Intravitale subzelluläre Mikroskopie der Brustdrüse

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einfache Technik zur intravitalen Bildgebung der Milchdrüse der laktierenden Maus mittels konfokaler Laserscanning- und Multiphotonenmikroskopie.

Zusammenfassung

Die Brustdrüse stellt ein Modell par excellence für die Untersuchung von Epithelfunktionen dar, einschließlich des Gewebeumbaus, der Zellpolarität und der sekretorischen Mechanismen. Während der Schwangerschaft dehnt sich die Drüse von einem primitiven duktalen Baum, der in ein Fettpolster eingebettet ist, zu einem stark verzweigten Alveolarnetzwerk aus, das für die Bildung und Sekretion von Kolostrum und Milch vorbereitet ist. Nach der Geburt liefert die Drüse alle Nährstoffe, die für das Überleben des Neugeborenen erforderlich sind, einschließlich membranbeschichteter Lipidtröpfchen (LDs), Proteine, Kohlenhydrate, Ionen und Wasser. Verschiedene Milchbestandteile, darunter Laktose, Kaseinmizellen und Magermilchproteine, werden in den Alveolarzellen synthetisiert und durch Exozytose an der apikalen Oberfläche aus den Vesikeln sezerniert. LDs werden von den Synthesestellen im rauen endoplasmatischen Retikulum zur Zellspitze transportiert, sind mit Zellmembranen bedeckt und werden durch einen einzigartigen apokrinen Mechanismus sezerniert. Andere vorgeformte Bestandteile, darunter Antikörper und Hormone, werden durch Transzytose von der serosalen Seite des Epithels in die Milch transportiert. Diese Prozesse sind für die Intravitalmikroskopie zugänglich, da die Brustdrüse eine Hautdrüse ist und daher direkt für experimentelle Manipulationen zugänglich ist. In dieser Arbeit wird ein einfaches Verfahren beschrieben, um die Kinetik der LD-Sekretion in situ, in Echtzeit, an lebenden anästhesierten Mäusen zu untersuchen. Bor-Dipyrromethen (BODIPY)_665/676 oder Monodansylpentan werden verwendet, um die neutrale Lipidfraktion transgener Mäuse zu markieren, die entweder lösliches EGFP (enhanced green fluoreszierendes Protein) im Zytoplasma exprimieren oder ein membrangesteuertes Peptid, das entweder mit EGFP oder tdTomato fusioniert ist. Die membranmarkierten Fusionsproteine dienen als Marker für Zelloberflächen, und die Lipidfarbstoffe lösen LDs ≥ 0,7 μm auf. Zeitrafferbilder können mit der konfokalen Standard-Laserscanning-Mikroskopie bis zu einer Tiefe von 15-25 μm oder mit der Multiphotonenmikroskopie für die Bildgebung tiefer im Gewebe aufgenommen werden. Die Brustdrüse kann während der gesamten Operation mit pharmakologischen Wirkstoffen oder Fluoreszenzfarbstoffen gebadet werden, um bei Bedarf eine Plattform für akute experimentelle Manipulationen zu bieten.

Einleitung

Die Intravitalmikroskopie der Brustdrüse der Maus erregt zunehmend Aufmerksamkeit als leistungsfähige Methode zur Analyse einer ganzen Reihe biologischer Phänomene, einschließlich der Herkunft und Differenzierung von Stammzellen ^1,2, des Fortschreitens metastasierender Tumoren ^3,4,5 und der Rolle duktaler Makrophagen während der Brustentwicklung und -involution⁶. Durch die Entwicklung der Intravitalen Subzellulären Mikroskopie (ISMic)⁷ wurden die Untersuchungen auf den Membranverkehr und die sekretorischen Mechanismen während der Laktation^{ausgeweitet 8,9} und die Oxytocin-vermittelte Kontraktion von Myoepithelzellen ^9,10. Es wurden zwei Hauptmethoden entwickelt, die sich die Zugänglichkeit der Drüse zwischen Haut und Körperwand zunutze machen.

Beim ersten Ansatz wird ein Acryl- oder Glasfenster in die Haut eingesetzt und mit einem Metallsicherungsring ^1,3,11 gesichert. Die Mäuse vertragen die Operation gut, und verschiedene Phänomene können intermittierend über mehrere Wochen am selben Tier analysiert werden. Diese Methode hat sich als besonders nützlich für^die Abstammungsverfolgung ^1,12 und die Überwachung der Invasion und des Fortschreitens von Mammatumoren in situ^{erwiesen 3,11}. Eine Auflösung unterhalb der Ganzzellebene erwies sich jedoch als schwierig, da die Drüse noch an der Körperwand befestigt ist und somit Bewegungsartefakten ausgesetzt ist, die durch Atmung und Herzschlag verursacht werden.

Beim zweiten Zugang wird die Drüse chirurgisch auf einem Hautlappen mit intaktem Gefäßsystem freigelegt und auf dem Mikroskoptisch mit Spacern ^4,9,13 stabilisiert. Ein Teil der Drüse wird so effektiv von der Bauchdecke getrennt und Bewegungsartefakte werden minimiert. In den meisten Fällen wird das freiliegende Parenchym direkt auf dem Deckglas mit der Bauchseite nach unten auf einem inversen Mikroskop platziert. In einer kürzlichen Modifikation wurde die Maus in Rückenlage auf ein aufrechtes Mikroskop gelegt, und die freiliegende Drüse wurde in einer flüssigkeitsgefüllten Zelle geschützt, die mit einem Deckglas² verschlossen war. Diese letztere Konfiguration ermöglicht den Zugang zur Parenchymoberfläche für experimentelle Manipulationen während der Bildgebung. Eine Auflösung von bis zu <1 μm ermöglicht in beiden Fällen die Analyse intrazellulärer Prozesse, wie z. B. die Verfolgung von Lipidtröpfchen (LDs) in Brustepithelzellen^{zeigt 9}.

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einfaches Verfahren zur intravitalen Bildgebung von Brustepithelzellen auf subzellulärer Ebene am Beispiel der Biogenese, des Transports und der Sekretion von LDs während der Stillzeit. Dieser Ansatz ist auf viele andere Prozesse anwendbar, einschließlich des Transports und der Sekretion von Milchproteinen¹⁴, der Transzytose von Proteinen von der erosalen Seite des Epithels zum Alveolallumen^15,16 und des Umbaus der Drüse während der Involution ^17,18.

Mäuse, die ein fluoreszierendes Protein exprimieren, werden für die meisten intravitalen Experimente bevorzugt, um die Auswahl geeigneter Bereiche für die Bildgebung zu erleichtern und als morphologischer Referenzmarker. Es steht eine breite Palette geeigneter transgener und knock-in-Mäuse zur Verfügung, die fluoreszierende Proteinmarker in zellulären Kompartimenten, Zytoskelettelementen, Membranen und Organellen exprimieren¹⁹. In den gegebenen Beispielen wurde die EGFP-Cyto-FvB-Maus verwendet, bei der ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) auf das Zytoplasma in den meisten Zellen²⁰ gerichtet ist (als EGFP-Zyto bezeichnet), und die C57BL/6J-Tomate (mT/mG) Maus²¹, bei der es sich um eine doppelt fluoreszierende Cre-Linie handelt, die für tdTomato- und EGFP-Gene kodiert. Die EGFP-Expression wird durch Cre-vermittelte Exzision des tdTomato-Gens ermöglicht. Beide Fluorophore werden in den meisten Zellen durch eine vom MARCKS-Protein abgeleitete Folge auf die Plasmamembran^{gerichtet 21}. In dieser Arbeit werden Mäuse, die das rote tdTomato-Fluorophor exprimieren, als tdTomato_membr (mT) bezeichnet, und Mäuse, die EGFP exprimieren, werden nach Exzision des tdTomato-Gens als EGFP_membr (mG) bezeichnet.

Mäuse haben fünf Paare von Brustdrüsen auf beiden Seiten der ventralen Mittellinie, drei im Brustbereich (mit den Nummern 1-3) und zwei im Leistenbereich (mit den Nummern 4-5) (Abbildung 1A). Für ISMic sind die Leistendrüsen am leichtesten zugänglich und am einfachsten zu stabilisieren, da sie am weitesten von den globalen Bewegungen entfernt sind, die mit der Atmung und dem Herzschlag im Thorax verbunden sind.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Center for Cancer Research, des National Cancer Institute, der National Institutes of Health in Übereinstimmung mit dem Leitfaden des US National Research Council für die Pflege und Verwendung von Labortieren, der Richtlinie des US Public Health Service zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren, und der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren. Für diese Arbeit wurden die Drüsen Nummer 4 von weiblichen primiperen Mäusen (im Alter von 4-5 Monaten, Tag 10 der Laktation) chirurgisch in der rechten Rückenlage präpariert (Abbildung 1A).

1. Vorbereitung der Tiere

1. Wiegen Sie die Maus auf einer Topladerwaage, um die erforderliche Anästhesiemenge zu berechnen.
2. Halten Sie während und nach der Verabreichung von Anästhetika die Körpertemperatur aufrecht, indem Sie die Maus auf ein Wärmekissen legen.
3. Anästhesieren Sie die Maus durch kurze Exposition gegenüber Isofluran (3,0 %-3,5 %) in einer sauerstoffgesättigten Beatmungskammer (siehe Materialtabelle) für 1-2 Minuten, gefolgt von einer intraperitonealen Injektion einer Mischung aus 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin.
4. Halten Sie die Tiere sowohl während der Operation als auch während der Bildgebung unter einer tiefen Anästhesieebene, indem Sie je nach Bedarf titrierte Dosen von Xylazin und Ketamin (die Hälfte bis ein Viertel der in Schritt 1.3 beschriebenen Anfangsdosis) über einen Verweilkatheter (siehe Schritt 3.4) anwenden.
   HINWEIS: Eine optimale Anästhesieebene lässt sich am einfachsten aufrechterhalten, indem alle 10-20 Minuten auf Lid- und Zehenquetschreflexe überprüft wird. Die Temperatur von bewussten Mäusen liegt bei 36,5-38 °C, die unter Narkose auf 34,5 °C abfällt.
5. Kreuzpflege der Jungtiere²² , wenn Spendermäuse in einem ähnlichen Laktationsstadium verfügbar sind; Andernfalls euthanasiere den Müll ein.
   HINWEIS: Welpen im Alter von <10 Tagen sollten durch Exposition gegenüber 3,0% Isofluran eingeschläfert werden, gefolgt von einer Enthauptung. Welpen im Alter von ≥10 Tagen sollten durch CO₂ -Inhalation eingeschläfert werden, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation.

2. Ablauf der Operation

1. Halten Sie die Maus während der Operation auf einem Wärmekissen warm. Rasieren Sie das Fell von der Haut, die die Brustdrüsen Nr. 4 und 5 umgibt (Rückenlage, rechte Seite), mit einem Elektrorasierer. Reinigen Sie die rasierte Stelle mit drei abwechselnden Betadin- und Alkoholpeelings.
2. Wischen Sie alle chirurgischen Instrumente mit 70% Alkohol ab. Machen Sie einen mittleren Schnitt von ~1 cm in der Nähe der vierten Brustwarze, indem Sie die Haut mit einer Pinzette einklemmen und die erhabene Haut mit einer scharfen Schere schneiden. Machen Sie kreisförmige Schnitte um die Drüse sowohl in kranialer als auch in kaudaler Richtung und schälen Sie die Haut vorsichtig vom Bauch ab. Halten Sie die exponierte Haut mit physiologischer Kochsalzlösung feucht.
3. Um den Blutverlust zu minimieren, verschließen Sie alle hervorstehenden Blutgefäße mit einem Handkauterisierer (siehe Materialtabelle), bevor Sie sie durchschneiden. Jegliches exogene Blut sollte unverzüglich mit physiologischer Kochsalzlösung entfernt werden, um einen späteren Verlust der optischen Auflösung zu vermeiden.
4. Oberflächliches Binde- und Fettgewebe entfernen, indem die Deckschicht mit einer feinen Pinzette sanft bearbeitet wird.
5. Halten Sie die freiliegende Drüse mit physiologischer Kochsalzlösung feucht und schützen Sie die Bauchdecke mit Gel und einer halbtransparenten, flexiblen, thermoplastischen Folie (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: In den Schritten 2.2-2.5 wird ein Hautlappen erstellt, bei dem ein Teil der Drüse und des zugehörigen Gefäßsystems von der Bauchdecke getrennt ist (Abbildung 1Bi-iv).
6. Behandeln Sie die Drüse bei Bedarf mit exogenen Wirkstoffen, z. B. pharmakologischen Wirkstoffen oder organellenspezifischen Farbstoffen, indem Sie die freiliegende Drüse während der Operation baden.
   ANMERKUNG: In den angegebenen Beispielen wurden LDs entweder in einer EGFP-Zyto- oder EGFP-Maus₍mG) mit 1,0 ml Bor-Dipyrromethen (BODIPY)_665/676 (10 mM Stammlösung in Dimethylsulphoxid, 1- bis 1.000-fach in Kochsalzlösung verdünnt und für <1 h) und in der tdTomato_membr (mT) oder EGFP_membr (mG) Maus markiert. mit 0,5 mL Monodansylpentan²³ (0,1 M Stammlösung in Dimethylsulfoxid, 1- bis 1.000-fach in Kochsalzlösung verdünnt und 5 min lang aufgetragen).

3. Vorbereitung der Bildgebung

1. Positionieren Sie die Maus vorsichtig mit der Bauchseite nach unten auf einem beheizten (37 °C) inversen Mikroskoptisch, so dass der Hautlappen auf das zentrale Deckglas (30 mm) hinausragt (Abbildung 1Biv). Schützen Sie die freiliegenden Stellen mit einer dünnen Schicht Gel.
2. Stabilisieren Sie den Hautlappen mit maßgefertigten Abstandshaltern, um die Drüse vor Bewegungsartefakten zu schützen, die durch Atmung und Herzschlag verursacht werden. Um dies zu erreichen, platzieren Sie einen gekerbten Abstandshalter aus drei geklebten Wattestäbchen (Abbildung 1Ci) zwischen dem Hautlappen und der Körperwand und kleben Sie das hintere Bein und den Schwanz hinter dem Abstandshalter auf die Bühne (Abbildung 1Bv).
3. Verhindern Sie, dass der Hautlappen während der Bildgebung verrutscht, indem Sie eine Kunststoffabdeckung (Abbildung 1Cii) an beiden Enden an der Tischöffnung sicher abkleben (Abbildung 1Bv).
4. Führen Sie einen subkutanen Verweilkatheter unter die Rückenhaut ein, der an einem Schlauch, einer Spritze und einer Pumpe befestigt ist (siehe Materialtabelle).
5. Bestätigen Sie, dass der Hautlappen bei ausreichender Durchblutung durch konventionelle Fluoreszenzmikroskopie stabil ist (Abbildung 1Bvi).
6. Decken Sie die Maus mit Schwammgaze ab (siehe Materialtabelle), um sie während der Bildgebung warm zu halten.
   HINWEIS: Die Schritte 3.1 bis 3.5 sind die wichtigsten, um sicherzustellen, dass hochauflösende Videos aufgenommen werden, die für die quantitative Analyse geeignet sind. Es macht keinen Sinn, über dieses Stadium hinauszugehen, solange die Gewebestabilität nicht bestätigt wurde.

4. Mikroskopie

1. Für die konventionelle konfokale Mikroskopie der EGFP_cyto oder EGFP_membr (mG) Maus, die mit BODIPY_665/676 markiert wurde (Abbildung 2, Video 1 und Video 2), verwenden Sie ein inverses Mikroskop, das mit einem vorgeheizten 60-fachen Ölimmersionsobjektiv ausgestattet ist, das bei 37 °C gehalten wird (siehe Materialtabelle).
   1. Getrennte Detektion von EGFP und BODIPY_665/676 mit den Lasern 488 bzw. 633; für EGFP, Anregung 488 nm und Emission 560 nm, mit Bandpassfilter BA 505-605; für BODIPY_665/676, Anregung 633 nm und Emission 668 nm, mit Bandpassfilter BA 655-755.
   2. Erfassen Sie Bilder per Zeilenscan mit 4 oder 8 μs/Pixel (512 x 512 Pixel; 12 Bit pro Pixel) alle 5 s oder 10 s für 1-2 h und speichern Sie sie als TIFF-Dateien. Behalten Sie die gescannten Bereiche manuell im Bild bei, indem Sie die X/Y-Drift während des gesamten Bildgebungszyklus korrigieren. Erstellen Sie 3D-Bilder aus Z-Scans mit der Software, die mit dem Mikroskop verbunden ist (siehe Materialtabelle).
2. Für die Zwei-Photonen-Mikroskopie der EGFP_membr (mG) Maus, die mit Monodansylpentan markiert ist (Abbildung 3, Video 3), verwenden Sie ein inverses Mikroskop, das mit einem abstimmbaren Laser und einem 37 °C vorgeheizten 30-fach-Objektiv ausgestattet ist (siehe Materialtabelle).
   1. Stimulieren Sie die Drüse bei 910 nm und detektieren Sie Monodansylpentan und EGFP mit zwei GaAs-Detektoren, wobei 410-460 nm und 495-540 nm Bandpassfilter für blaue bzw. grüne Emissionen verwendet werden.
   2. Erfassen Sie Bilder per Zeilenscan bei 2 μs/Pixel (320 x 320 Pixel; 16 Bit pro Pixel) und speichern Sie sie als OIR-Dateien. Behalten Sie die gescannten Bereiche manuell im Bild bei, indem Sie die X/Y-Drift während des gesamten Bildgebungszyklus korrigieren. Erstellen Sie 3D-Bilder aus Z-Scans mit der Software, die mit dem Mikroskop verknüpft ist.
3. Für die Zwei-Photonen-Mikroskopie der mit Monodansylpentan markierten tdTomato_membr (mT)-Maus (Abbildung 4, Video 4) verwenden Sie ein inverses Mikroskop mit durchstimmbaren Lasern und ein bei 37 °C vorgeheiztes 63-fach-Objektiv (siehe Materialtabelle).
   1. Stimulieren Sie Proben bei 800 nm und 1.060 nm gleichzeitig und detektieren Sie Monodansylpentan mit einem HyD-Hybriddetektor bei einer Emission von 418-471 nm und TdTomato mit einem weiteren HyD-Hybriddetektor bei einer Emission von 595-667 nm.
   2. Sammeln Sie die Bilder per Zeilenscan mit vier Zeilen mit einer Mittelung von 200 Hz (512 x 512 Pixel; 12 Bit pro Pixel) und speichern Sie sie als LIF-Dateien. Behalten Sie die gescannten Bereiche manuell im Bild bei, indem Sie die X/Y-Drift während des gesamten Bildgebungszyklus korrigieren. Erstellen Sie 3D-Bilder aus z-Scans mit der Software, die mit dem Mikroskop verknüpft ist.

5. Euthanasie

1. Die Mäuse werden am Ende der Bildgebung durch CO₂ -Inhalation nach institutionell anerkannten Protokollen eingeschläfert.

6. Erstellung von Echtzeit-Videos

1. Konvertieren Sie Zeitsequenzen in TIFF-Dateien und dann mit geeigneter Software in Videos (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Die quantitative Analyse bestimmter Videos würde den Rahmen dieses Artikels sprengen und erfordert spezifische Methoden zur Lösung spezifischer Probleme. Siehe z.B. Ebrahim et ^al.24 für die Rolle von Actinomyosin-Komplexen bei der Exozytose von Speichel aus der Speicheldrüse, Meyer et ^al.25 für die Dynamik der Gallensekretion aus der Leber und Masedunskas et ^al.9 für die Analyse der LD-Sekretion aus Brustepithelzellen.

Ergebnisse

Milch wird aus polarisierten Alveolarepithelzellen sezerniert, die sich während der Schwangerschaft von den Knospen eines ausgedehnten duktulären Baumes differenzieren²⁶ (Abbildung 2A). Vorläufer für die Milchsynthese werden über basale/laterale Membranen assimiliert und fertige Produkte werden über die apikale Oberfläche in einen zentralen "Milchraum" sezerniert. Die basale Seite jeder Alveole ist von einer sternförmigen Anor...

Diskussion

Ob ein Ein- oder Multiphotonenmikroskop verwendet werden soll, hängt von den gestellten Fragen, der Art und Lage des abzubildenden Gewebes und der erforderlichen Auflösung ab. Multiphotonenmikroskope basieren auf der Erzeugung von zwei oder mehr niederenergetischen Photonen im nahen Infrarot, die Gewebe mit geringerer Phototoxizität in größerer Tiefe durchdringen können als Ein-Photonen-Mikroskope^29,30. Außerdem wird das F...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
488 laser	Melles-Griot	-	CW  laser 50 mW
60x PLAPON oil immersion objective (NA 1.42)	Olympus	1-U2B933	Lens Confocal microscope
633 laser	Melles-Griot	-	CW He-Ne laser 12 mW
63x objective (NA 1.40, HC PL APO CS2)	Leica	11506350	Lens Two-photon microscope
BA 410-460 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 495-540 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 505-605 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 655-755 nm	Chroma	-	Band-pass filter
Boron-dipyrromethane (BODIPY) 665/676	Thermo Fisher Scientific	B3932	Lipid peroxiation sensor
Carbomer-940	Snowdrift Farm	739601480651	Gel
Catheter	Terumo	SV27EL	Winged infusion sets
Cauterizer	Braintree Scientific, Inc	GEM 5917	Cautery system
CMV-Cre mouse	Jackson lab	006054	Mouse line
Coverslip	Bioptechs	-	30mm diameter coverlip for inverted microscope
Curity 4x4 inch all purpose sponge gauze	Covidien	9024	Sponge
EGFPcyto mouse	Jackson lab	003291	Mouse line
Fiji/ImageJ software	Open source	-	Free software tool
Fine forceps	Braintree Scientific, Inc	FC003 8	Tissue forceps
Fluoview 1000 microscope	Olympus	FV1000	Confocal microscope
FluoView software	Olympus	-	Confocal microscope and Two-photon microscope
Hand-held electric razor	Braintree Scientific, Inc	CLP-8786-451A	Cordless clipper
Heat pad	Braintree Scientific, Inc	DPIP	Heat pad for animals
HyD detectors	Leica	-	Leica 4Tune spectral detector
Imaris software	Bitplane / Oxford instruments	-	Commercial software tool
Ingisht X3 tunable laser	Spectra Physics	Insight X3	Tunable Pulse-Laser
Isoflurane	VetOne	13985-046-40	Anesthetic
Ketamine	VetOne	13985-702-10	Anesthetic
LAS X Software	Leica	-	Two-photon microscope software tool
Mai-Tai tunable laser	Spectra Physics	Mai-Tai	Laser
MetaMorph	Molecular Devices	-	Commercial software tool
Monodansylpentane AUTODOT	Abcepta	Sm1000a	Lipid droplet dye
MPE-RS microscope	Olympus	IX70	Two-photon microscope
mT/mG mouse	Jackson lab	007676	Mouse line
Objective heater	Bioptechs	150819	Objective heater for both confocal and two-photon microscopes
Oxygen-saturated respiration chamber	Patterson Scientific	78933385, SAS3 and EVAC4	Gas Anesthesia and evacuation system
Parafilm	Heathrow Scientific	HS234526B	Semi-transparent, flexible, thermoplastic film
PMT detector	Olympus	-	Descanned   detectors
PMT detector	LSM-Technology	Custom built	Non-Descanned Detectors
Pump	Harvard Apparatus	703602, 704402	Nanomite injector and controller
Saline	Quality Biological	114-055-721EA	Normal saline
Sharp blunt-ended scissors	Braintree Scientific, Inc	SCT-S 508	Surgical scissors
Syringe	Covidien	22-257-150	1mL tuberculin syringe
TCS SP8 Dive Spectral microscope	Leica	SP8	Two-photon microscope
Tweezers	Braintree Scientific, Inc	FC032	Tissue forceps
Xylazine	VetOne	13985-704-10	Anesthetic