の誰も宣言する相反する利益を持っていません。

謝辞

著者らは、動物の管理と世話をしてくれたSherry Rausch氏とSamri Gebre氏(NIH国立がん研究所)に感謝し、さまざまなプラスチックスペーサーの製造を支援してくれたJames Mather氏に感謝しています。この研究は、NIHの学内研究プログラムによって[部分的に]支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
488 laserMelles-Griot-CW  laser 50 mW
60x PLAPON oil immersion objective (NA 1.42)Olympus1-U2B933Lens Confocal microscope
633 laserMelles-Griot-CW He-Ne laser 12 mW
63x objective (NA 1.40, HC PL APO CS2)Leica11506350Lens Two-photon microscope
BA 410-460 nmChroma-Band-pass filter
BA 495-540 nmChroma-Band-pass filter
BA 505-605 nmChroma-Band-pass filter
BA 655-755 nmChroma-Band-pass filter
Boron-dipyrromethane (BODIPY) 665/676Thermo Fisher ScientificB3932Lipid peroxiation sensor
Carbomer-940Snowdrift Farm739601480651Gel
CatheterTerumoSV27ELWinged infusion sets 
Cauterizer Braintree Scientific, IncGEM 5917Cautery system
CMV-Cre mouse Jackson lab006054Mouse line
CoverslipBioptechs-30mm diameter coverlip for inverted microscope
Curity 4x4 inch all purpose sponge gauzeCovidien9024Sponge
EGFPcyto mouseJackson lab003291Mouse line
Fiji/ImageJ softwareOpen source-Free software tool
Fine forcepsBraintree Scientific, IncFC003 8Tissue forceps
Fluoview 1000 microscopeOlympusFV1000Confocal microscope
FluoView softwareOlympus-Confocal microscope and Two-photon microscope
Hand-held electric razorBraintree Scientific, IncCLP-8786-451ACordless clipper
Heat padBraintree Scientific, IncDPIPHeat pad for animals
HyD detectorsLeica-Leica 4Tune spectral detector
Imaris softwareBitplane / Oxford instruments-Commercial software tool
Ingisht X3 tunable laserSpectra PhysicsInsight X3Tunable Pulse-Laser
IsofluraneVetOne13985-046-40Anesthetic
Ketamine VetOne13985-702-10Anesthetic
LAS X SoftwareLeica-Two-photon microscope software tool
Mai-Tai tunable laserSpectra PhysicsMai-TaiLaser
MetaMorphMolecular Devices-Commercial software tool
Monodansylpentane AUTODOTAbceptaSm1000aLipid droplet dye
MPE-RS microscopeOlympusIX70Two-photon microscope
mT/mG mouseJackson lab007676Mouse line
Objective heaterBioptechs150819Objective heater for both confocal and two-photon microscopes
Oxygen-saturated respiration chamberPatterson Scientific78933385, SAS3 and EVAC4Gas Anesthesia and evacuation system 
ParafilmHeathrow ScientificHS234526BSemi-transparent, flexible, thermoplastic film
PMT detectorOlympus-Descanned   detectors
PMT detectorLSM-TechnologyCustom builtNon-Descanned Detectors
PumpHarvard Apparatus703602, 704402Nanomite injector and controller
SalineQuality Biological114-055-721EANormal saline
Sharp blunt-ended scissorsBraintree Scientific, IncSCT-S 508Surgical scissors
SyringeCovidien22-257-1501mL tuberculin syringe
TCS SP8 Dive Spectral microscopeLeicaSP8Two-photon microscope
Tweezers Braintree Scientific, IncFC032Tissue forceps
Xylazine VetOne13985-704-10Anesthetic

参考文献

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