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摘要

翻译后修饰（PTM）改变蛋白质结构和功能。同时富集多个PTM类型的方法可以最大限度地提高分析的覆盖率。我们提出了一个使用双功能Ti（IV）固定化金属亲和色谱法，然后进行质谱分析的方案，用于同时富集和分析胰腺组织中的蛋白质N-糖基化和磷酸化。

摘要

质谱法可以提供翻译后修饰（PTM）的深度覆盖，尽管由于与非修饰分析物相比，它们化学计量低，因此通常需要从复杂的生物基质中富集这些修饰。在自下而上的蛋白质组学工作流程中，PTMs对肽的大多数富集工作流程，其中蛋白质在分析所得肽之前被酶消化，仅富集一种类型的修饰。然而，PTM的整个补体导致了生物学功能，并且单一类型的PTM的富集可能会错过PTM的这种串扰.PTM在蛋白质糖基化和磷酸化之间观察到串扰，这是人类蛋白质中最常见的两种PTM，也是使用质谱工作流程研究最多的两种PTM。使用本文描述的同时富集策略，两个PTM都从死后人胰腺组织（一种复杂的生物基质）中富集。双功能Ti（IV）固定化金属亲和色谱用于以方便的基于自旋尖端的方法同时分离多种形式的糖基化和磷酸化，从而允许下游分析潜在的PTM串扰相互作用。这种糖肽和磷酸肽的富集工作流程可应用于各种样品类型，以实现对多个PTM的深度分析，并为未来的研究确定潜在的目标分子。

引言

蛋白质翻译后修饰（PTM）在调节蛋白质结构中起主要作用，从而调节其功能和下游生物过程。由于各种PTM提供的组合变异性，人类蛋白质组的多样性呈指数级增长，基因组预测的蛋白质从其规范序列中产生的不同变体被称为蛋白质形式，许多蛋白质形式来自PTM1。研究健康和疾病中的蛋白质形式多样性已成为近年来非常感兴趣的研究领域2，3。

通过开发基于质谱（MS）的蛋白质组学方法，对蛋白质形式和更具体的PTM进行深入研究变得更加容易。使用MS，分析物被电离，破碎，并根据片段的 m / z 进行鉴定。富集方法通常是必要的，因为与非修饰形式的蛋白质相比，PTM的相对丰度较低。虽然完整蛋白质及其PTM的分析（称为自上而下分析）已变得更加常规，但在自下而上分析中蛋白质的酶消化及其组分肽的分析仍然是PTM分析中使用最广泛的途径。两种研究最广泛的PTM，以及 体内最常见的两种PTM，是糖基化和磷酸化4。这两个PTM在细胞信号传导和识别中起着重要作用，因此是在疾病研究中表征的重要修饰。

各种PTM的化学性质通常为在分析之前在蛋白质和肽水平上富集这些PTM提供了途径。糖基化是一种亲水性PTM，因为每个单糖上都有丰富的羟基。该性质可用于在亲水相互作用色谱（HILIC）中富集糖肽，其可以从疏水性非修饰肽5中分离出更多的亲水性糖肽。磷酸化增加了磷酸盐部分，除酸性pH外，磷酸盐部分带负电。由于这种电荷，各种金属阳离子，包括钛，可用于吸引和结合磷酸肽，同时非磷酸化物质被洗掉。这就是固定化金属亲和色谱（IMAC）的原理。关于糖基化和磷酸化的这些和其他富集策略的进一步讨论可以在最近的综述6，7中找到。

由于肽上PTM的化学计量较低，富集方案通常需要相对大量的起始肽材料（0.5mg或更多）。在可能不容易获得这种数量的样品的情况下，例如肿瘤核心活检或脑脊液分析，使用简单的工作流程来产生最大的生物分子信息是有益的。我们实验室和其他实验室最近制定的策略强调了使用相同的PTM富集工作流程8，9，10，11，12同时和平行分析糖基化和磷酸化。虽然这两种PTM的化学性质可能不同，但由于采用了创新的分离技术和材料，这些PTM可以分多个步骤进行分析。例如，静电排斥-亲水相互作用色谱（ERLIC）覆盖基于分析物与流动相之间的亲水相互作用与分析物与固定相材料13，14，15，16之间的电荷 - 电荷相互作用的分离。在酸性pH下，磷酸化肽对固定相的吸引力可以改善它们与非修饰肽的保留和分离。由固定在亲水性微球上的Ti（IV）组成的材料可用于HILIC和基于IMAC的洗脱，以分离磷酸肽和中性，酸性和甘露糖-6-磷酸化糖肽17，18。这种策略被称为双功能钛（IV）-IMAC。使用这些策略在单个工作流程中丰富多个 PTM 可以使潜在的 PTM 串扰交互分析更容易获得。此外，当并行执行时，总样品量和时间要求低于传统的富集方法（即，在单独的样品等分试样上进行HILIC和IMAC）。

为了证明同时分析蛋白质糖基化和磷酸化的双功能Ti（IV）-IMAC策略，我们将其应用于分析死后人胰腺组织。胰腺产生消化酶和调节激素，包括胰岛素和胰高血糖素。胰腺功能在胰腺疾病中受损。在糖尿病中，血糖的调节受到影响，导致血液中葡萄糖水平升高。在胰腺炎中，炎症是由器官的自动消化引起的3.PTM谱的变化，包括糖基化和磷酸化，可能导致其他疾病，通常的情况是这样的。

在这里，我们描述了基于双功能Ti（IV）-IMAC策略的基于自旋尖端的同时富集方法的方案，用于从胰腺组织中提取的蛋白质衍生的N-糖肽和磷酸肽。该方案包括蛋白质提取和消化、富集、MS数据收集和数据处理，如图 1所示。本研究的代表性数据 可通过 蛋白质交换联盟获得，标识符为PXD033065。

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图 1:同时分析来自人胰腺组织的 N-糖肽和磷酸肽的工作流程。 在使用洗涤剂十二烷基硫酸钠（SDS）提取蛋白质之前，首先将组织冷冻粉碎成细粉。然后对蛋白质进行酶消化。在使用双功能Ti（IV）-IMAC富集之前，将所得肽等分。使用纳米级反相液相色谱- 质谱（nRPLC-MS）收集原始数据，并使用数据库搜索软件进行分析。 请点击此处查看此图的大图。

该协议旨在使PTM分析更易于访问，并在同一工作流程中对多个PTM进行更广泛的分析。该协议可应用于其他复杂的生物基质，包括细胞和生物流体。

研究方案

获得死者近亲使用胰腺组织进行研究的同意，并获得了威斯康星大学麦迪逊分校健康科学机构审查委员会的授权。IRB监督不是必需的，因为它不涉及45 CFR 46.102（f）认可的人类受试者。

注意:处理本方案中使用的试剂时应小心，包括酸（甲酸、乙酸、三氟乙酸）、碱（氢氧化铵）和制冷剂（液氮）。阅读安全数据表，了解所使用的试剂，以熟悉相关危害和所需的预防措施。用百分比表示的浓度是体积/总体积（v / v），并用水稀释。

1. 组织冷冻粉碎、裂解和蛋白质提取

  1. 用液氮填充杜瓦瓶。预冷却将与胰腺组织接触的组织粉碎器部分，即聚苯乙烯容器中的腔室，粉碎机和回收勺。
  2. 将冷冻的组织块转移到预冷的样品架中，并向组织中加入一勺液氮。
  3. 将粉碎机放入腔室中，用木槌敲击五到十次以粉碎样品。从腔室中取出粉碎机，刮掉粘附的组织粉末和碎片。
  4. 如果组织开始融化，则向腔室中加入一勺液氮。重复粉碎过程，直到样品是没有大组织块的细粉末。将样品分成约100mg等分试样到预冷管中。
  5. 制备含有4%十二烷基硫酸钠（SDS），150mM NaCl和25mM Tris（pH = 7.4）的裂解缓冲液。将蛋白酶和磷酸酶抑制剂各一片溶解在500μL水中，每种储量为20倍。将所需体积的每种抑制剂的20x储备液加入裂解缓冲液中，以获得最终的1x浓度。
  6. 将每100mg组织600μL裂解缓冲液加入管中，并在95°C下在加热块中孵育10分钟，以800rpm振荡。从加热块中取出样品，让它们冷却至室温。
  7. 使用15 s脉冲以60 W能量（20 kHz）超声处理样品45秒，中间休息30秒。在4°C下以3，000× g 沉淀样品15分钟。
  8. 将上清液加入5x沉淀溶剂，300μL裂解缓冲液至1.5mL沉淀溶剂中，其中含有50%丙酮，49.9%乙醇和0.1%乙酸。在-20°C下冷却过夜。
  9. 在4°C下以3，000× g 再次沉淀样品15分钟，然后除去上清液。用刮刀破碎并与相同量的沉淀溶剂混合来洗涤颗粒。再次沉淀，重复洗涤步骤2x。
  10. 在4°C下以16，000× g 沉淀样品15分钟。 将样品沉淀在通风橱中风干15分钟，并储存在-80°C直至准备继续。

2. 蛋白质消化和脱盐

  1. 将蛋白质沉淀重悬于300μL含有50mM碳酸氢三乙基铵（TEAB）和8M尿素的新鲜消化缓冲液中。
  2. 根据制造商的方案使用蛋白质测定法估计溶液的蛋白质浓度。
  3. 向溶液中的蛋白质中加入二硫代三醇（DTT）至终浓度为5mM，混合并在室温下还原1小时。然后，加入碘乙酰胺（IAA）至终浓度为15mM，混合，并在室温下在黑暗中烷基化物30分钟。通过重复添加与之前相同的体积中的DTT来淬灭烷基化并混合。
  4. 以1:100酶:蛋白比例加入LysC / 胰蛋白酶，并在37°C下孵育4小时。然后，加入50mM TEAB稀释用于<1M的8M尿素，以1:100酶:蛋白质的比例加入胰蛋白酶，并在37°C下孵育过夜。
  5. 通过加入三氟乙酸（TFA）至0.3%v / v来淬灭消解。对于每 1 毫克起始蛋白，用 1 毫升乙腈 （ACN） 和 3x 的 1 毫升 0.1% TFA 调节脱盐盒（1 cc，10 毫克）。
  6. 将消化的混合物装入脱盐滤芯上。使用 1 毫升 0.1% TFA 洗涤混合物 3 倍。如果洗脱缓慢，请施加正压，但避免流速>每秒一滴。
  7. 使用1 mL 60%ACN和0.1%甲酸（FA）溶液洗脱肽。使用离心真空浓缩器在约35°C下干燥洗脱肽，直到溶剂完全蒸发。
  8. 将肽重悬于300μL水中，并根据制造商的方案使用肽测定法估计肽浓度。将肽分成500μg等分试样并完全干燥。

3. 埃里克 N-糖肽富集

注意:精确的离心机速度和时间可能因样品而异，必须进行优化。通常，300× g 持续2分钟适用于材料的调理和洗涤，100× g 适合洗脱5分钟。

  1. 称取约3mg棉絮，并将其包装成空的200μL移液器吸头（旋转尖端;见 材料表）。
  2. 将强阴离子交换富集材料转移到管中，每10mg材料加入200μL0.1%TFA。为了富集500μg肽，使用15mg的材料。通过摇动15分钟激活材料。
  3. 使用离心管适配器，将离心头放在2 mL管上，并向尖端添加足够的浆料以用于15mg的材料。通过在台式离心机中旋转来除去液体。
  4. 通过用200μLACN离心3x来调节材料。使用 100 mM 乙酸铵 （NH4Ac）、1% TFA 和 80% ACN/0.1% TFA（加载缓冲液）重复三份预处理。
  5. 将500μg肽样品重悬于约200μL上样缓冲液中并流过自旋尖端。重新加载流通 2 倍以确保完全绑定。
  6. 使用 200 μL 80% ACN/0.1% TFA 离心 5 倍，然后使用 200 μL 80% ACN/0.1% FA 离心 2x，洗涤材料。
  7. 通过用200μL以下每种物质离心洗脱肽:50%ACN / 0.1%FA（E1）;0.1% 足总值 （E2）;0.1% 万亿英比 （E3）;3 亿千万 KH2PO4， 10% 铜绿化 （E4）。
  8. 通过用200μL80%ACN / 5%NH4OH离心2x来洗涤材料。用200μL10%NH4OH（E5）洗脱剩余的肽。
  9. 使用离心真空浓缩器在约35°C下完全干燥所有洗脱液。
  10. 根据制造商的协议使用脱盐头对基本洗脱（E5）进行脱盐。
  11. 使用离心真空浓缩器在约35°C下干燥脱盐尖端的洗脱液至完整。

4. 钛（IV）-IMAC磷酸肽富集

注意:精确的离心机速度和时间可能因样品而异，必须进行优化。通常，300× g 持续2分钟适用于材料的调理和洗涤，100× g 适合洗脱5分钟。

  1. 称取约3mg棉絮，并将其包装在空的200μL移液器吸头（旋转吸头）中。
  2. 将Ti-IMAC磷酸肽富集材料转移到管中，每10mg材料加入200μL0.1%TFA。为了富集500μg肽，使用10mg材料。
  3. 使用离心管适配器，将离心头放在2 mL管上，并向尖端添加足够的浆料以用于10mg材料。通过在台式离心机中旋转来除去液体。
  4. 使用与上述相同的离心机设置，用200μL的40%ACN / 3%TFA调节材料。将肽样品重悬于 200 μL 40% ACN/3% TFA 中，然后流过自旋尖端。重新加载流经两次，以确保更完整的绑定。
  5. 用200μL50%ACN，6%TFA和200mM NaCl溶液离心洗涤材料，然后在200μL 30%ACN和0.1%TFA溶液中洗涤2x。
  6. 洗脱肽与200μL10%NH4OH。在真空下完全干燥洗脱液。根据制造商的协议使用脱盐头进行脱盐。在真空下将脱盐头的洗脱物干燥至完整。

5. 双功能Ti（IV）同时富集

注意:精确的离心机速度和时间可能因样品而异，必须进行优化。通常，300× g 持续2分钟适用于材料的调理和洗涤，100× g 适合洗脱5分钟。

  1. 称取约3毫克棉絮，并将其包装成空的自旋尖端。
  2. 将大约1克钛（IV）-IMAC材料转移到管中。向已知浓度的材料中加入0.1%TFA，例如20mg / 200μL（材料可以在4°C下储存在该悬浮液中）。
  3. 为了从500μg肽中富集，向自旋尖端加入足够的浆料以转移20mg材料。通过用200μL0.1%TFA离心来洗涤离心头。
  4. 将样品重悬于200μL上样/洗涤溶剂（80%ACN和3%TFA）中，然后流过自旋尖端。重新加载流经 2 倍。
  5. 通过用200μL上样/洗涤溶剂离心来洗涤离心头6x。用200μL 80%ACN / 0.1%FA溶液洗涤离心头。
  6. 用200μL以下每种物质洗脱肽:60%ACN / 0.1%FA（E1）和40%ACN / 0.1%FA（E2）。分别分析每个洗脱。
  7. 用200μL以下每种方法洗脱肽:20%ACN / 0.1%FA和0.1%FA. 将两种洗脱液合并作为一个样品进行分析（E3）。
  8. 用200μL以下每种物质洗脱肽:40%ACN / 3%TFA;50% 铜酸/6% 三氟甲酸， 2亿氯化钠;和 30% 的中华全国华凌/0.1% 的资产转移率。将这些洗脱液合并，并在使用填充的吸头进行脱盐后作为一个（E4）进行分析。
  9. 使用 200 μL 90% ACN/2.5% NH4OH 将材料调节至碱性 pH 值，持续 3 倍。丢弃这些洗涤物。
  10. 用200μL以下每种物质洗脱肽:60%ACN / 10%NH4OH（E5）和40%ACN / 10%NH4OH（E6）。使用填充的吸头在脱盐后分别分析这些洗脱液。
  11. 用200μL以下各项洗脱肽:20%ACN / 10%NH4OH;10% 血红新月/10% NH4俄亥俄;和10%NH4哦。将这些洗脱液合并，并在使用填充的吸头进行脱盐后作为一个（E7）进行分析。
  12. 在真空下完全干燥所有洗脱液。

6. 纳米流反相液相色谱-质谱

注意:MS数据采集和分析方法多种多样，因此以下步骤中仅描述了一种建议的LC-MS管道（及其相关参数）。使用前面概述的样品制备和富集步骤生成的样品可以使用其他仪器设置进行分析，包括使用市售色谱柱，前提是有足够的数据质量。

  1. 使用C18材料拉动并包装15厘米长的毛细管（内径75μm），如19中所述。制备流动相A（水中0.1%FA）和流动相B（0.1%氟化硅酸）。
  2. 在15μL的3%流动相B中重建富集肽样品，将2μL样品（〜13%样品体积）直接加载到色谱柱上。技术重复分析每个样品。
  3. 使用3%至30%流动相B的梯度以0.3μL / min的流速在90分钟内洗脱肽。使用75%B洗涤色谱柱8分钟，然后用95%B洗涤8分钟，在3%B下平衡12分钟完成该方法。
  4. 在正离子模式下操作质谱仪，使用数据相关的前20个峰值采集，具有以下参数:喷雾电压2 kV;MS1 在LC / MS中以120，000分辨率从400-2，000 m / z 进行检测，2E5自动增益控制（AGC）目标，100 ms最大注入时间，30%RF透镜，四极杆隔离，1.6 m / z 窗口，用于2-8和未确定的充电状态，以及30 s动态排除;在LC / MS中使用22 %，30%和38%的阶梯HCD碎片在LC / MS中检测MS 2，固定第一质量120 m / z ，分辨率为30，000，AGC目标和2.5E4最小强度要求。

7. MS数据分析

注意:此处提供了一个使用两种不同软件来分析同一数据集的数据分析管道。磷酸化和糖基化可以同时使用单个软件而不是这里描述的两个单独的软件进行搜索，尽管一般来说，软件搜索时间与搜索空间成正比，即考虑的PTM的数量。因此，两种不同的软件并行用于寻找糖肽和磷酸肽。

  1. 使用适当的软件处理原始数据文件（参见 材料表）。
    1. 根据UniProt人类（或适当的物种特异性）数据库搜索光谱。将Cys的卡米多甲基化设置为固定修饰。将错过的酶裂解的最大数量设置为两个。
  2. 在原始数据文件中，使用商业软件（参见 材料表），搜索要分析的糖肽20。使用10 ppm的前体质量耐受性和0.01 Da片段质量耐受性，最小肽长度为4个残基。
    1. 使用软件嵌入的 N-聚糖数据库进行搜索，该数据库扩展了典型的甘露糖-6-磷酸（M6P）聚糖，包括十六碳纳米管（2）六环磷（4-9）磷酸化（1-2）、十六碳六进制（4-9）磷酸化物（1-2）、十六碳六烷（3-4）磷酸化（1）和十六环己（3-4）磷酸化（1）。
    2. 将N-糖基化设置为常见修饰。将每个肽光谱匹配（PSM）的最大总修饰数设置为一个常见和两个罕见。
    3. 设置以下变量修改:Met 的氧化（罕见）、Asn 和 Gln 的脱酰胺（罕见）以及 Ser、Thr 和Tyr 的磷酸化（常见）。设置以下识别过滤器:分数截止> 150，|日志概率|>1，三角洲模组得分>10。
    4. 在"蛋白质"和"肽组"选项卡中导出和分析搜索结果。
    5. 手动筛选含有M6P聚糖的鉴定物，以发现MS / MS光谱中存在磷酸六氧化氧离子（243 m / z），并去除不包含该诊断离子的假阳性鉴定。
  3. 在原始数据文件中，使用开源软件（参见 材料表），搜索要分析的磷酸肽21。使用 20 ppm 的首次搜索肽耐受性和 4.5 ppm 的主搜索肽耐受性。
    1. 将每个肽的最大修饰次数设置为 5。将 PSM 和蛋白质误发现率 （FDR） 设置为 1%，将最小肽长度设置为 7 个残基。
    2. 将可变修饰设置为 Met 处的氧化、N 端蛋白乙酰化和 Ser、Thr 和 Tyr 处的磷酸化。使用修饰特异性肽文件分析搜索结果。
  4. 确定蛋白质、肽和修饰位点水平的 PTM 鉴定数量。

结果

代表性的质谱数据，包括原始文件和搜索结果，已通过PRIDE合作伙伴存储库存入ProteomeXchange 联盟， 数据集标识符为PXD03306522。

在这项工作中，分析了每个富集洗脱的重复注射重复。从两个技术复制品中做出的鉴定在最终分析中被整理出来。由于在挑选用于MS / MS片段化的肽前体时数据依赖性采集的半随机性，预计技术重复之间的鉴定重叠约为70%-80%。在...

讨论

双功能Ti（IV）-IMAC策略可用于在单个样品制备工作流程中同时分析来自同一样品的N-糖肽和磷酸肽。基于 ERLIC 的方法也被证明可以同时富集 PTM。这两种策略以前都用于PTM分析14，18的深度覆盖。通过使用自旋头使双Ti方法适应减少样品孵育时间，我们希望该协议已经变得不那么资源密集，从而更广泛地获得。

多个PTM的同时分析是通?...

披露声明

作者声明没有竞争利益。

致谢

这项研究得到了NIH（R01DK071801，RF1AG052324，P01CA250972和R21AG065728）和青少年糖尿病研究基金会（1-PNF-2016-250-S-B和SRA-2016-168-B）的赠款资助的部分支持。这里提供的数据也部分是通过威斯康星大学临床和转化研究所获得NIH / NCATS UL1TR002373奖的支持而获得的。Orbitrap仪器是通过NIH共享仪器赠款（NIH-NCRR S10RR029531）和威斯康星大学麦迪逊分校研究和研究生教育副校长办公室的支持购买的。我们还要感谢威斯康星大学器官和组织捐赠组织的慷慨支持，该组织为人类胰腺的研究提供了帮助，Dan Tremmel，Sara D. Sackett博士和Jon Odorico教授为我们的实验室提供了样本。我们的研究团队特别感谢为这项研究捐赠纸巾的家庭。L.L.承认NIH拨款S10OD025084，这是威斯康星大学Carbone癌症中心（233-AAI9632）的胰腺癌试点补助金，以及维拉斯杰出成就教授职位和查尔斯·墨尔本约翰逊杰出讲座教授职位，由威斯康星州校友研究基金会和威斯康星大学麦迪逊分校药学院提供资金。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic Acid, Glacial (Certified ACS)Fisher ScientificA38S-500
Acetone (Certified ACS)Fisher ScientificA18-1
Acetonitrile, Optima LC/MS GradeFisher ScientificA955-4
Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificA637-500
Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus)Fisher ScientificA669-212
Byonic softwareProtein Metricsn/aCommercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/)
C18 BEH materialWaters186002353Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet)
CAE-Ti-IMAC, 100%J&K Scientific2749380-1GMaterial used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment
Cellcrusher kitCellcrushern/aUsed for grinding tissue samples into powder before extraction
Eppendorf 5424R MicrocentrifugeFisher Scientific05-401-205For temperature-controlled centrifugation
cOmplete protease inhibitor cocktail tabletsSigma11697498001
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)PromegaV3151Protein reducing agent
Ethanol, 200 proof (100%), USPFisher22-032-601
Fisherbrand Analog Vortex MixerFisher Scientific02-215-414
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)Fisher Scientific02-681-320
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL)Fisher Scientific02-681-321
Fisherbrand Model 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB120110For sample lysis using ultrasonication
Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS GradeFisher ScientificA117-50
Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter)Polymicro Technologies LLC100 m TSP075375For in-house pulled and packed columns with integrated emitter
Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O)Sigma-Aldrich339261-100MLUsed for opening emitter of pulled capillary column
Iodoacetamide, BioUltraSigmaI1149-5GProtein reducing reagent
MaxQuant softwaren/an/aFree software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/)
Multi-therm Shaker with heating and coolingBenchmark ScientificH5000-HCHeating block
Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pkWaters186000383Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each)
OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tipsAgilentA57003100Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions
P-2000 Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-2000/FFor pulling nano-capillary columns for LC-MS
PhosSTOP phosphatase inhibitor tabletsSigma4906845001
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide AssayThermo Fisher Scientific23275
PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å)PolyLCBMSX1203Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment
Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificP285-500
Pressure injection cell with integrated magnetic stirplateNext AdvancePC77-MAGFor packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit
Proteome Discoverer softwareThermo Fisher Scientificn/aCommercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)
SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120Savantn/aCentrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat)
SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/ElectrophoresisFisher ScientificBP2436200
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificS271-500
TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96Glygen CorporationTT2EMT.96Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile))Sigma90360-100ML
Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99%Fisher Scientific60-017-61
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)Fisher ScientificBP152-500
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec GradePromegaV5071
Urea (Certified ACS)Fisher ScientificU15-500
Water, Optima LC/MS GradeFisher ScientificW64

参考文献

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