JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mevcut protokol, lazer taramalı konfokal ve multifoton mikroskobu ile emziren fare meme bezinin intravital görüntülenmesi için kolay bir tekniği tanımlamaktadır.

Özet

Meme bezi, doku yeniden şekillenmesi, hücre polaritesi ve salgı mekanizmaları dahil olmak üzere epitel fonksiyonlarını araştırmak için mükemmel bir model oluşturur. Hamilelik sırasında, bez, bir yağ yastığına gömülü ilkel bir duktal ağaçtan, kolostrum ve sütün oluşumu ve salgılanması için hazırlanmış çok dallı bir alveolar ağa genişler. Doğum sonrası bez, zar kaplı lipid damlacıkları (LD'ler), proteinler, karbonhidratlar, iyonlar ve su dahil olmak üzere yenidoğan sağkalımı için gerekli tüm besinleri sağlar. Laktoz, kazein miselleri ve yağsız süt proteinleri dahil olmak üzere çeşitli süt bileşenleri, alveolar hücreler içinde sentezlenir ve apikal yüzeyde ekzositoz yoluyla veziküllerden salgılanır. LD'ler, kaba endoplazmik retikulumdaki sentez bölgelerinden hücre tepesine taşınır, hücresel zarlarla kaplanır ve benzersiz bir apokrin mekanizması ile salgılanır. Antikorlar ve hormonlar dahil olmak üzere önceden oluşturulmuş diğer bileşenler, transsitoz yoluyla epitelin serozal tarafından süte taşınır. Bu işlemler intravital mikroskopiye uygundur, çünkü meme bezi bir cilt bezidir ve bu nedenle deneysel manipülasyon için doğrudan erişilebilirdir. Bu yazıda, canlı anestezi uygulanmış farelerde LD sekresyonunun kinetiğini in situ olarak, gerçek zamanlı olarak araştırmak için basit bir prosedür anlatılmıştır. Bor-dipirrometen (BODIPY)665/676 veya monodansilpentan, sitoplazmada çözünür EGFP'yi (gelişmiş yeşil floresan proteini) veya EGFP veya tdTomato'ya kaynaşmış zar hedefli bir peptit eksprese eden transgenik farelerin nötr lipid fraksiyonunu etiketlemek için kullanılır. Zar etiketli füzyon proteinleri, hücre yüzeylerinin belirteçleri olarak işlev görür ve lipit boyalar, LD'leri 0.7 μm≥ çözer. Hızlandırılmış görüntüler, 15-25 μm derinliğe kadar standart lazer taramalı konfokal mikroskopi veya dokunun daha derinlerinde görüntüleme için çoklu foton mikroskobu ile kaydedilebilir. Meme bezi, ameliyat boyunca farmakolojik ajanlar veya floresan boyalarla yıkanabilir ve gerektiğinde akut deneysel manipülasyonlar için bir platform sağlar.

Giriş

Fare meme bezinin intravital mikroskobu, kök hücrelerinkökeni ve farklılaşması 1,2, metastatik tümörlerinilerlemesi 3,4,5 ve meme gelişimi ve involüsyonu boyunca duktal makrofajların rolü dahil olmak üzere bir dizi biyolojik olayı analiz etmek için güçlü bir yöntem olarak artan ilgi görmektedir6. İntravital Hücre Altı Mikroskobunun (ISMic)7 geliştirilmesi yoluyla, araştırmalar emzirme 8,9 sırasında membran trafiği ve salgı mekanizmalarına ve miyoepitel hücrelerinin oksitosin aracılı kasılması 9,10'a genişletilmiştir. Bezin cilt ve vücut duvarı arasındaki erişilebilirliğinden yararlanan iki ana yöntem geliştirilmiştir.

İlk yaklaşımda, cilde akrilik veya cam bir pencere yerleştirilir ve metal bir tutma halkası1,3,11 ile sabitlenir. Fareler ameliyatı iyi tolere eder ve aynı hayvanda birkaç hafta boyunca aralıklı olarak çeşitli fenomenler analiz edilebilir. Bu yöntemin özellikle soy takibi 1,12 ve meme tümörlerinin invazyonunu ve ilerlemesini yerinde izlemek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır 3,11. Bununla birlikte, tüm hücre seviyesinin altındaki çözünürlüğün zor olduğu kanıtlanmıştır, çünkü bez hala vücut duvarına bağlıdır ve bu nedenle solunum ve kalp atışının neden olduğu hareket artefaktlarına maruz kalır.

İkinci yaklaşımda, bez cerrahi olarak sağlam damar sistemine sahip bir deri flebi üzerinde maruz bırakılır veara parçalar 4,9,13 ile mikroskop aşamasında stabilize edilir. Böylece bezin bir kısmı karın duvarından etkili bir şekilde ayrılır ve hareket artefaktları en aza indirilir. Çoğu durumda, açıkta kalan parankim, fare ventral tarafı aşağı bakacak şekilde ters çevrilmiş bir mikroskop üzerinde doğrudan lamel üzerine yerleştirilir. Yakın zamanda yapılan bir modifikasyonda, fare dik bir mikroskop üzerine sırtüstü yatırıldı ve açıkta kalan bez, bir lamel2 ile kapatılmış sıvı dolu bir hücrede korundu. Bu ikinci konfigürasyon, görüntüleme sırasında deneysel manipülasyon için parankimal yüzeye erişim sağlar. Her iki durumda da <1 μm'ye kadar olan çözünürlük, meme epitel hücrelerinde9 lipid damlacıklarının (LD'ler) izlenmesiyle örneklendiği gibi hücre içi süreçlerin analizine izin verir.

Bu protokol, örnek olarak laktasyon sırasında LD'lerin biyogenezi, taşınması ve salgılanması kullanılarak meme epitel hücrelerinin hücre altı düzeyde intravital görüntülenmesi için kolay bir yöntemi detaylandırmaktadır. Bu yaklaşım, süt proteinlerinin14 taşınması ve salgılanması, proteinlerin epitelin serozal tarafından alveolar lümene 15,16 transsitozu ve involüsyon 17,18 sırasında bezin yeniden şekillenmesi dahil olmak üzere diğer birçok işleme yaygın olarak uygulanabilir.

Bir floresan proteini eksprese eden fareler, görüntüleme için uygun alanların seçimini kolaylaştırmak ve morfolojik bir referans belirteç olarak çoğu intravital deney için tercih edilir. Hücresel bölmelerde, hücre iskeleti elemanlarında, zarlarda ve organellerde floresan protein belirteçlerini eksprese eden çok çeşitli uygun transgenik ve knock-in fareler mevcuttur19. Verilen örneklerde, gelişmiş yeşil floresan proteinin (EGFP) çoğu hücrede20 (EGFPsitosu olarak gösterilir) sitoplazmaya hedeflendiği EGFPcyto FvB faresi ve tdTomato ve EGFP genlerini kodlayan bir çift floresan Cre çizgisi olan C57BL/6J Domates (m T/mG) faresi21 kullanılmıştır. EGFP ekspresyonu, tdTomato geninin Cre aracılı eksizyonu ile sağlanır. Her iki florofor da MARCKS proteini21'den türetilen bir sekasyon yoluyla çoğu hücrede plazma zarını hedef alır. Bu çalışmada, kırmızı tdTomato floroforunu eksprese eden fareler tdTomatomembr (mT) ve tdTomato geninin eksizyonundan sonra EGFP'yi eksprese eden fareler EGFPmembr (mG) ile gösterilir.

Farelerde ventral orta hattın her iki tarafında, üçü torasik bölgede (1-3 numaralı) ve ikisi kasık bölgesinde (4-5 numaralı) olmak üzere beş çift meme bezi bulunur (Şekil 1A). ISMic için kasık bezleri, göğüs kafesindeki solunum ve kalp atışı ile ilişkili küresel hareketlerden en uzakta oldukları için en erişilebilir ve stabilize edilmesi en kolay olanlardır.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, ABD Ulusal Araştırma Konseyi'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu, ABD Halk Sağlığı Servisi'nin Laboratuvar Hayvanlarının İnsani Bakımı ve Kullanımı Politikası'na uygun olarak Kanser Araştırmaları Merkezi, Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu. Bu çalışma için, dişi primipar farelerin (4-5 aylık yaş, laktasyonun 10. günü) 4 numaralı bezleri sağ sırtüstü pozisyonda cerrahi olarak hazırlandı (Şekil 1A).

1. Hayvan hazırlama

  1. Gerekli anestezik miktarını hesaplamak için fareyi üstten yüklemeli bir terazide tartın.
  2. Anestezik uygulama sırasında ve sonrasında, fareyi bir ısıtma pedi üzerine yerleştirerek vücut ısısını koruyun.
  3. Oksijene doymuş bir solunum odasında (bkz. Malzeme Tablosu) 1-2 dakika boyunca izoflurana (% 3.0 -% 3.5) kısa süre maruz bırakarak fareyi uyuşturun, ardından 100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin karışımının intraperitoneal enjeksiyonu yapın.
  4. Hem ameliyat hem de görüntüleme sırasında hayvanları derin bir anestezi düzlemi altında tutun, titre edilmiş ksilazin ve ketamin dozlarını (adım 1.3'te belirtilen başlangıç dozunun yarısı ila dörtte biri) kalıcı bir kateter yoluyla (bkz. adım 3.4) her 45 dakikada bir, gerektiği gibi.
    NOT: Optimal bir anestezi düzlemi, her 10-20 dakikada bir palpebral ve ayak parmağı sıkışma reflekslerini kontrol ederek en kolay şekilde korunur. Bilinçli farelerin sıcaklığı 36.5-38 °C'dir ve anestezi altında 34.5 °C'ye düşer.
  5. Benzer bir laktasyon aşamasında donör fareler mevcutsa, yavruları22 çapraz besleyin; Aksi takdirde, çöpü ötenazi yapın.
    NOT: 10 günlük yavru2 inhalasyonu ve ardından servikal çıkık yoluyla ötenazi yapılmalıdır.

2. Cerrahi prosedür

  1. Ameliyat boyunca fareyi bir ısıtma pedi üzerinde sıcak tutun. Elde tutulan bir elektrikli tıraş bıçağı kullanarak 4 ve 5 numaralı meme bezlerini (sırtüstü, sağ taraf) çevreleyen deriden kürkü tıraş edin. Traş edilen alanı üç alternatif betadin ve alkol ovma ile temizleyin.
  2. Tüm cerrahi aletleri% 70 alkol ile silin. Dördüncü meme ucuna yakın ~1 cm'lik orta hat kesisi yapın, cildi cımbızla sıkıştırın ve kabarık cildi keskin bir makasla kesin. Bezin etrafında hem kraniyal hem de kaudal yönlerde dairesel kesiler yapın ve cildi karından dikkatlice soyun. Maruz kalan cildi fizyolojik tuzlu su ile nemli tutun.
  3. Kan kaybını en aza indirmek için, belirgin kan damarlarını kesmeden önce elde tutulan bir koterizer ( Malzeme Tablosuna bakın) ile kapatın. Herhangi bir eksojen kan, daha sonra optik çözünürlük kaybını önlemek için fizyolojik salin ile derhal çıkarılmalıdır.
  4. Yüzey tabakasını ince forseps ile nazikçe alay ederek yüzeysel bağ ve yağ dokusunu çıkarın.
  5. Açıkta kalan bezi fizyolojik tuzlu su ile nemli tutun ve karın duvarını jel ve yarı şeffaf, esnek, termoplastik film ile koruyun (bkz.
    NOT: Adım 2.2-2.5, bezin bir kısmı ve ilişkili damar sistemi karın duvarından ayrılmış bir cilt flebi oluşturur (Şekil 1Bi-iv).
  6. Gerekirse, bezi dışsal ajanlarla, örneğin farmakolojik ajanlar veya organele özgü boyalarla, ameliyat sırasında açıkta kalan bezi yıkayarak tedavi edin.
    NOT: Verilen örneklerde, bir EGFPsito veya EGFPmembr (mG) faresindeki LD'ler, 1.0 mL bor-dipirrometen (BODIPY)665/676 (tuzlu suda 1 ila 1.000 kat seyreltilmiş dimetil sülfoksit içinde 10 mM stok çözeltisi ile etiketlendi ve <1 saat) ve tdTomatomembr (mT) veya EGFPmembr (mG) farede, 0.5 mL monodansilpentan23 ile (dimetil sülfoksit içinde 0.1M stok çözeltisi, tuzlu suda 1 ila 1.000 kat seyreltilir ve 5 dakika boyunca uygulanır).

3. Görüntüleme hazırlığı

  1. Fareyi, karın tarafı aşağı bakacak şekilde, cilt flebi merkezi kapak camına (37 mm) uzanacak şekilde ısıtılmış (30 °C) ters çevrilmiş bir mikroskop aşamasına dikkatlice yerleştirin (Şekil 1Biv). Açıkta kalan alanları ince bir jel tabakası ile koruyun.
  2. Bezi solunum ve kalp atışının neden olduğu hareket artefaktlarından korumak için cilt flebini özel yapım ara parçalarla stabilize edin. Bunu başarmak için, deri kanadı ile gövde duvarı arasına üç bantlanmış pamuklu çubuktan (Şekil 1Ci) yapılmış çentikli bir ara parça yerleştirin ve arka bacağı ve kuyruğu ara parçanın arkasındaki sahneye bantlayın (Şekil 1Bv).
  3. Sahne açıklığının her iki ucuna plastik bir kapağı (Şekil 1Cii) güvenli bir şekilde bantlayarak görüntüleme sırasında cilt flebinin kaymasını önleyin (Şekil 1Bv).
  4. Bir tüpe, şırıngaya ve pompaya bağlı sırt derisinin altına deri altı kalıcı bir kateter yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
  5. Konvansiyonel floresan mikroskobu ile deri flebinin yeterli kan akışı ile stabil olduğunu doğrulayın (Şekil 1Bvi).
  6. Görüntüleme sırasında sıcak tutmak için fareyi sünger gazlı bezle örtün ( Malzeme Tablosuna bakın),
    NOT: Adım 3.1-3.5, nicel analize uygun yüksek çözünürlüklü videoların elde edilmesini sağlamada en kritik olanlardır. Doku stabilitesi doğrulanmadan bu aşamanın ötesine geçmenin bir anlamı yoktur.

4. Mikroskopi

  1. BODIPY665/676 (Şekil 2, Video 1 ve Video 2) ile etiketlenmiş EGFPcyto veya EGFPmembr (mG) farenin konvansiyonel konfokal mikroskobu için, 37 °C'de tutulan, önceden ısıtılmış 60x yağa daldırma objektifi ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın (bkz.
    1. Sırasıyla 488 ve 633 lazer kullanarak EGFP ve BODIPY665/676'yı ayrı ayrı tespit edin; EGFP için, uyarma 488 nm ve emisyon 560 nm, bant geçiren filtre BA 505-605 ile; BODIPY665/676 için, uyarma 633 nm ve emisyon 668 nm, bant geçiren filtre BA 655-755 ile.
    2. 1-2 saat boyunca her 5 saniyede veya 10 saniyede bir 4 veya 8 μs/piksel (512 x 512 piksel; piksel başına 12 bit) hızında satır taraması ile görüntüleri toplayın ve TIFF dosyaları olarak saklayın. Görüntüleme döngüsü boyunca x/y kaymasını düzelterek taranan alanları çerçeve içinde manuel olarak koruyun. Mikroskopla ilişkili yazılımı kullanarak z-taramalarından 3 boyutlu görüntüler oluşturun (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. Monodansilpentan ile etiketlenmiş EGFPmembr (mG) farenin iki foton mikroskobu için (Şekil 3, Video 3), ayarlanabilir bir lazer ve 37 °C önceden ısıtılmış 30x objektif ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın (bkz.
    1. Raperi 910 nm'de uyarın ve mavi ve yeşil emisyonlar için sırasıyla 410-460 nm ve 495-540 nm bant geçiren filtreler kullanarak iki GaAs dedektörü ile monodansilpentan ve EGFP'yi tespit edin.
    2. Görüntüleri 2 μs/piksel (320 x 320 piksel; piksel başına 16 bit) hızında satır taraması ile toplayın ve bunları OIR dosyaları olarak saklayın. Görüntüleme döngüsü boyunca x/y kaymasını düzelterek taranan alanları çerçeve içinde manuel olarak koruyun. Mikroskopla ilişkili yazılımı kullanarak z-taramalarından 3 boyutlu görüntüler oluşturun.
  3. Monodansilpentan ile etiketlenmiş tdTomatomembr (mT) farenin iki foton mikroskobu için (Şekil 4, Video 4), ayarlanabilir lazerlerle ters çevrilmiş bir mikroskop ve 37 °C önceden ısıtılmış 63x objektif kullanın (bkz.
    1. Numuneleri aynı anda 800 nm ve 1.060 nm'de uyarın ve 418-471 nm emisyonuna ayarlanmış bir HyD hibrit dedektör ile monodansipentanı ve 595-667 nm emisyonuna ayarlanmış başka bir HyD hibrit dedektör ile TdTomato'yu tespit edin.
    2. Görüntüleri, ortalama 200 Hz'de (512 x 512 piksel; piksel başına 12 bit) dört satırla satır taraması yaparak toplayın ve bunları LIF dosyaları olarak saklayın. Görüntüleme döngüsü boyunca x/y kaymasını düzelterek taranan alanları çerçeve içinde manuel olarak koruyun. Mikroskopla ilişkili yazılımı kullanarak z taramalarından 3 boyutlu görüntüler oluşturun.

5. Ötenazi

  1. Görüntülemenin sonunda fareleri CO2 soluma yoluyla kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek ötenazi yapın.

6. Gerçek zamanlı videoların oluşturulması

  1. Zaman dizilerini TIFF dosyalarına dönüştürün ve ardından uygun yazılımı kullanarak videolara dönüştürün (bkz.
    NOT: Belirli videoların nicel analizi bu yazının kapsamı dışındadır ve belirli sorunların çözümü için özel yöntemler gerektirecektir. Örneğin, tükürük bezinden tükürüğün ekzositozunda aktinomiyozin komplekslerinin rolü için Ebrahim ve ark.24'e , karaciğerden safra sekresyonunun dinamikleri için Meyer ve ark.25'e ve meme epitel hücrelerinden LD sekresyonunun analizi için Masedunskas ve ark.9'a bakınız.

Sonuçlar

Süt, polarize alveolar epitel hücrelerinden salgılanır ve bu hücreler hamilelik sırasında geniş bir duküler ağacıntomurcuklarından farklılaşır 26 (Şekil 2A). Süt sentezi için öncüler, bazal / lateral membranlar boyunca asimile edilir ve tamamlanmış ürünler apikal yüzey boyunca merkezi bir "süt alanına" salgılanır. Her alveolün bazal tarafı, serozal tarafta bir bazal membran ile korunan (

Tartışmalar

Tek veya çok fotonlu mikroskobun kullanılıp kullanılmayacağı, sorulan sorulara, görüntülenecek dokunun doğasına ve konumuna ve gereken çözünürlüğe bağlıdır. Çoklu foton mikroskopları, yakın kızılötesinde, tek fotonlu mikroskoplardan daha az fototoksisite ile dokulara daha fazla derinliğe nüfuz edebilen iki veya daha fazla düşük enerjili foton üretmeye dayanır29,30. Ek olarak, florofor sadece odak ...

Açıklamalar

Yazarların hiçbirinin beyan edecek çatışan çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, hayvan yönetimi ve bakımı için Sherry Rausch ve Samri Gebre'ye (Ulusal Kanser Enstitüsü, NIH) ve bir dizi plastik ara parça üretmedeki yardımları için James Mather'e teşekkür eder. Bu araştırma [kısmen] NIH'nin Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
488 laserMelles-Griot-CW  laser 50 mW
60x PLAPON oil immersion objective (NA 1.42)Olympus1-U2B933Lens Confocal microscope
633 laserMelles-Griot-CW He-Ne laser 12 mW
63x objective (NA 1.40, HC PL APO CS2)Leica11506350Lens Two-photon microscope
BA 410-460 nmChroma-Band-pass filter
BA 495-540 nmChroma-Band-pass filter
BA 505-605 nmChroma-Band-pass filter
BA 655-755 nmChroma-Band-pass filter
Boron-dipyrromethane (BODIPY) 665/676Thermo Fisher ScientificB3932Lipid peroxiation sensor
Carbomer-940Snowdrift Farm739601480651Gel
CatheterTerumoSV27ELWinged infusion sets 
Cauterizer Braintree Scientific, IncGEM 5917Cautery system
CMV-Cre mouse Jackson lab006054Mouse line
CoverslipBioptechs-30mm diameter coverlip for inverted microscope
Curity 4x4 inch all purpose sponge gauzeCovidien9024Sponge
EGFPcyto mouseJackson lab003291Mouse line
Fiji/ImageJ softwareOpen source-Free software tool
Fine forcepsBraintree Scientific, IncFC003 8Tissue forceps
Fluoview 1000 microscopeOlympusFV1000Confocal microscope
FluoView softwareOlympus-Confocal microscope and Two-photon microscope
Hand-held electric razorBraintree Scientific, IncCLP-8786-451ACordless clipper
Heat padBraintree Scientific, IncDPIPHeat pad for animals
HyD detectorsLeica-Leica 4Tune spectral detector
Imaris softwareBitplane / Oxford instruments-Commercial software tool
Ingisht X3 tunable laserSpectra PhysicsInsight X3Tunable Pulse-Laser
IsofluraneVetOne13985-046-40Anesthetic
Ketamine VetOne13985-702-10Anesthetic
LAS X SoftwareLeica-Two-photon microscope software tool
Mai-Tai tunable laserSpectra PhysicsMai-TaiLaser
MetaMorphMolecular Devices-Commercial software tool
Monodansylpentane AUTODOTAbceptaSm1000aLipid droplet dye
MPE-RS microscopeOlympusIX70Two-photon microscope
mT/mG mouseJackson lab007676Mouse line
Objective heaterBioptechs150819Objective heater for both confocal and two-photon microscopes
Oxygen-saturated respiration chamberPatterson Scientific78933385, SAS3 and EVAC4Gas Anesthesia and evacuation system 
ParafilmHeathrow ScientificHS234526BSemi-transparent, flexible, thermoplastic film
PMT detectorOlympus-Descanned   detectors
PMT detectorLSM-TechnologyCustom builtNon-Descanned Detectors
PumpHarvard Apparatus703602, 704402Nanomite injector and controller
SalineQuality Biological114-055-721EANormal saline
Sharp blunt-ended scissorsBraintree Scientific, IncSCT-S 508Surgical scissors
SyringeCovidien22-257-1501mL tuberculin syringe
TCS SP8 Dive Spectral microscopeLeicaSP8Two-photon microscope
Tweezers Braintree Scientific, IncFC032Tissue forceps
Xylazine VetOne13985-704-10Anesthetic

Referanslar

  1. Scheele, C. L. G. J., et al. Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis. Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).
  2. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  3. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  4. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2011).
  5. Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nature Reviews Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  6. Dawson, C. A., et al. Tissue-resident ductal macrophages survey the mammary epithelium and facilitate tissue remodelling. Nature Cell Biology. 22 (5), 546-558 (2020).
  7. Ebrahim, S., Weigert, R. Intravital microscopy in mammalian multicellular organisms. Current Opinion in Cell Biology. 59, 97-103 (2019).
  8. Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H., Weigert, R. . Advances in Intravital Microscopy. , 187-204 (2014).
  9. Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).
  10. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally-mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  11. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).
  12. Zomer, A., et al. Brief report: Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).
  13. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  14. Burgoyne, R. D., Duncan, J. S. Secretion of milk proteins. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (3), 275-286 (1998).
  15. Monks, J., Neville, M. C. Albumin transcytosis across the epithelium of the lactating mouse mammary gland. Journal of Physiology London. 560, 267-280 (2004).
  16. Boisgard, R., Chanat, E., Lavialle, F., Pauloin, A., Ollivier-Bousquet, M. Roads taken by milk proteins in mammary epithelial cells. Livestock Production Science. 70 (1-2), 49-61 (2001).
  17. Green, K. A., Lund, L. R. ECM degrading proteases and tissue remodelling in the mammary gland. Bioessays. 27 (9), 894-903 (2005).
  18. Lund, L. R., et al. Two distinct phases of apoptosis in mammary gland involution: proteinase-independent and -dependent pathways. Development. 122 (1), 181-193 (1996).
  19. Abe, T., Fujimori, T. Reporter mouse lines for fluorescence imaging. Develoment Growth and Differentiation. 55 (4), 390-405 (2013).
  20. Hadjantonakis, A. K., Gertsenstein, M., Ikawa, M., Okabe, M., Nagy, A. Generating green fluorescent mice by germline transmission of green fluorescent ES cells. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 79-90 (1998).
  21. Mazumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  22. Fostering litters. The Jackson Laboratory Available from: https://www.jax.org/jax-mice-and-services/customer-support/technical-support/breeding-and-husbandry-support/general-husbandry-tips (2022)
  23. Yang, H. -. J., Hsu, C. -. L., Yang, J. -. Y., Yang, W. -. Y. Monodansylpentane as a blue-fluorescent lipid-droplet marker for multi-color live-cell imaging. PloS One. 7 (3), 32693 (2012).
  24. Ebrahim, S., et al. Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice. Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).
  25. Meyer, K., et al. A predictive 3D multi-scale model of biliary fluid dynamics in the liver lobule. Cell Systems. 4 (3), 277-290 (2017).
  26. Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
  27. Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion. Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).
  28. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Enhanced diffusion in active intracellular transport. Physical Review Letters. 85, 5655-5658 (2000).
  29. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  30. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: Ready for prime time. Journal of Cell Biology. 201 (7), 969-979 (2013).
  31. So, P. T. C. Two-photon fluorescence light microscopy. Encyclopedia of Life Sciences. , 1-5 (2002).
  32. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
  33. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
  34. Nishinakagawa, H., Mochizuki, K., Nishida, S. On the blood supply to the mammary glands of the mouse, rat, hamster and guinea-pig. Japanese Journal of Zoological Science. 39 (7), 283-291 (1968).
  35. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086 (2014).
  36. Palade, G. Intracellular aspects of the process of protein synthesis. Science. 189 (4200), 347-358 (1975).
  37. Heald, C. W., Saacke, R. G. Cytological comparison of milk protein synthesis of rat mammary tissue in vivo and in vitro. Journal of Dairy Science. 55 (5), 621-628 (1972).
  38. Hunziker, W., Kraehenbuhl, J. P. Epithelial transcytosis of immunoglobulins. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (3), 287-302 (1998).
  39. Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. An intravital microscopy toolbox to study mammary gland dynamics from cellular level to organ scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
  40. Teter, B. B., Sampugna, J., Keeney, M. Milk fat depression in C57Bl/6J mice consuming partially hydrogenated fat. Journal of Nutrition. 120 (8), 818-824 (1990).
  41. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler ntravital mikroskopimeme beziepitel fonksiyonlardoku yeniden ekillenmesih cre polaritesisalg mekanizmalargebeliklaktasyonlipid damlac klarekzositoztranssitozBODIPYEGFPTdTomatokonfokal mikroskopimultifoton mikroskobu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır