Microscopia Subcelular Intravital da Glândula Mamária

Resumo

O presente protocolo descreve uma técnica fácil para a imagem intravital da glândula mamária de camundongos lactantes por microscopia confocal e multifotônica de varredura a laser.

Resumo

A glândula mamária constitui um modelo por excelência para investigar funções epiteliais, incluindo remodelação tecidual, polaridade celular e mecanismos secretores. Durante a gravidez, a glândula se expande de uma árvore ductal primitiva embutida em uma almofada de gordura para uma rede alveolar altamente ramificada, preparada para a formação e secreção de colostro e leite. No pós-parto, a glândula fornece todos os nutrientes necessários para a sobrevivência neonatal, incluindo gotículas lipídicas revestidas por membrana (LDs), proteínas, carboidratos, íons e água. Vários componentes do leite, incluindo lactose, micelas de caseína e proteínas do leite desnatado, são sintetizados dentro das células alveolares e secretados das vesículas por exocitose na superfície apical. Os LDs são transportados de locais de síntese no retículo endoplasmático rugoso para o ápice celular, revestidos com membranas celulares e secretados por um mecanismo apócrino único. Outros constituintes pré-formados, incluindo anticorpos e hormônios, são transportados do lado seroso do epitélio para o leite por transcitose. Esses processos são passíveis de microscopia intravital porque a glândula mamária é uma glândula cutânea e, portanto, diretamente acessível à manipulação experimental. Neste artigo, um procedimento fácil é descrito para investigar a cinética da secreção de LD in situ, em tempo real, em camundongos vivos anestesiados. Boro-dipirrometeno (BODIPY) _665/676 ou monodansilpentano são usados para rotular a fração lipídica neutra de camundongos transgênicos, que expressam EGFP solúvel (proteína fluorescente verde aprimorada) no citoplasma ou um peptídeo direcionado à membrana fundido a EGFP ou tdTomato. As proteínas de fusão marcadas com membrana servem como marcadores de superfícies celulares, e os corantes lipídicos resolvem LDs ≥ 0,7 μm. As imagens de lapso de tempo podem ser gravadas por microscopia confocal de varredura a laser padrão até uma profundidade de 15-25 μm ou por microscopia multifotônica para imagens mais profundas no tecido. A glândula mamária pode ser banhada com agentes farmacológicos ou corantes fluorescentes durante toda a cirurgia, fornecendo uma plataforma para manipulações experimentais agudas, conforme necessário.

Introdução

A microscopia intravital da glândula mamária de camundongo está atraindo cada vez mais atenção como um método poderoso para analisar toda uma gama de fenômenos biológicos, incluindo a origem e diferenciação de células-tronco ^1,2, a progressão de tumores metastáticos ^3,4,5 e o papel dos macrófagos ductais ao longo do desenvolvimento e involução mamária⁶. Através do desenvolvimento da Microscopia Subcelular Intravital (ISMic)⁷, as investigações foram estendidas ao tráfego de membrana e mecanismos secretores durante a lactação ^8,9 e à contração mediada por ocitocina de células mioepiteliais ^9,10. Dois métodos principais foram desenvolvidos para aproveitar a acessibilidade da glândula entre a pele e a parede do corpo.

Na primeira abordagem, uma janela de acrílico ou vidro é inserida na pele e fixada com um anel de retenção de metal ^1,3,11. Os camundongos toleram bem a cirurgia, e vários fenômenos podem ser analisados de forma intermitente no mesmo animal ao longo de várias semanas. Esse método tem se mostrado especialmente útil para traçar linhagens ^1,12 e monitorar a invasão e progressão de tumores mamários in situ ^3,11. No entanto, a resolução abaixo do nível de toda a célula tem se mostrado difícil porque a glândula ainda está presa à parede do corpo e, portanto, está sujeita a artefatos de movimento causados pela respiração e batimentos cardíacos.

Na segunda abordagem, a glândula é exposta cirurgicamente em um retalho cutâneo com vasculatura íntegra e estabilizada na platina microscópica com espaçadores ^4,9,13. Uma parte da glândula é, portanto, efetivamente separada da parede abdominal e os artefatos de movimento são minimizados. Na maioria dos casos, o parênquima exposto é colocado diretamente na lamínula com o lado ventral do camundongo voltado para baixo em um microscópio invertido. Em uma modificação recente, o camundongo foi colocado em decúbito dorsal em um microscópio vertical e a glândula exposta foi protegida em uma célula cheia de líquido selada com uma lamínula². Esta última configuração permite o acesso à superfície do parênquima para manipulação experimental durante a imagem. A resolução de até <1 μm, em ambos os casos, permite a análise de processos intracelulares, como exemplificado pelo rastreamento de gotículas lipídicas (LDs) em células epiteliais mamárias⁹.

O presente protocolo detalha um método fácil para a imagem intravital de células epiteliais mamárias no nível subcelular usando a biogênese, transporte e secreção de LDs durante a lactação como exemplo. Essa abordagem é amplamente aplicável a muitos outros processos, incluindo o transporte e secreção de proteínas do leite¹⁴, a transcitose de proteínas do lado seroso do epitélio para o lúmen alveolar^15,16 e a remodelação da glândula durante a involução^17,18.

Os camundongos que expressam uma proteína fluorescente são preferidos para a maioria dos experimentos intravitais para facilitar a seleção de áreas apropriadas para imagens e como um marcador de referência morfológico. Uma ampla gama de camundongos transgênicos e knock-in adequados está disponível, que expressam marcadores de proteínas fluorescentes em compartimentos celulares, elementos do citoesqueleto, membranas e organelas¹⁹. Nos exemplos dados, foi usado o camundongo_{EGFP cyto} FvB, no qual a proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP) é direcionada ao citoplasma na maioria das células²⁰ (denotada_{EGFP cito}), e o camundongo C57BL / 6J Tomato (mT / mG)²¹, que é uma linha Cre fluorescente dupla que codifica os genes tdTomato e EGFP. A expressão de EGFP é habilitada por meio da excisão mediada por Cre do gene tdTomato. Qualquer fluoróforo é direcionado para a membrana plasmática na maioria das células por meio de um sequon derivado da proteína^{MARCKS 21}. Neste trabalho, os camundongos que expressam o fluoróforo vermelho tdTomato são denotados_{como tdTomato membr} (mT), e os camundongos que expressam EGFP, após a excisão do gene tdTomato, são denotados como EGFP_membr (mG).

Os camundongos têm cinco pares de glândulas mamárias em ambos os lados da linha média ventral, três na região torácica (numeradas de 1 a 3) e duas na região inguinal (numeradas de 4 a 5) (Figura 1A). Para o ISMic, as glândulas inguinais são as mais acessíveis e fáceis de estabilizar, pois estão mais distantes dos movimentos globais associados à respiração e aos batimentos cardíacos no tórax.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Pesquisa do Câncer, Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde em conformidade com o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa dos EUA para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, a Política do Serviço de Saúde Pública dos EUA sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório, e o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Para este trabalho, as glândulas número 4 de camundongos primíparas fêmeas (com idade entre 4-5 meses, dia 10 de lactação) foram preparadas cirurgicamente em decúbito dorsal direito (Figura 1A).

1. Preparação animal

1. Pese o mouse em uma balança de carregamento superior para calcular a quantidade de anestésico necessária.
2. Durante e após a aplicação de anestésicos, mantenha a temperatura corporal colocando o mouse em uma almofada de aquecimento.
3. Anestesiar o camundongo por breve exposição ao isoflurano (3,0%-3,5%) em uma câmara de respiração saturada de oxigênio (ver Tabela de Materiais) por 1-2 min, seguido por uma injeção intraperitoneal de uma mistura de 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina.
4. Manter os animais sob um plano profundo de anestesia durante a cirurgia e a imagiologia, aplicando doses tituladas de xilazina e cetamina (metade a um quarto da dose inicial descrita no passo 1.3) através de um cateter de demora (ver passo 3.4) a cada 45 minutos ou mais, conforme necessário.
   NOTA: Um plano ideal de anestesia é mais facilmente mantido verificando os reflexos palpebral e de pinça do pé a cada 10-20 min. A temperatura dos camundongos conscientes é de 36,5-38 °C, que cai para 34,5 °C sob anestesia.
5. Adote os filhotes²² se camundongos doadores em estágio semelhante de lactação estiverem disponíveis; caso contrário, sacrificar a liteira.
   NOTA: Filhotes <10 dias de idade devem ser sacrificados por exposição a 3,0% de isoflurano seguido de decapitação. Filhotes ≥ 10 dias de idade devem ser sacrificados por inalação de CO₂ seguida de luxação cervical.

2. Procedimento cirúrgico

1. Mantenha o mouse aquecido durante a cirurgia em uma almofada de aquecimento. Raspe o pelo da pele ao redor das glândulas mamárias número 4 e 5 (supino, lado direito) usando um barbeador elétrico portátil. Limpe a área depilada com três esfoliantes alternados de betadine e álcool.
2. Limpe todos os instrumentos cirúrgicos com álcool 70%. Faça uma incisão na linha média de ~ 1 cm perto do quarto mamilo, beliscando a pele com uma pinça e cortando a pele levantada com uma tesoura afiada. Faça incisões circulares ao redor da glândula nas direções cranial e caudal e retire cuidadosamente a pele do abdômen. Mantenha a pele exposta úmida com soro fisiológico.
3. Para minimizar a perda de sangue, sele todos os vasos sanguíneos proeminentes com um cauterizador portátil (consulte a Tabela de Materiais) antes de cortá-los. Qualquer sangue exógeno deve ser imediatamente removido com soro fisiológico para evitar a perda subsequente da resolução óptica.
4. Remova o tecido conjuntivo e adiposo superficial provocando suavemente a camada superficial com uma pinça fina.
5. Mantenha a glândula exposta úmida com solução salina fisiológica e proteja a parede abdominal com gel e filme termoplástico flexível semitransparente (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: As etapas 2.2-2.5 criam um retalho de pele com uma porção da glândula e vasculatura associada separada da parede abdominal (Figura 1Bi-iv).
6. Se necessário, trate a glândula com agentes exógenos, por exemplo, agentes farmacológicos ou corantes específicos de organelas, banhando a glândula exposta durante a cirurgia.
   NOTA: Nos exemplos dados, os LDs em um camundongo_{EGFP cyto} ou EGFP_membr (mG) foram marcados com 1,0 mL de boro-dipirrometeno (BODIPY) _665/676 (solução estoque de 10 mM em dimetilsulfóxido diluído 1 a 1.000 vezes em solução salina e aplicado por <1 h) e no camundongo tdTomato_membr (mT) ou EGFP_membr (mG), com 0,5 mL de monodansilpentano²³ (solução estoque 0,1M em sulfóxido de dimetila diluída de 1 a 1.000 vezes em solução salina e aplicada por 5 min).

3. Preparação de imagem

1. Posicione cuidadosamente o mouse com o lado abdominal voltado para baixo em um microscópio invertido aquecido (37 ° C), de modo que o retalho cutâneo se estenda até a lamínula central (30 mm) (Figura 1Biv). Proteja as áreas expostas com uma fina camada de gel.
2. Estabilize o retalho cutâneo com espaçadores feitos sob medida para amortecer a glândula de artefatos de movimento causados pela respiração e batimentos cardíacos. Para conseguir isso, coloque um espaçador entalhado feito de três palitos de algodão colados (Figura 1Ci) entre a aba da pele e a parede do corpo e prenda a perna traseira e a cauda no palco atrás do espaçador (Figura 1Bv).
3. Evite que o retalho cutâneo deslize durante a imagem prendendo com segurança uma tampa plástica (Figura 1Cii) em cada extremidade da abertura do estágio (Figura 1Bv).
4. Insira um cateter subcutâneo de demora sob a pele dorsal conectado a um tubo, seringa e bomba (consulte a Tabela de Materiais).
5. Confirme se o retalho cutâneo está estável com fluxo sanguíneo adequado por microscopia de fluorescência convencional (Figura 1Bvi).
6. Cubra o mouse com gaze de esponja (consulte a Tabela de Materiais) para se manter aquecido durante a geração de imagens,
   NOTA: As etapas 3.1 a 3.5 são as mais críticas para garantir a aquisição de vídeos de alta resolução adequados para análise quantitativa. Não faz sentido prosseguir além desse estágio, a menos que a estabilidade do tecido tenha sido confirmada.

4. Microscopia

1. Para microscopia confocal convencional do camundongo_{EGFP cyto} ou EGFP_membr (mG) marcado com BODIPY_665/676 (Figura 2, Vídeo 1 e Vídeo 2), use um microscópio invertido equipado com uma objetiva de imersão em óleo pré-aquecida de 60x, mantida a 37 ° C (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Detecte separadamente EGFP e BODIPY_665/676 usando lasers 488 e 633, respectivamente; para EGFP, excitação 488 nm e emissão 560 nm, com filtro passa-banda BA 505-605; para BODIPY_665/676, excitação 633 nm e emissão 668 nm, com filtro passa-banda BA 655-755.
   2. Colete imagens por varredura de linha a 4 ou 8 μs/pixel (512 x 512 pixels; 12 bits por pixel) a cada 5 s ou 10 s por 1-2 h e armazene como arquivos TIFF. Mantenha manualmente as áreas digitalizadas no quadro, corrigindo o desvio x/y durante todo o ciclo de imagem. Construa imagens 3D a partir de z-scans usando software associado ao microscópio (consulte a Tabela de Materiais).
2. Para microscopia de dois fótons do camundongo_{EGFP membr} (mG) marcado com monodansilpentano (Figura 3, Vídeo 3), use um microscópio invertido equipado com um laser sintonizável e uma objetiva pré-aquecida a 37 ° C 30x (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Excitar a glândula a 910 nm e detectar monodansilpentano e EGFP com dois detectores de GaAs, usando filtros passa-banda de 410-460 nm e 495-540 nm para emissões azuis e verdes, respectivamente.
   2. Colete imagens por varredura de linha a 2 μs/pixel (320 x 320 pixels; 16 bits por pixel) e armazene-as como arquivos OIR. Mantenha manualmente as áreas digitalizadas no quadro, corrigindo o desvio x/y ao longo do ciclo de imagem. Construa imagens 3D a partir de z-scans usando um software associado ao microscópio.
3. Para microscopia de dois fótons do camundongo tdTomato_membr (mT) marcado com monodansilpentano (Figura 4, Vídeo 4), use um microscópio invertido com lasers sintonizáveis e uma objetiva pré-aquecida a 37 ° C 63x (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Excite amostras a 800 nm e 1.060 nm simultaneamente e detecte monodansilpentano com um detector híbrido HyD ajustado para emissão 418-471 nm e TdTomato com outro detector híbrido HyD definido para emissão 595-667 nm.
   2. Colete as imagens por varredura de linha com quatro linhas com média de 200 Hz (512 x 512 pixels; 12 bits por pixel) e armazene-as como arquivos LIF. Mantenha manualmente as áreas digitalizadas no quadro, corrigindo o desvio x/y ao longo do ciclo de imagem. Construa imagens 3D a partir de varreduras z usando um software associado ao microscópio.

5. Eutanásia

1. Eutanasiar os camundongos no final da imagem por inalação de CO₂ seguindo protocolos aprovados institucionalmente.

6. Criação de vídeos em tempo real

1. Converta sequências de tempo em arquivos TIFF e, em seguida, em vídeos usando o software apropriado (consulte Tabela de materiais).
   NOTA: A análise quantitativa de vídeos específicos está além do escopo deste artigo e exigirá métodos específicos para a solução de problemas específicos. Por exemplo, ver Ebrahim et ^al.24 para o papel dos complexos de actinomiosina na exocitose da saliva da glândula salivar, Meyer et ^al.25 para a dinâmica da secreção biliar do fígado e Masedunskas et ^al.9 para análise da secreção de LD das células epiteliais mamárias.

Resultados

O leite é secretado a partir de células epiteliais alveolares polarizadas, que se diferenciam durante a gravidez dos brotos de uma extensa árvore ductular²⁶ (Figura 2A). Os precursores da síntese do leite são assimilados através das membranas basais / laterais e os produtos completos são secretados através da superfície apical em um "espaço lácteo" central. O lado basal de cada alvéolo é coberto por uma matriz estrelada d...

Discussão

O uso de um microscópio de um ou multifótons depende das perguntas feitas, da natureza e localização do tecido a ser fotografado e da resolução necessária. Os microscópios multifotônicos baseiam-se na geração de dois ou mais fótons de baixa energia no infravermelho próximo, que podem penetrar nos tecidos em maior profundidade com menos fototoxicidade do que os microscópios de um fóton^29,30. Além disso, o fluorófo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
488 laser	Melles-Griot	-	CW  laser 50 mW
60x PLAPON oil immersion objective (NA 1.42)	Olympus	1-U2B933	Lens Confocal microscope
633 laser	Melles-Griot	-	CW He-Ne laser 12 mW
63x objective (NA 1.40, HC PL APO CS2)	Leica	11506350	Lens Two-photon microscope
BA 410-460 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 495-540 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 505-605 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 655-755 nm	Chroma	-	Band-pass filter
Boron-dipyrromethane (BODIPY) 665/676	Thermo Fisher Scientific	B3932	Lipid peroxiation sensor
Carbomer-940	Snowdrift Farm	739601480651	Gel
Catheter	Terumo	SV27EL	Winged infusion sets
Cauterizer	Braintree Scientific, Inc	GEM 5917	Cautery system
CMV-Cre mouse	Jackson lab	006054	Mouse line
Coverslip	Bioptechs	-	30mm diameter coverlip for inverted microscope
Curity 4x4 inch all purpose sponge gauze	Covidien	9024	Sponge
EGFPcyto mouse	Jackson lab	003291	Mouse line
Fiji/ImageJ software	Open source	-	Free software tool
Fine forceps	Braintree Scientific, Inc	FC003 8	Tissue forceps
Fluoview 1000 microscope	Olympus	FV1000	Confocal microscope
FluoView software	Olympus	-	Confocal microscope and Two-photon microscope
Hand-held electric razor	Braintree Scientific, Inc	CLP-8786-451A	Cordless clipper
Heat pad	Braintree Scientific, Inc	DPIP	Heat pad for animals
HyD detectors	Leica	-	Leica 4Tune spectral detector
Imaris software	Bitplane / Oxford instruments	-	Commercial software tool
Ingisht X3 tunable laser	Spectra Physics	Insight X3	Tunable Pulse-Laser
Isoflurane	VetOne	13985-046-40	Anesthetic
Ketamine	VetOne	13985-702-10	Anesthetic
LAS X Software	Leica	-	Two-photon microscope software tool
Mai-Tai tunable laser	Spectra Physics	Mai-Tai	Laser
MetaMorph	Molecular Devices	-	Commercial software tool
Monodansylpentane AUTODOT	Abcepta	Sm1000a	Lipid droplet dye
MPE-RS microscope	Olympus	IX70	Two-photon microscope
mT/mG mouse	Jackson lab	007676	Mouse line
Objective heater	Bioptechs	150819	Objective heater for both confocal and two-photon microscopes
Oxygen-saturated respiration chamber	Patterson Scientific	78933385, SAS3 and EVAC4	Gas Anesthesia and evacuation system
Parafilm	Heathrow Scientific	HS234526B	Semi-transparent, flexible, thermoplastic film
PMT detector	Olympus	-	Descanned   detectors
PMT detector	LSM-Technology	Custom built	Non-Descanned Detectors
Pump	Harvard Apparatus	703602, 704402	Nanomite injector and controller
Saline	Quality Biological	114-055-721EA	Normal saline
Sharp blunt-ended scissors	Braintree Scientific, Inc	SCT-S 508	Surgical scissors
Syringe	Covidien	22-257-150	1mL tuberculin syringe
TCS SP8 Dive Spectral microscope	Leica	SP8	Two-photon microscope
Tweezers	Braintree Scientific, Inc	FC032	Tissue forceps
Xylazine	VetOne	13985-704-10	Anesthetic