Microscopía subcelular intravital de la glándula mamaria

Resumen

El presente protocolo describe una técnica sencilla para la obtención de imágenes intravitales de la glándula mamaria de ratón lactante mediante microscopía confocal y multifotónica de barrido láser.

Resumen

La glándula mamaria constituye un modelo por excelencia para investigar las funciones epiteliales, incluyendo la remodelación de tejidos, la polaridad celular y los mecanismos secretores. Durante el embarazo, la glándula se expande desde un árbol ductal primitivo incrustado en una almohadilla de grasa hasta una red alveolar muy ramificada preparada para la formación y secreción de calostro y leche. Después del parto, la glándula suministra todos los nutrientes necesarios para la supervivencia neonatal, incluidas las gotas de lípidos (LD) recubiertas de membrana, proteínas, carbohidratos, iones y agua. Varios componentes de la leche, como la lactosa, las micelas de caseína y las proteínas de la leche descremada, se sintetizan dentro de las células alveolares y se secretan de las vesículas por exocitosis en la superficie apical. Las LD son transportadas desde los sitios de síntesis en el retículo endoplásmico rugoso hasta el ápice celular, recubiertas con membranas celulares y secretadas por un mecanismo apocrino único. Otros componentes preformados, incluidos los anticuerpos y las hormonas, se transportan desde el lado seroso del epitelio a la leche por transcitosis. Estos procesos son susceptibles de microscopía intravital porque la glándula mamaria es una glándula cutánea y, por lo tanto, directamente accesible a la manipulación experimental. En este trabajo se describe un procedimiento sencillo para investigar la cinética de la secreción de LD in situ, en tiempo real, en ratones vivos anestesiados. El boro-dipirrometeno (BODIPY)_665/676 o el monodansilpentano se utilizan para marcar la fracción lipídica neutra de los ratones transgénicos, que expresan EGFP (proteína fluorescente verde mejorada) soluble en el citoplasma, o un péptido dirigido a la membrana fusionado con EGFP o tdTomato. Las proteínas de fusión marcadas con membrana sirven como marcadores de las superficies celulares, y los colorantes lipídicos resuelven las LD ≥ 0,7 μm. Las imágenes de lapso de tiempo se pueden registrar mediante microscopía confocal de barrido láser estándar hasta una profundidad de 15-25 μm o mediante microscopía multifotónica para obtener imágenes más profundas en el tejido. La glándula mamaria puede ser bañada con agentes farmacológicos o tintes fluorescentes durante toda la cirugía, proporcionando una plataforma para manipulaciones experimentales agudas según sea necesario.

Introducción

La microscopía intravital de la glándula mamaria de ratón está atrayendo cada vez más atención como un método poderoso para analizar una amplia gama de fenómenos biológicos, incluido el origen y la diferenciación de las células madre ^1,2, la progresión de los tumores metastásicos ^3,4,5 y el papel de los macrófagos ductales a lo largo del desarrollo y la involución mamaria⁶. A través del desarrollo de la Microscopía Subcelular Intravital (ISMic)⁷, las investigaciones se han extendido al tráfico de membrana y a los mecanismos de secreción durante la lactancia ^8,9, y a la contracción mediada por oxitocina de las células mioepiteliales ^9,10. Se han desarrollado dos métodos principales que aprovechan la accesibilidad de la glándula entre la piel y la pared del cuerpo.

En el primer enfoque, se inserta una ventana acrílica o de vidrio en la piel y se asegura con un anillo de retención metálico ^1,3,11. Los ratones toleran bien la cirugía, y varios fenómenos pueden ser analizados de forma intermitente en el mismo animal durante varias semanas. Este método ha demostrado ser especialmente útil para el rastreo de linaje ^1,12 y el seguimiento de la invasión y progresión de tumores mamarios in situ ^3,11. Sin embargo, la resolución por debajo del nivel de la célula entera ha demostrado ser difícil porque la glándula todavía está unida a la pared del cuerpo y, por lo tanto, está sujeta a artefactos de movimiento causados por la respiración y los latidos del corazón.

En el segundo abordaje, la glándula se expone quirúrgicamente en un colgajo de piel con vasculatura intacta y se estabiliza en la platina del microscopio con espaciadores ^4,9,13. De este modo, una parte de la glándula se separa eficazmente de la pared abdominal y se minimizan los artefactos de movimiento. En la mayoría de los casos, el parénquima expuesto se coloca directamente sobre el cubreobjetos con el lado ventral del ratón hacia abajo en un microscopio invertido. En una modificación reciente, el ratón se colocó en decúbito supino en un microscopio vertical, y la glándula expuesta se protegió en una celda llena de líquido sellada con un cubreobjetos². Esta última configuración permite el acceso a la superficie parenquimatosa para la manipulación experimental durante la obtención de imágenes. La resolución de hasta <1 μm, en ambos casos, permite el análisis de los procesos intracelulares, como lo ejemplifica el seguimiento de las gotas de lípidos (LD) en las células epiteliales mamarias⁹.

El presente protocolo detalla un método sencillo para la obtención de imágenes intravitales de las células epiteliales mamarias a nivel subcelular utilizando como ejemplo la biogénesis, el transporte y la secreción de LD durante la lactancia. Este enfoque es ampliamente aplicable a muchos otros procesos, incluyendo el transporte y secreción de proteínas de la leche¹⁴, la transcitosis de proteínas desde el lado seroso del epitelio hasta la luz alveolar^15,16 y la remodelación de la glándula durante la involución ^17,18.

Los ratones que expresan una proteína fluorescente son los preferidos para la mayoría de los experimentos intravitales para facilitar la selección de áreas apropiadas para la obtención de imágenes y como marcador morfológico de referencia. Dispone de una amplia gama de ratones transgénicos y knock-in adecuados, que expresan marcadores de proteínas fluorescentes en compartimentos celulares, elementos del citoesqueleto, membranas y orgánulos¹⁹. En los ejemplos dados, se utilizó el ratón EGFP_cyto FvB, en el que la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) se dirige al citoplasma en la mayoría de las células²⁰ (denotado_{EGFP cyto}), y el ratón C57BL/6J Tomato (mT/mG)²¹, que es una línea Cre doble fluorescente que codifica los genes tdTomato y EGFP. La expresión de EGFP se habilita a través de la escisión mediada por Cre del gen tdTomato. Cualquiera de los fluoróforos se dirige a la membrana plasmática en la mayoría de las células a través de una secuencia derivada de la proteína MARCKS²¹. En este trabajo, los ratones que expresan el fluoróforo rojo tdTomato se denotan tdTomato_membr (mT), y los ratones que expresan EGFP, después de la escisión del gen tdTomato se denotan EGFP_membr (mG).

Los ratones tienen cinco pares de glándulas mamarias a cada lado de la línea media ventral, tres en la región torácica (numeradas del 1 al 3) y dos en la región inguinal (numeradas del 4 al 5) (Figura 1A). Para la ISMic, las glándulas inguinales son las más accesibles y fáciles de estabilizar, ya que están más alejadas de los movimientos globales asociados con la respiración y los latidos del corazón en el tórax.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Investigación del Cáncer, el Instituto Nacional del Cáncer, los Institutos Nacionales de Salud de conformidad con la Guía del Consejo Nacional de Investigación de EE. UU. para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, la Política del Servicio de Salud Pública de EE. UU. sobre el Cuidado y el Uso Humanitario de Animales de Laboratorio, y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Para este trabajo, se prepararon quirúrgicamente las glándulas número 4 de ratones primíparos hembra (de 4-5 meses, día 10 de lactancia) en decúbito supino derecho (Figura 1A).

1. Preparación animal

1. Pese el ratón en una balanza de carga superior para calcular la cantidad de anestésico necesaria.
2. Durante y después de aplicar los anestésicos, mantenga la temperatura corporal colocando el ratón sobre una almohadilla térmica.
3. Anestesiar al ratón mediante una breve exposición al isoflurano (3,0%-3,5%) en una cámara respiratoria saturada de oxígeno (ver Tabla de Materiales) durante 1-2 min, seguida de una inyección intraperitoneal de una mezcla de 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilacina.
4. Mantenga a los animales bajo un plano profundo de anestesia durante la cirugía y la obtención de imágenes mediante la aplicación adicional de dosis tituladas de xilacina y ketamina (de la mitad a un cuarto de la dosis inicial descrita en el paso 1.3) a través de un catéter permanente (ver paso 3.4) cada 45 minutos aproximadamente, según sea necesario.
   NOTA: Un plano óptimo de anestesia se mantiene más fácilmente verificando los reflejos de pinzamiento palpebral y de los dedos de los pies cada 10-20 minutos. La temperatura de los ratones conscientes es de 36,5-38 °C, que desciende a 34,5 °C bajo anestesia.
5. Crianza cruzada de las crías²² si se dispone de ratones donantes en una etapa similar de lactancia; De lo contrario, practica la eutanasia a la camada.
   NOTA: Los cachorros <10 días de edad deben ser sacrificados mediante la exposición a isoflurano al 3.0% seguida de decapitación. Los cachorros ≥ 10 días de edad deben ser sacrificados a través de la inhalación de CO₂ seguida de una dislocación cervical.

2. Procedimiento quirúrgico

1. Mantenga el mouse caliente durante la cirugía en una almohadilla térmica. Afeita el pelaje de la piel que rodea las glándulas mamarias número 4 y 5 (decúbito supino, lado derecho) con una maquinilla de afeitar eléctrica de mano. Limpie el área afeitada con tres exfoliantes alternos de betadine y alcohol.
2. Limpie todos los instrumentos quirúrgicos con alcohol al 70%. Haga una incisión en la línea media de ~ 1 cm cerca del cuarto pezón pellizcando la piel con pinzas y cortando la piel levantada con tijeras afiladas. Haga incisiones circulares alrededor de la glándula en dirección craneal y caudal y retire cuidadosamente la piel del abdomen. Mantenga la piel expuesta húmeda con solución salina fisiológica.
3. Para minimizar la pérdida de sangre, selle los vasos sanguíneos prominentes con un cauterizador manual (consulte la Tabla de materiales) antes de cortarlos. Cualquier sangre exógena debe extraerse rápidamente con solución salina fisiológica para evitar la pérdida posterior de la resolución óptica.
4. Retire el tejido conectivo y adiposo superficial frotando suavemente la capa superficial con pinzas finas.
5. Mantenga húmeda la glándula expuesta con solución salina fisiológica y proteja la pared abdominal con gel y película termoplástica semitransparente y flexible (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: Los pasos 2.2-2.5 crean un colgajo de piel con una porción de la glándula y la vasculatura asociada separada de la pared abdominal (Figura 1Bi-iv).
6. Si es necesario, trate la glándula con agentes exógenos, por ejemplo, agentes farmacológicos o tintes específicos de orgánulos, bañando la glándula expuesta durante la cirugía.
   NOTA: En los ejemplos dados, las LD en un_{ratón con citoto} EGFP o con un ratón_{EGFP membr} (mG) se marcaron con 1,0 mL de boro-dipirrometeno (BODIPY)_665/676 (solución madre de 10 mM en dimetil sulfóxido diluido de 1 a 1.000 veces en solución salina y aplicada durante <1 h) y en el ratón tdTomato_membr (mT) o EGFP_membr (mG), con 0,5 mL de monodansilpentano²³ (solución madre 0,1M en dimetilsulfóxido diluida de 1 a 1.000 veces en solución salina y aplicada durante 5 min).

3. Preparación de imágenes

1. Coloque cuidadosamente el ratón con el lado abdominal hacia abajo sobre una platina de microscopio invertida calentada (37 °C), de modo que el colgajo de piel se extienda sobre el cubreobjetos central (30 mm) (Figura 1Biv). Proteja las áreas expuestas con una fina capa de gel.
2. Estabilice el colgajo de piel con espaciadores hechos a medida para amortiguar la glándula de los artefactos de movimiento causados por la respiración y los latidos del corazón. Para lograr esto, coloque un espaciador con muescas hecho con tres palitos de algodón pegados con cinta adhesiva (Figura 1Ci) entre el colgajo de piel y la pared del cuerpo y pegue la pata trasera y la cola a la etapa detrás del espaciador (Figura 1Bv).
3. Evite que el colgajo de piel se deslice durante la toma de imágenes colocando firmemente una cubierta de plástico (Figura 1Cii) en cada extremo de la abertura de la platina (Figura 1Bv).
4. Inserte un catéter permanente subcutáneo debajo de la piel dorsal conectado a un tubo, una jeringa y una bomba (consulte la Tabla de materiales).
5. Confirmar que el colgajo de piel es estable con un flujo sanguíneo adecuado mediante microscopía de fluorescencia convencional (Figura 1Bvi).
6. Cubra el ratón con una gasa de esponja (consulte la Tabla de materiales) para mantener el calor durante la toma de imágenes.
   NOTA: Los pasos 3.1-3.5 son los más críticos para garantizar la adquisición de videos de alta resolución adecuados para el análisis cuantitativo. No tiene sentido avanzar más allá de esta etapa a menos que se haya confirmado la estabilidad del tejido.

4. Microscopía

1. Para la microscopía confocal convencional del ratón EGFP_cyto o EGFP_membr (mG) marcado con BODIPY_665/676 (Figura 2, Video 1 y Video 2), utilice un microscopio invertido equipado con un objetivo de inmersión en aceite precalentado 60x, mantenido a 37 °C (ver Tabla de Materiales).
   1. Detecte por separado EGFP y BODIPY_665/676 utilizando láseres 488 y 633, respectivamente; para EGFP, excitación 488 nm y emisión 560 nm, con filtro de paso de banda BA 505-605; para BODIPY_665/676, excitación 633 nm y emisión 668 nm, con filtro de paso de banda BA 655-755.
   2. Recopile imágenes mediante escaneo lineal a 4 u 8 μs/píxel (512 x 512 píxeles; 12 bits por píxel) cada 5 s o 10 s durante 1-2 h y guárdelas como archivos TIFF. Mantenga manualmente las áreas escaneadas en el encuadre corrigiendo la desviación x/y a lo largo del ciclo de imágenes. Construya imágenes en 3D a partir de z-scans utilizando software asociado con el microscopio (consulte la Tabla de materiales).
2. Para la microscopía de dos fotones del ratón EGFP_membr (mG) marcado con monodansilpentano (Figura 3, Video 3), utilice un microscopio invertido equipado con un láser sintonizable y un objetivo 30x precalentado a 37 °C (ver Tabla de Materiales).
   1. Excite la glándula a 910 nm y detecte monodansilpentano y EGFP con dos detectores de GaAs, utilizando filtros de paso de banda de 410-460 nm y 495-540 nm para emisiones azules y verdes, respectivamente.
   2. Recopile imágenes mediante escaneo lineal a 2 μs/píxel (320 x 320 píxeles; 16 bits por píxel) y guárdelas como archivos OIR. Mantenga manualmente las áreas escaneadas en el encuadre corrigiendo la desviación x/y a lo largo del ciclo de imágenes. Construya imágenes en 3D a partir de z-scans utilizando el software asociado con el microscopio.
3. Para la microscopía de dos fotones del ratón_membr (mT) marcado con monodansilpentano (Figura 4, Video 4), utilice un microscopio invertido con láseres sintonizables y un objetivo precalentado a 37 °C 63x (consulte la Tabla de materiales).
   1. Excite muestras a 800 nm y 1.060 nm simultáneamente y detecte monodansilpentano con un detector híbrido HyD configurado a una emisión de 418-471 nm y TdTomato con otro detector híbrido HyD configurado a una emisión de 595-667 nm.
   2. Recopile las imágenes mediante escaneo lineal con cuatro líneas con un promedio de 200 Hz (512 x 512 píxeles; 12 bits por píxel) y guárdelas como archivos LIF. Mantenga manualmente las áreas escaneadas en el encuadre corrigiendo la desviación x/y a lo largo del ciclo de imágenes. Construya imágenes en 3D a partir de escaneos z utilizando el software asociado con el microscopio.

5. Eutanasia

1. Eutanasia de los ratones al final de la toma de imágenes mediante inhalación de CO₂ siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente.

6. Creación de videos en tiempo real

1. Convierta secuencias de tiempo en archivos TIFF y luego en videos utilizando el software adecuado (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: El análisis cuantitativo de videos específicos está más allá del alcance de este documento y requerirá métodos específicos para la solución de problemas específicos. Por ejemplo, véase Ebrahim et ^al.24 para el papel de los complejos de actinomiosina en la exocitosis de la saliva de la glándula salival, Meyer et ^al.25 para la dinámica de la secreción de bilis desde el hígado, y Masedunskas et ^al.9 para el análisis de la secreción de LD de las células epiteliales mamarias.

Resultados

La leche es secretada por células epiteliales alveolares polarizadas, que se diferencian durante el embarazo de las yemas de un árbol extenso dúctular²⁶ (Figura 2A). Los precursores para la síntesis de leche se asimilan a través de las membranas basales/laterales y los productos completos se secretan a través de la superficie apical en un "espacio lácteo" central. El lado basal de cada alvéolo está cubierto por un conjunto es...

Discusión

El uso de un microscopio de uno o varios fotones depende de las preguntas que se hagan, la naturaleza y la ubicación del tejido que se va a obtener y la resolución requerida. Los microscopios multifotónicos se basan en la generación de dos o más fotones de baja energía en el infrarrojo cercano, que pueden penetrar en los tejidos a mayor profundidad y con menor fototoxicidad que los microscopios de un fotón^29,30. Además, e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
488 laser	Melles-Griot	-	CW  laser 50 mW
60x PLAPON oil immersion objective (NA 1.42)	Olympus	1-U2B933	Lens Confocal microscope
633 laser	Melles-Griot	-	CW He-Ne laser 12 mW
63x objective (NA 1.40, HC PL APO CS2)	Leica	11506350	Lens Two-photon microscope
BA 410-460 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 495-540 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 505-605 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 655-755 nm	Chroma	-	Band-pass filter
Boron-dipyrromethane (BODIPY) 665/676	Thermo Fisher Scientific	B3932	Lipid peroxiation sensor
Carbomer-940	Snowdrift Farm	739601480651	Gel
Catheter	Terumo	SV27EL	Winged infusion sets
Cauterizer	Braintree Scientific, Inc	GEM 5917	Cautery system
CMV-Cre mouse	Jackson lab	006054	Mouse line
Coverslip	Bioptechs	-	30mm diameter coverlip for inverted microscope
Curity 4x4 inch all purpose sponge gauze	Covidien	9024	Sponge
EGFPcyto mouse	Jackson lab	003291	Mouse line
Fiji/ImageJ software	Open source	-	Free software tool
Fine forceps	Braintree Scientific, Inc	FC003 8	Tissue forceps
Fluoview 1000 microscope	Olympus	FV1000	Confocal microscope
FluoView software	Olympus	-	Confocal microscope and Two-photon microscope
Hand-held electric razor	Braintree Scientific, Inc	CLP-8786-451A	Cordless clipper
Heat pad	Braintree Scientific, Inc	DPIP	Heat pad for animals
HyD detectors	Leica	-	Leica 4Tune spectral detector
Imaris software	Bitplane / Oxford instruments	-	Commercial software tool
Ingisht X3 tunable laser	Spectra Physics	Insight X3	Tunable Pulse-Laser
Isoflurane	VetOne	13985-046-40	Anesthetic
Ketamine	VetOne	13985-702-10	Anesthetic
LAS X Software	Leica	-	Two-photon microscope software tool
Mai-Tai tunable laser	Spectra Physics	Mai-Tai	Laser
MetaMorph	Molecular Devices	-	Commercial software tool
Monodansylpentane AUTODOT	Abcepta	Sm1000a	Lipid droplet dye
MPE-RS microscope	Olympus	IX70	Two-photon microscope
mT/mG mouse	Jackson lab	007676	Mouse line
Objective heater	Bioptechs	150819	Objective heater for both confocal and two-photon microscopes
Oxygen-saturated respiration chamber	Patterson Scientific	78933385, SAS3 and EVAC4	Gas Anesthesia and evacuation system
Parafilm	Heathrow Scientific	HS234526B	Semi-transparent, flexible, thermoplastic film
PMT detector	Olympus	-	Descanned   detectors
PMT detector	LSM-Technology	Custom built	Non-Descanned Detectors
Pump	Harvard Apparatus	703602, 704402	Nanomite injector and controller
Saline	Quality Biological	114-055-721EA	Normal saline
Sharp blunt-ended scissors	Braintree Scientific, Inc	SCT-S 508	Surgical scissors
Syringe	Covidien	22-257-150	1mL tuberculin syringe
TCS SP8 Dive Spectral microscope	Leica	SP8	Two-photon microscope
Tweezers	Braintree Scientific, Inc	FC032	Tissue forceps
Xylazine	VetOne	13985-704-10	Anesthetic