Microscopia subcellulare intravitale della ghiandola mammaria

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una tecnica semplice per l'imaging intravitale della ghiandola mammaria del topo in allattamento mediante microscopia confocale e multifotonica a scansione laser.

Abstract

La ghiandola mammaria costituisce un modello per eccellenza per lo studio delle funzioni epiteliali, tra cui il rimodellamento dei tessuti, la polarità cellulare e i meccanismi secretori. Durante la gravidanza, la ghiandola si espande da un albero duttale primitivo incorporato in un cuscinetto adiposo a una rete alveolare altamente ramificata innescata per la formazione e la secrezione di colostro e latte. Dopo il parto, la ghiandola fornisce tutti i nutrienti necessari per la sopravvivenza neonatale, comprese le goccioline lipidiche rivestite di membrana (LD), le proteine, i carboidrati, gli ioni e l'acqua. Vari componenti del latte, tra cui il lattosio, le micelle di caseina e le proteine del latte scremato, sono sintetizzati all'interno delle cellule alveolari e secreti dalle vescicole per esocitosi sulla superficie apicale. Le LD vengono trasportate dai siti di sintesi nel reticolo endoplasmatico ruvido all'apice cellulare, rivestite di membrane cellulari e secrete da un meccanismo apocrino unico. Altri costituenti preformati, inclusi anticorpi e ormoni, vengono trasportati dal lato sieroso dell'epitelio nel latte mediante transcitosi. Questi processi sono suscettibili di microscopia intravitale perché la ghiandola mammaria è una ghiandola cutanea e, quindi, direttamente accessibile alla manipolazione sperimentale. In questo articolo, viene descritta una procedura semplice per studiare la cinetica della secrezione di LD in situ, in tempo reale, in topi vivi anestetizzati. Il boro-dipirrometene (BODIPY)_665/676 o il monodansilpentano sono utilizzati per marcare la frazione lipidica neutra dei topi transgenici, che esprimono EGFP solubile (proteina fluorescente verde potenziata) nel citoplasma o un peptide mirato alla membrana fuso con EGFP o tdTomato. Le proteine di fusione marcate con membrana fungono da marcatori delle superfici cellulari e i coloranti lipidici risolvono le LD ≥ 0,7 μm. Le immagini time-lapse possono essere registrate con la microscopia confocale a scansione laser standard fino a una profondità di 15-25 μm o con la microscopia multifotone per l'imaging più profondo nel tessuto. La ghiandola mammaria può essere bagnata con agenti farmacologici o coloranti fluorescenti durante l'intervento chirurgico, fornendo una piattaforma per manipolazioni sperimentali acute secondo necessità.

Introduzione

La microscopia intravitale della ghiandola mammaria di topo sta attirando sempre più attenzione come metodo potente per analizzare un'intera gamma di fenomeni biologici, tra cui l'origine e la differenziazione delle cellule staminali ^1,2, la progressione dei tumori metastatici ^3,4,5 e il ruolo dei macrofagi duttali durante lo sviluppo e l'involuzione mammaria⁶. Attraverso lo sviluppo della microscopia subcellulare intravitale (ISMic)⁷, le indagini sono state estese al traffico di membrana e ai meccanismi secretori durante l'allattamento ^8,9 e alla contrazione mediata dall'ossitocina delle cellule mioepiteliali ^9,10. Sono stati sviluppati due metodi principali che sfruttano l'accessibilità della ghiandola tra la pelle e la parete corporea.

Nel primo approccio, una finestra in acrilico o vetro viene inserita nella pelle e fissata con un anello di ritegno metallico ^1,3,11. I topi tollerano bene l'intervento chirurgico e vari fenomeni possono essere analizzati su base intermittente nello stesso animale per diverse settimane. Questo metodo si è dimostrato particolarmente utile per il tracciamento del lignaggio ^1,12 e il monitoraggio dell'invasione e della progressione dei tumori mammari in situ ^3,11. Tuttavia, la risoluzione al di sotto del livello dell'intera cellula si è rivelata difficile perché la ghiandola è ancora attaccata alla parete corporea ed è quindi soggetta ad artefatti di movimento causati dalla respirazione e dal battito cardiaco.

Nel secondo approccio, la ghiandola viene esposta chirurgicamente su un lembo cutaneo con vascolarizzazione intatta e stabilizzata sul tavolino del microscopio con distanziatori ^4,9,13. Una parte della ghiandola viene quindi efficacemente separata dalla parete addominale e gli artefatti di movimento sono ridotti al minimo. Nella maggior parte dei casi, il parenchima esposto viene posizionato direttamente sul vetrino coprioggetti con il lato ventrale del topo rivolto verso il basso su un microscopio invertito. In una recente modifica, il topo è stato posto supino su un microscopio verticale e la ghiandola esposta è stata protetta in una cella piena di liquido sigillata con un vetrino coprioggetti². Quest'ultima configurazione consente l'accesso alla superficie parenchimale per la manipolazione sperimentale durante l'imaging. La risoluzione fino a <1 μm, in entrambi i casi, consente l'analisi dei processi intracellulari, come esemplificato dal tracciamento delle goccioline lipidiche (LD) nelle cellule epiteliali mammarie⁹.

Il presente protocollo descrive un metodo semplice per l'imaging intravitale di cellule epiteliali mammarie a livello subcellulare utilizzando come esempio la biogenesi, il trasporto e la secrezione di LD durante l'allattamento. Questo approccio è ampiamente applicabile a molti altri processi, tra cui il trasporto e la secrezione delle proteine del latte¹⁴, la transcitosi delle proteine dal lato sieroso dell'epitelio al lume alveolare^15,16 e il rimodellamento della ghiandola durante l'involuzione^17,18.

I topi che esprimono una proteina fluorescente sono preferiti per la maggior parte degli esperimenti intravitali per facilitare la selezione di aree appropriate per l'imaging e come marcatore di riferimento morfologico. È disponibile un'ampia gamma di topi transgenici e knock-in adatti, che esprimono marcatori proteici fluorescenti nei compartimenti cellulari, negli elementi del citoscheletro, nelle membrane e negli organelli¹⁹. Negli esempi forniti, è stato utilizzato il topo EGFP_cyto FvB, in cui la proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) è mirata al citoplasma nella maggior parte delle cellule²⁰ (indicata con_{EGFP cito}), e il topo C57BL/6J Tomato (mT/mG)²¹, che è una doppia linea Cre fluorescente che codifica per i geni tdTomato e EGFP. L'espressione di EGFP è abilitata attraverso l'escissione mediata da Cre del gene tdTomato. Entrambi i fluorofori sono mirati alla membrana plasmatica nella maggior parte delle cellule attraverso un sequon derivato dalla proteina MARCKS²¹. In questo lavoro, i topi che esprimono il fluoroforo rosso tdTomato sono denotati tdTomato_membr (mT), e i topi che esprimono EGFP, dopo l'escissione del gene tdTomato sono denotati EGFP_membr (mG).

I topi hanno cinque paia di ghiandole mammarie su entrambi i lati della linea mediana ventrale, tre nella regione toracica (numerate 1-3) e due nella regione inguinale (numerate 4-5) (Figura 1A). Per l'ISMic, le ghiandole inguinali sono le più accessibili e facili da stabilizzare, in quanto sono le più lontane dai movimenti globali associati alla respirazione e al battito cardiaco nel torace.

Protocollo

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Center for Cancer Research, del National Cancer Institute, del National Institutes of Health in conformità con la Guida del National Research Council degli Stati Uniti per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, la politica del servizio sanitario pubblico degli Stati Uniti sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio, e la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Per questo lavoro, le ghiandole numero 4 di topi primipare femmine (di età compresa tra 4 e 5 mesi, 10° giorno di lattazione) sono state preparate chirurgicamente in posizione supina destra (Figura 1A).

1. Preparazione degli animali

1. Pesare il mouse su una bilancia a caricamento dall'alto per calcolare la quantità di anestetico necessaria.
2. Durante e dopo l'applicazione di anestetici, mantenere la temperatura corporea posizionando il mouse su un tappetino riscaldante.
3. Anestetizzare il topo mediante una breve esposizione all'isoflurano (3,0%-3,5%) in una camera di respirazione satura di ossigeno (vedere Tabella dei materiali) per 1-2 minuti, seguita da un'iniezione intraperitoneale di una miscela di 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina.
4. Mantenere gli animali sotto un piano profondo di anestesia sia durante l'intervento chirurgico che durante l'imaging applicando ulteriormente dosi titolate di xilazina e ketamina (da metà a un quarto della dose iniziale descritta al punto 1.3) attraverso un catetere a permanenza (vedere passaggio 3.4) ogni 45 minuti circa, come richiesto.
   NOTA: Un piano ottimale di anestesia è più facilmente mantenuto controllando i riflessi palpebrali e di pizzicamento delle dita dei piedi ogni 10-20 minuti. La temperatura dei topi coscienti è di 36,5-38 °C, che scende a 34,5 °C in anestesia.
5. Incrociare i cuccioli²² se sono disponibili topi donatori in una fase simile dell'allattamento; in caso contrario, sopprimere la cucciolata.
   NOTA: I cuccioli di età <10 giorni devono essere soppressi mediante esposizione a isoflurano al 3,0% seguito da decapitazione. I cuccioli di ≥10 giorni di età devono essere soppressi tramite inalazione di CO₂ seguita da lussazione cervicale.

2. Procedura chirurgica

1. Mantieni il mouse caldo durante l'intervento chirurgico su un cuscinetto riscaldante. Radere il pelo dalla pelle che circonda le ghiandole mammarie numero 4 e 5 (supina, lato destro) utilizzando un rasoio elettrico portatile. Pulisci la zona rasata con tre scrub alternati a betadina e alcol.
2. Pulire tutti gli strumenti chirurgici con alcool al 70%. Fai un'incisione sulla linea mediana di ~ 1 cm vicino al quarto capezzolo pizzicando la pelle con una pinzetta e tagliando la pelle sollevata con forbici affilate. Praticare incisioni circolari attorno alla ghiandola in entrambe le direzioni cranica e caudale e staccare con cura la pelle dall'addome. Mantenere la pelle esposta umida con soluzione fisiologica.
3. Per ridurre al minimo la perdita di sangue, sigillare tutti i vasi sanguigni prominenti con un cauterizzatore portatile (vedere Tabella dei materiali) prima di tagliarli. L'eventuale sangue esogeno deve essere prontamente rimosso con soluzione fisiologica per evitare la successiva perdita di risoluzione ottica.
4. Rimuovere il tessuto connettivo e adiposo superficiale stuzzicando delicatamente lo strato superficiale con una pinza fine.
5. Mantenere umida la ghiandola esposta con soluzione fisiologica e proteggere la parete addominale con gel e pellicola termoplastica semitrasparente, flessibile (vedi Tabella dei Materiali).
   NOTA: I passaggi 2.2-2.5 creano un lembo di pelle con una porzione della ghiandola e del sistema vascolare associato separati dalla parete addominale (Figura 1Bi-iv).
6. Se necessario, trattare la ghiandola con agenti esogeni, ad esempio agenti farmacologici o coloranti specifici per organelli, bagnando la ghiandola esposta durante l'intervento chirurgico.
   NOTA: Negli esempi forniti, le LD in un topo_{EGFP cyto} o EGFP_membr (mG) sono state marcate con 1,0 mL di boro-dipirromete (BODIPY) _665/676 (10 mM di soluzione madre in dimetilsolfossido diluito da 1 a 1.000 volte in soluzione salina e applicato per <1 h) e nel topo tdTomato_membr (mT) o EGFP_membr (mG), con 0,5 mL di monodansilpentano²³ (soluzione madre 0,1M in dimetilsolfossido diluito da 1 a 1.000 volte in soluzione fisiologica e applicato per 5 minuti).

3. Preparazione dell'imaging

1. Posizionare con cautela il mouse con il lato addominale rivolto verso il basso su un tavolino per microscopio invertito riscaldato (37 °C), in modo che il lembo cutaneo si estenda sul vetro di copertura centrale (30 mm) (Figura 1Biv). Proteggere le aree esposte con un sottile strato di gel.
2. Stabilizza il lembo cutaneo con distanziatori su misura per attutire la ghiandola dagli artefatti di movimento causati dalla respirazione e dal battito cardiaco. Per ottenere ciò, posizionare un distanziatore dentellato costituito da tre bastoncini di cotone nastrati (Figura 1Ci) tra il lembo di pelle e la parete del corpo e fissare la zampa posteriore e la coda al tavolino dietro il distanziatore (Figura 1Bv).
3. Evitare che il lembo cutaneo scivoli durante l'imaging fissando saldamente una copertura di plastica (Figura 1Cii) su entrambe le estremità dell'apertura del tavolino (Figura 1Bv).
4. Inserire un catetere a permanenza sottocutaneo sotto la cute dorsale collegato a un tubo, una siringa e una pompa (vedere Tabella dei materiali).
5. Confermare che il lembo cutaneo sia stabile con un flusso sanguigno adeguato mediante microscopia a fluorescenza convenzionale (Figura 1Bvi).
6. Coprire il mouse con una garza di spugna (vedi Tabella dei materiali) per tenerlo al caldo durante l'imaging,
   NOTA: I passaggi 3.1-3.5 sono i più critici per garantire l'acquisizione di video ad alta risoluzione adatti all'analisi quantitativa. Non ha senso procedere oltre questa fase a meno che la stabilità dei tessuti non sia stata confermata.

4. Microscopia

1. Per la microscopia confocale convenzionale del topo EGFP_cyto o_{EGFP membr} (mG) marcato con BODIPY_665/676 (Figura 2, Video 1 e Video 2), utilizzare un microscopio invertito dotato di un obiettivo a immersione in olio 60x preriscaldato, mantenuto a 37 °C (vedere la Tabella dei materiali).
   1. Rilevare separatamente EGFP e BODIPY_665/676 utilizzando rispettivamente i laser 488 e 633; per EGFP, eccitazione 488 nm ed emissione 560 nm, con filtro passa-banda BA 505-605; per BODIPY_665/676, eccitazione 633 nm ed emissione 668 nm, con filtro passa-banda BA 655-755.
   2. Raccogli le immagini mediante scansione lineare a 4 o 8 μs/pixel (512 x 512 pixel; 12 bit per pixel) ogni 5 s o 10 s per 1-2 h e memorizzale come file TIFF. Mantenere manualmente le aree scansionate all'interno dell'inquadratura correggendo la deriva x/y durante il ciclo di imaging. Costruisci immagini 3D da z-scan utilizzando il software associato al microscopio (vedi Tabella dei materiali).
2. Per la microscopia a due fotoni del topo_{EGFP membr} (mG) marcato con monodansilpentano (Figura 3, Video 3), utilizzare un microscopio invertito dotato di un laser sintonizzabile e di un obiettivo 30x preriscaldato a 37 °C (vedere la Tabella dei materiali).
   1. Eccitare la ghiandola a 910 nm e rilevare monodansilpentano ed EGFP con due rivelatori GaAs, utilizzando filtri passa-banda da 410-460 nm e 495-540 nm rispettivamente per le emissioni blu e verdi.
   2. Raccogli le immagini mediante scansione lineare a 2 μs/pixel (320 x 320 pixel; 16 bit per pixel) e memorizzale come file OIR. Mantieni manualmente le aree scansionate all'interno dell'inquadratura correggendo la deriva x/y durante il ciclo di imaging. Costruisci immagini 3D da z-scan utilizzando il software associato al microscopio.
3. Per la microscopia a due fotoni del topo tdTomato_membr (mT) marcato con monodansilpentano (Figura 4, Video 4), utilizzare un microscopio invertito con laser sintonizzabili e un obiettivo 63x preriscaldato a 37 °C (vedi Tabella dei materiali).
   1. Eccitare i campioni a 800 nm e 1.060 nm simultaneamente e rilevare il monodansilpentano con un rivelatore ibrido HyD impostato a 418-471 nm e TdTomato con un altro rivelatore ibrido HyD impostato a emissione 595-667 nm.
   2. Raccogli le immagini mediante scansione lineare con quattro linee in media a 200 Hz (512 x 512 pixel; 12 bit per pixel) e memorizzale come file LIF. Mantieni manualmente le aree scansionate all'interno dell'inquadratura correggendo la deriva x/y durante il ciclo di imaging. Costruisci immagini 3D da scansioni z utilizzando il software associato al microscopio.

5. Eutanasia

1. Eutanasia dei topi al termine dell'imaging tramite inalazione di CO₂ seguendo protocolli approvati istituzionalmente.

6. Creazione di video in tempo reale

1. Convertite le sequenze temporali in file TIFF e quindi in video utilizzando un software appropriato (consultate Tabella dei materiali).
   NOTA: L'analisi quantitativa di video specifici esula dallo scopo di questo documento e richiederà metodi specifici per la soluzione di problemi specifici. Ad esempio, vedi Ebrahim et ^al.24 per il ruolo dei complessi di actinomiosina nell'esocitosi della saliva dalla ghiandola salivare, Meyer et ^al.25 per la dinamica della secrezione biliare dal fegato e Masedunskas et ^al.9 per l'analisi della secrezione di LD dalle cellule epiteliali mammarie.

Risultati

Il latte è secreto da cellule epiteliali alveolari polarizzate, che si differenziano durante la gravidanza dalle gemme di un esteso albero duttulare²⁶ (Figura 2A). I precursori per la sintesi del latte vengono assimilati attraverso le membrane basali/laterali e i prodotti completi vengono secreti attraverso la superficie apicale in uno "spazio del latte" centrale. Il lato basale di ciascun alveolo è coperto da una serie stellata di ...

Discussione

L'utilizzo di un microscopio a uno o più fotoni dipende dalle domande poste, dalla natura e dalla posizione del tessuto da riprendere e dalla risoluzione richiesta. I microscopi multifotone si basano sulla generazione di due o più fotoni a bassa energia nel vicino infrarosso, che possono penetrare nei tessuti a una profondità maggiore con una fototossicità inferiore rispetto ai microscopi a un fotone^29,30. Inoltre, il fluorof...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
488 laser	Melles-Griot	-	CW  laser 50 mW
60x PLAPON oil immersion objective (NA 1.42)	Olympus	1-U2B933	Lens Confocal microscope
633 laser	Melles-Griot	-	CW He-Ne laser 12 mW
63x objective (NA 1.40, HC PL APO CS2)	Leica	11506350	Lens Two-photon microscope
BA 410-460 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 495-540 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 505-605 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 655-755 nm	Chroma	-	Band-pass filter
Boron-dipyrromethane (BODIPY) 665/676	Thermo Fisher Scientific	B3932	Lipid peroxiation sensor
Carbomer-940	Snowdrift Farm	739601480651	Gel
Catheter	Terumo	SV27EL	Winged infusion sets
Cauterizer	Braintree Scientific, Inc	GEM 5917	Cautery system
CMV-Cre mouse	Jackson lab	006054	Mouse line
Coverslip	Bioptechs	-	30mm diameter coverlip for inverted microscope
Curity 4x4 inch all purpose sponge gauze	Covidien	9024	Sponge
EGFPcyto mouse	Jackson lab	003291	Mouse line
Fiji/ImageJ software	Open source	-	Free software tool
Fine forceps	Braintree Scientific, Inc	FC003 8	Tissue forceps
Fluoview 1000 microscope	Olympus	FV1000	Confocal microscope
FluoView software	Olympus	-	Confocal microscope and Two-photon microscope
Hand-held electric razor	Braintree Scientific, Inc	CLP-8786-451A	Cordless clipper
Heat pad	Braintree Scientific, Inc	DPIP	Heat pad for animals
HyD detectors	Leica	-	Leica 4Tune spectral detector
Imaris software	Bitplane / Oxford instruments	-	Commercial software tool
Ingisht X3 tunable laser	Spectra Physics	Insight X3	Tunable Pulse-Laser
Isoflurane	VetOne	13985-046-40	Anesthetic
Ketamine	VetOne	13985-702-10	Anesthetic
LAS X Software	Leica	-	Two-photon microscope software tool
Mai-Tai tunable laser	Spectra Physics	Mai-Tai	Laser
MetaMorph	Molecular Devices	-	Commercial software tool
Monodansylpentane AUTODOT	Abcepta	Sm1000a	Lipid droplet dye
MPE-RS microscope	Olympus	IX70	Two-photon microscope
mT/mG mouse	Jackson lab	007676	Mouse line
Objective heater	Bioptechs	150819	Objective heater for both confocal and two-photon microscopes
Oxygen-saturated respiration chamber	Patterson Scientific	78933385, SAS3 and EVAC4	Gas Anesthesia and evacuation system
Parafilm	Heathrow Scientific	HS234526B	Semi-transparent, flexible, thermoplastic film
PMT detector	Olympus	-	Descanned   detectors
PMT detector	LSM-Technology	Custom built	Non-Descanned Detectors
Pump	Harvard Apparatus	703602, 704402	Nanomite injector and controller
Saline	Quality Biological	114-055-721EA	Normal saline
Sharp blunt-ended scissors	Braintree Scientific, Inc	SCT-S 508	Surgical scissors
Syringe	Covidien	22-257-150	1mL tuberculin syringe
TCS SP8 Dive Spectral microscope	Leica	SP8	Two-photon microscope
Tweezers	Braintree Scientific, Inc	FC032	Tissue forceps
Xylazine	VetOne	13985-704-10	Anesthetic