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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Posttranslationale Modifikationen (PTMs) verändern Proteinstrukturen und -funktionen. Methoden zur gleichzeitigen Anreicherung mehrerer PTM-Typen können die Abdeckung in Analysen maximieren. Wir präsentieren ein Protokoll mit dual-funktioneller Ti(IV)-immobilisierter Metallaffinitätschromatographie, gefolgt von Massenspektrometrie zur gleichzeitigen Anreicherung und Analyse der Protein-N-Glykosylierung und Phosphorylierung in Pankreasgeweben.

Zusammenfassung

Die Massenspektrometrie kann eine tiefe Abdeckung der posttranslationalen Modifikationen (PTMs) liefern, obwohl eine Anreicherung dieser Modifikationen aus komplexen biologischen Matrizen aufgrund ihrer geringen Stöchiometrie im Vergleich zu nicht modifizierten Analyten oft erforderlich ist. Die meisten Anreicherungs-Workflows von PTMs auf Peptiden in Bottom-up-Proteomik-Workflows, bei denen Proteine enzymatisch verdaut werden, bevor die resultierenden Peptide analysiert werden, reichern nur eine Art von Modifikation an. Es ist jedoch das gesamte Komplement von PTMs, das zu biologischen Funktionen führt, und die Anreicherung einer einzigen Art von PTM kann ein solches Übersprechen von PTMs übersehen. PTM-Übersprechen wurde zwischen Proteinglykosylierung und Phosphorylierung beobachtet, den beiden häufigsten PTMs in menschlichen Proteinen und auch den beiden am meisten untersuchten PTMs unter Verwendung von Massenspektrometrie-Workflows. Unter Verwendung der hier beschriebenen simultanen Anreicherungsstrategie werden beide PTMs aus postmortalem menschlichem Pankreasgewebe, einer komplexen biologischen Matrix, angereichert. Die dual-funktionelle Ti(IV)-immobilisierte Metallaffinitätschromatographie wird verwendet, um verschiedene Formen der Glykosylierung und Phosphorylierung gleichzeitig in mehreren Fraktionen in einer bequemen Spinspitzen-basierten Methode zu trennen, die nachgelagerte Analysen potenzieller PTM-Crosstalk-Wechselwirkungen ermöglicht. Dieser Anreicherungs-Workflow für Glyko- und Phosphopeptide kann auf verschiedene Probentypen angewendet werden, um eine tiefe Profilierung mehrerer PTMs zu erreichen und potenzielle Zielmoleküle für zukünftige Studien zu identifizieren.

Einleitung

Protein-posttranslationale Modifikationen (PTMs) spielen eine wichtige Rolle bei der Modulation von Proteinstrukturen und damit ihrer Funktionen und nachgelagerten biologischen Prozesse. Die Vielfalt des menschlichen Proteoms nimmt aufgrund der kombinatorischen Variabilität verschiedener PTMs exponentiell zu. Verschiedene Varianten von Proteinen aus ihren kanonischen Sequenzen, wie sie vom Genom vorhergesagt werden, werden als Proteoformen bezeichnet, und viele Proteoformen entstehen ausPTMs 1. Die Untersuchung der proteoformen Vielfalt in Gesundheit und Krankheit ist in den letzten Jahren zu einem Forschungsgebiet von großem Interessegeworden 2,3.

Das Studium von Proteoformen und insbesondere von PTMs mit großer Tiefe ist durch die Entwicklung von auf Massenspektrometrie (MS) basierenden Proteomikmethoden einfacher geworden. Mit MS werden Analyten ionisiert, fragmentiert und basierend auf dem m/z von Fragmenten identifiziert. Anreicherungsmethoden sind aufgrund der geringen relativen Häufigkeit von PTMs im Vergleich zu nicht modifizierten Formen von Proteinen oft notwendig. Obwohl die Analyse intakter Proteine und ihrer PTMs, die sogenannten Top-Down-Analysen, routinemäßiger geworden sind, ist die enzymatische Verdauung von Proteinen und die Analyse ihrer Komponentenpeptide in Bottom-up-Analysen immer noch der am weitesten verbreitete Weg für die PTM-Analyse. Die beiden am häufigsten untersuchten PTMs und die beiden häufigsten PTMs in vivo sind Glykosylierung und Phosphorylierung4. Diese beiden PTMs spielen eine wichtige Rolle bei der Zellsignalisierung und -erkennung und sind daher wichtige Modifikationen, die in der Krankheitsforschung charakterisiert werden müssen.

Die chemischen Eigenschaften verschiedener PTMs bieten oft Wege zur Anreicherung dieser PTMs auf Protein- und Peptidebene vor der Analyse. Die Glykosylierung ist ein hydrophiles PTM aufgrund der Häufigkeit von Hydroxylgruppen auf jedem Monosaccharid. Diese Eigenschaft kann verwendet werden, um Glykopeptide in der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) anzureichern, die mehr hydrophile Glykopeptide von den hydrophoben, nicht modifizierten Peptidentrennen können 5. Die Phosphorylierung fügt den Phosphatanteil hinzu, der außer bei saurem pH-Wert negativ geladen ist. Aufgrund dieser Ladung können verschiedene Metallkationen, einschließlich Titan, verwendet werden, um Phosphopeptide anzuziehen und zu binden, während nicht phosphorylierte Spezies weggespült werden. Dies ist das Prinzip der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie (IMAC). Weitere Erörterungen dieser und anderer Anreicherungsstrategien für Glykosylierung und Phosphorylierung finden sich in den letzten Reviews 6,7.

Vergleichsweise große Mengen an Ausgangspeptidmaterial (0,5 mg oder mehr) werden aufgrund der geringen Stöchiometrie von PTMs an Peptiden häufig für Anreicherungsprotokolle benötigt. In Szenarien, in denen diese Probenmenge möglicherweise nicht leicht gewonnen werden kann, wie z. B. Tumorkernbiopsie oder Liquoranalysen, ist es vorteilhaft, einfache Arbeitsabläufe zu verwenden, die zu maximalen biomolekularen Informationen führen. Jüngste Strategien, die von unserem Labor und anderen entwickelt wurden, haben die gleichzeitige und parallele Analyse von Glykosylierung und Phosphorylierung unter Verwendung desselben PTM-Anreicherungsworkflows 8,9,10,11,12 hervorgehoben. Obwohl sich die chemischen Eigenschaften dieser beiden PTMs unterscheiden können, können diese PTMs aufgrund der innovativen Trenntechniken und verwendeten Materialien in mehreren Schritten analysiert werden. Zum Beispiel überlagert die elektrostatische Abstoßungs-hydrophile Wechselwirkungschromatographie (ERLIC) Trennungen basierend auf hydrophilen Wechselwirkungen zwischen Analyten und der mobilen Phase mit Ladungs-Ladungs-Wechselwirkungen zwischen Analyten und dem stationären Phasenmaterial13,14,15,16. Bei saurem pH-Wert kann die Anziehung phosphorylierter Peptide in die stationäre Phase ihre Retention und Trennung von nicht modifizierten Peptiden verbessern. Material, das aus Ti(IV) besteht, das auf hydrophilen Mikrosphären immobilisiert ist, kann für HILIC- und IMAC-basierte Elution verwendet werden, um Phosphopeptide und neutrale, saure und Mannose-6-phosphorylierte Glykopeptide17,18 zu trennen. Diese Strategie wird als dual-funktionales Ti(IV)-IMAC bezeichnet. Die Verwendung dieser Strategien zur Anreicherung mehrerer PTMs in einem einzigen Workflow kann Analysen potenzieller PTM-Crosstalk-Interaktionen zugänglicher machen. Darüber hinaus sind die Gesamtprobenmenge und der Zeitaufwand geringer als bei den herkömmlichen Anreicherungsmethoden, wenn sie parallel durchgeführt werden (d. h. HILIC und IMAC auf separaten Probenaliquoten).

Um die dual-funktionelle Ti(IV)-IMAC-Strategie für die gleichzeitige Analyse von Proteinglykosylierung und Phosphorylierung zu demonstrieren, haben wir sie zur Analyse von postmortalem menschlichem Pankreasgewebe angewendet. Die Bauchspeicheldrüse produziert sowohl Verdauungsenzyme als auch regulatorische Hormone, einschließlich Insulin und Glucagon. Die Pankreasfunktion ist bei Bauchspeicheldrüsenerkrankungen beeinträchtigt. Bei Diabetes ist die Regulierung des Blutzuckers betroffen, was zu höheren Glukosespiegeln im Blut führt. Bei Pankreatitis resultiert eine Entzündung aus der Autoverdauung desOrgans 3. Veränderungen der PTM-Profile, einschließlich Glykosylierung und Phosphorylierung, können, wie es oft der Fall ist, bei anderen Krankheiten auftreten.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine Spin-Tip-basierte simultane Anreicherungsmethode, basierend auf einer dual-funktionellen Ti(IV)-IMAC-Strategie, für N-Glykopeptide und Phosphopeptide, die aus Proteinen gewonnen werden, die aus Pankreasgewebe extrahiert werden. Das Protokoll umfasst Proteinextraktion und -verdauung, Anreicherung, MS-Datenerfassung und Datenverarbeitung, wie in Abbildung 1 dargestellt. Repräsentative Daten aus dieser Studie sind über das ProteomeXchange-Konsortium mit der Kennung PXD033065 verfügbar.

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Abbildung 1: Workflow zur simultanen Analyse von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus humanem Pankreasgewebe. Gewebe werden zunächst vor der Proteinextraktion mit dem Waschmittel Natriumdodecylsulfat (SDS) zu einem feinen Pulver pulverisiert. Proteine werden dann einer enzymatischen Verdauung unterzogen. Die resultierenden Peptide werden vor der Anreicherung mit dual-funktionellem Ti(IV)-IMAC aliquotiert. Die Rohdaten werden mittels nanoskaliger Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (nRPLC-MS) gesammelt und mit Hilfe einer Datenbanksuchsoftware analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Dieses Protokoll soll PTM-Analysen zugänglicher machen und eine umfassendere Analyse mehrerer PTMs im selben Workflow ermöglichen. Dieses Protokoll kann auf andere komplexe biologische Matrizen, einschließlich Zellen und Bioflüssigkeiten, angewendet werden.

Protokoll

Es wurde die Zustimmung für die Verwendung von Pankreasgewebe für die Forschung von den nächsten Angehörigen des Verstorbenen eingeholt und eine Genehmigung des University of Wisconsin-Madison Health Sciences Institutional Review Board eingeholt. Eine IRB-Aufsicht ist nicht erforderlich, da sie keine menschlichen Probanden betrifft, wie in 45 CFR 46.102 (f) anerkannt.

VORSICHT: Beim Umgang mit den in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien, zu denen Säuren (Ameisen, Essigsäure, Trifluoressigsäure), Basen (Ammoniumhydroxid) und Kryogene (flüssiger Stickstoff) gehören, ist Vorsicht geboten. Lesen Sie die Sicherheitsdatenblätter für die verwendeten Reagenzien, um sich mit den damit verbundenen Gefahren und erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen vertraut zu machen. Prozentual angegebene Konzentrationen sind Volumen/Gesamtvolumen (v/v) und werden mit Wasser verdünnt.

1. Kryopulverisierung, Lyse und Proteinextraktion von Geweben

  1. Füllen Sie einen Dewar mit flüssigem Stickstoff. Kühlen Sie die Teile des Gewebepulverisierers, die mit dem Pankreasgewebe in Kontakt kommen, nämlich die Kammer, der Pulverisierer und der Erholungslöffel, in einem Styroporbehälter vor.
  2. Die gefrorenen Gewebestücke in den vorgekühlten Probenhalter geben und einen Löffel flüssigen Stickstoff in das Gewebe geben.
  3. Legen Sie den Pulverisierer in die Kammer und schlagen Sie ihn fünf- bis zehnmal mit einem Schlägel an, um die Probe zu zerkleinern. Entfernen Sie den Pulverisierer aus der Kammer und kratzen Sie anhaftendes Gewebepulver und Stücke ab.
  4. Fügen Sie einen Löffel flüssigen Stickstoff in die Kammer hinzu, wenn das Gewebe zu schmelzen beginnt. Wiederholen Sie den Pulverisierungsprozess, bis die Probe ein feines Pulver ohne große Gewebebrocken ist. Portionieren Sie die Proben in ca. 100 mg Aliquots in vorgekühlte Röhrchen.
  5. Bereiten Sie einen Lysepuffer vor, der 4% Natriumdodecylsulfat (SDS), 150 mM NaCl und 25 mM Tris (pH = 7,4) enthält. Lösen Sie jeweils eine Tablette Protease und Phosphatase-Inhibitor in 500 μL Wasser auf, um jeweils einen 20-fachen Vorrat zu erhalten. Fügen Sie das erforderliche Volumen von 20x Vorrat jedes Inhibitors zum Lysepuffer hinzu, um eine endgültige 1x-Konzentration zu erhalten.
  6. 600 μL Lysepuffer pro 100 mg Gewebe in die Tube geben und bei 95 °C in einem Heizblock für 10 min mit Schütteln bei 800 U/min inkubieren. Nehmen Sie die Proben aus dem Heizblock und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen.
  7. Beschallen Sie die Proben mit 60 W Energie (20 kHz) für 45 s mit 15 s Impulsen mit einer Pause von 30 s dazwischen. Pelletieren Sie die Proben bei 3.000 x g für 15 min bei 4 °C.
  8. Fügen Sie den Überstand zu einem 5x Fällungslösungsmittel, 300 μL Lysepuffer zu 1,5 ml Fällungslösungsmittel hinzu, das 50% Aceton, 49,9% Ethanol und 0,1% Essigsäure enthält. Über Nacht bei -20 °C kühlen.
  9. Pelletieren Sie die Proben erneut bei 3.000 x g für 15 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie das Pellet, indem Sie es mit einem Spatel aufbrechen und mit der gleichen Menge an Fällungslösungsmittel mischen. Pellet erneut und wiederholen Sie den Waschschritt 2x.
  10. Pelletieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 15 min bei 4 °C. Das Probenpellet 15 min in einem Abzug an der Luft trocknen und bei -80 °C lagern, bis es fahrbereit ist.

2. Proteinverdauung und Entsalzung

  1. Resuspendiert das Proteinpellet in 300 μL frisch hergestelltem Verdauungspuffer, der 50 mM Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) und 8 M Harnstoff enthält.
  2. Schätzen Sie die Proteinkonzentration der Lösung mit einem Proteinassay gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  3. Zu dem Protein in der Lösung Dithiothreitol (DTT) zu einer Endkonzentration von 5 mM hinzufügen, mischen und bei Raumtemperatur für 1 h reduzieren. Dann fügen Sie Iodacetamid (IAA) zu einer Endkonzentration von 15 mM hinzu, mischen und alkylieren Sie bei Raumtemperatur für 30 min im Dunkeln. Quench-Alkylierung durch Wiederholung der Zugabe von DVB-T im gleichen Volumen wie zuvor und Mischen.
  4. LysC/Trypsin im Enzym:Protein-Verhältnis 1:100 zugeben und bei 37 °C für 4 h inkubieren. Dann fügen Sie 50 mM TEAB hinzu, um den 8 M Harnstoff zu verdünnen, der zur < von 1 M verwendet wird. Trypsin im Enzym:Protein-Verhältnis 1:100 hinzufügen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  5. Quen Sie den Aufschluss unter Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA) auf 0,3% v/v. Für jedes 1 mg Startprotein eine Entsalzungskartusche (1 cc, 10 mg) mit 1 ml Acetonitril (ACN) und 3x mit 1 ml 0,1% TFA konditionieren.
  6. Die verdaute Mischung auf die Entsalzungskartusche geben. Waschen Sie die Mischung 3x mit 1 ml 0,1% TFA. Wenn die Elution langsam ist, üben Sie Überdruck aus, vermeiden Sie jedoch eine Durchflussrate > einem Tropfen pro Sekunde.
  7. Eluierte Peptide mit 1 ml 60% ACN und 0,1% Ameisensäure (FA) Lösung. Trocken eluierte Peptide bei ca. 35 °C mit einem zentrifugalen Vakuumkonzentrator, bis das Lösungsmittel vollständig verdampft ist.
  8. Resuspendieren Sie Peptide in 300 μL Wasser und schätzen Sie die Peptidkonzentrationen mit einem Peptidassay gemäß dem Protokoll des Herstellers. Die Peptide in 500 μg Aliquots portionieren und vollständig trocknen.

3. ERLIC N-Glykopeptid-Anreicherung

HINWEIS: Die genauen Zentrifugengeschwindigkeiten und -zeiten können je nach Probe variieren und müssen optimiert werden. Im Allgemeinen sind 300 x g für 2 min für die Konditionierung und das Waschen des Materials und 100 x g für 5 min für die Elutierung geeignet.

  1. Wiegen Sie ca. 3 mg Watte und verpacken Sie sie in eine leere 200 μL Pipettenspitze (Schleuderspitze; siehe Materialtabelle).
  2. Starkes Anionenaustausch-Anreicherungsmaterial in ein Röhrchen überführen und 200 μL 0,1% TFA pro 10 mg Material hinzufügen. Zur Anreicherung von 500 μg Peptiden verwenden Sie 15 mg des Materials. Aktivieren Sie das Material durch Schütteln für 15 min.
  3. Legen Sie die Spinspitze mit einem Schlauchadapter über ein 2-ml-Röhrchen und fügen Sie der Spitze genügend Aufschlämmung für 15 mg Material hinzu. Entfernen Sie die Flüssigkeit, indem Sie sie in einer Tischzentrifuge drehen.
  4. Konditionieren Sie das Material, indem Sie 3x mit 200 μL ACN zentrifugieren. Wiederholen Sie die dreifache Konditionierung mit 100 mM Ammoniumacetat (NH4Ac), 1% TFA und 80% ACN/0,1% TFA (Ladepuffer).
  5. Resuspendieren Sie 500 μg Peptidproben in etwa 200 μL Ladepuffer und fließen Sie durch die Spinspitze. Laden Sie den Durchfluss 2x nach, um eine vollständige Bindung zu gewährleisten.
  6. Waschen Sie das Material, indem Sie 5x mit 200 μL 80% ACN/0,1% TFA zentrifugieren und dann 2x mit 200 μL 80% ACN/0,1% FA.
  7. Eluieren Sie die Peptide durch Zentrifugieren mit jeweils 200 μL: 50% ACN/0,1% FA (E1); 0,1% FA (E2); 0,1% TFA (E3); 300 mM KH2PO4, 10% ACN (E4).
  8. Waschen Sie das Material, indem Sie 2x mit 200 μL 80% ACN/5% NH4OH zentrifugieren. Eluieren Sie die restlichen Peptide mit 200 μL 10% NH4OH (E5).
  9. Trocknen Sie alle Elutien vollständig mit einem Zentrifugal-Vakuumkonzentrator bei ca. 35 °C.
  10. Entsalzen Sie die Grundelution (E5) mit einer Entsalzungsspitze gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  11. Die Elution von der Entsalzungsspitze mit einem zentrifugalen Vakuumkonzentrator bei ca. 35 °C bis zur Vollständigkeit trocknen.

4. Ti(IV)-IMAC Phosphopeptid-Anreicherung

HINWEIS: Die genauen Zentrifugengeschwindigkeiten und -zeiten können je nach Probe variieren und müssen optimiert werden. Im Allgemeinen sind 300 x g für 2 min für die Konditionierung und das Waschen des Materials und 100 x g für 5 min für die Elutierung geeignet.

  1. Wiegen Sie ca. 3 mg Watte und packen Sie sie in eine leere 200 μL Pipettenspitze (Spin-Tip).
  2. Ti-IMAC Phosphopeptid-Anreicherungsmaterial in ein Röhrchen überführen und 200 μL 0,1% TFA pro 10 mg Material hinzufügen. Zur Anreicherung von 500 μg Peptiden verwenden Sie 10 mg Material.
  3. Legen Sie die Schleuderspitze mit einem Röhrchenadapter über ein 2-ml-Röhrchen und fügen Sie der Spitze genügend Aufschlämmung für 10 mg Material hinzu. Entfernen Sie die Flüssigkeit, indem Sie sie in einer Tischzentrifuge drehen.
  4. Konditionieren Sie das Material mit 200 μL 40% ACN/3% TFA unter Verwendung der gleichen Zentrifugeneinstellungen wie oben beschrieben. Resuspendieren Sie Peptidproben in 200 μL von 40% ACN / 3% TFA und fließen Sie durch die Spin-Spitze. Laden Sie den Durchfluss zweimal nach, um eine vollständigere Bindung zu gewährleisten.
  5. Waschen Sie das Material durch Zentrifugieren mit 200 μL 50% ACN, 6% TFA und 200 mM NaCl-Lösung, gefolgt von 2x in 200 μL 30% ACN und 0,1% TFA-Lösung.
  6. Elute Peptide mit 200 μL von 10% NH 4 OH. Trocknen Sie die Elution vollständig unter Vakuum. Führen Sie die Entsalzung mit einer Entsalzungsspitze gemäß dem Protokoll des Herstellers durch. Trocknen Sie die Elution von der Entsalzungsspitze unter Vakuum bis zur Vollständigkeit.

5. Dual-funktionelle Ti(IV)-Simultananreicherung

HINWEIS: Die genauen Zentrifugengeschwindigkeiten und -zeiten können je nach Probe variieren und müssen optimiert werden. Im Allgemeinen sind 300 x g für 2 min für die Konditionierung und das Waschen des Materials und 100 x g für 5 min für die Elutierung geeignet.

  1. Wiegen Sie etwa 3 mg Watte und packen Sie sie in eine leere Schleuderspitze.
  2. Übertragen Sie ca. 1 g Ti(IV)-IMAC-Material in ein Röhrchen. Zugabe von 0,1 % TFA zu einer bekannten Materialkonzentration, z. B. 20 mg/200 μL (Material kann in dieser Suspension bei 4 °C gelagert werden).
  3. Für die Anreicherung von 500 μg Peptiden fügen Sie genügend Aufschlämmung zu einer Spin-Spitze hinzu, um 20 mg Material zu übertragen. Waschen Sie die Schleuderspitze durch Zentrifugieren mit 200 μL 0,1% TFA.
  4. Resuspendieren Sie die Proben in 200 μL Lade-/Waschlösungsmittel (80% ACN und 3% TFA) und fließen Sie durch die Schleuderspitze. Laden Sie den Durchfluss 2x neu.
  5. Waschen Sie die Schleuderspitze 6x durch Zentrifugieren mit 200 μL Lade-/Waschlösungsmittel. Waschen Sie die Schleuderspitze mit 200 μL 80% ACN/0,1% FA-Lösung.
  6. Eluieren Sie die Peptide mit jeweils 200 μL von den folgenden: 60% ACN/0,1% FA (E1) und 40% ACN/0,1% FA (E2). Analysieren Sie jede Elution separat.
  7. Eluten Sie die Peptide mit jeweils 200 μL der folgenden Punkte: 20% ACN/0,1% FA und 0,1% FA. Kombinieren Sie die beiden Elutionen und analysieren Sie sie als eine Probe (E3).
  8. Eluieren Sie die Peptide mit jeweils 200 μL der folgenden: 40% ACN/3% TFA; 50 % ACN/6 % TFA, 200 mM NaCl; und 30 % ACN/0,1 % TFA. Kombinieren Sie diese Elionen und analysieren Sie sie nach dem Entsalzen mit einer verpackten Spitze als eine (E4).
  9. Konditionieren Sie das Material auf den basischen pH-Wert mit 200 μL 90% ACN/2,5% NH4OH für 3x. Entsorgen Sie diese Wäschen.
  10. Eluieren Sie die Peptide mit jeweils 200 μL: 60% ACN/10% NH 4 OH (E5) und 40% ACN/10% NH4OH (E6). Analysieren Sie diese Elutien separat nach dem Entsalzen mit einer verpackten Spitze.
  11. Eluieren Sie die Peptide mit jeweils 200 μL der folgenden: 20% ACN/10% NH4OH; 10 % ACN/10 % NH4OH; und 10% NH4 OH. Kombinieren Sie diese Elutien und analysieren Sie sie nach dem Entsalzen mit einer verpackten Spitze als eine (E7).
  12. Trocknen Sie alle Elutien vollständig unter Vakuum.

6. Nano-Flow-Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (nRPLC-MS)

HINWEIS: MS-Datenerfassungs- und Analysemethoden sind vielfältig, und daher wird hier in den folgenden Schritten nur eine vorgeschlagene LC-MS-Pipeline (und die damit verbundenen Parameter) beschrieben. Proben, die unter Verwendung der zuvor beschriebenen Probenvorbereitungs- und Anreicherungsschritte erzeugt wurden, können mit anderen instrumentellen Aufbauten, einschließlich der Verwendung kommerziell erhältlicher chromatographischer Säulen, bei ausreichender Datenqualität analysiert werden.

  1. Ziehen und verpacken Sie eine 15 cm lange Kapillare (75 μm Innendurchmesser) mit C18-Material, wie in19 beschrieben. Bereiten Sie die mobile Phase A (0,1% FA in Wasser) und die mobile Phase B (0,1% FA in ACN) vor.
  2. Rekonstituieren Sie angereicherte Peptidproben in 15 μL von 3% mobiler Phase B. Laden Sie 2 μL der Probe (~13% Probenvolumen) direkt auf die Säule. Analysieren Sie jede Probe im technischen Duplikat.
  3. Elute Peptide mit einem Gradienten von 3% bis 30% mobiler Phase B über 90 min bei einer Durchflussrate von 0,3 μL/min. Waschen Sie die Säule mit 75% B für 8 Minuten, gefolgt von 95% B für 8 min, und beenden Sie die Methode mit einer Gleichgewichtung bei 3% B für 12 min.
  4. Betrieb des Massenspektrometers im positiven Ionenmodus durch datenabhängige Erfassung der Top-20-Peaks mit folgenden Parametern: Sprühspannung 2 kV; MS1-Erkennung in LC/MS von 400-2.000 m/z bei 120.000 Auflösung, 2E5 Automatic Gain Control (AGC) Target, 100 ms maximale Einspritzzeit, 30% HF-Linse, Quadrupolisolierung mit 1,6 m/z Fenster, für Ladezustände 2-8 und unbestimmt und 30 s dynamischer Ausschluss; MS2-Detektion im LC/MS unter Verwendung einer abgestuften HCD-Fragmentierung bei 22 %, 30 % und 38 %, einer festen ersten Masse von 120 m/z bei einer Auflösung von 30.000, einem 5E4-AGC-Ziel und einer Mindestintensität von 2,5E4.

7. MS-Datenanalyse

HINWEIS: Eine Datenanalyse-Pipeline mit zwei verschiedenen Softwares zur Analyse desselben Datensatzes wird hier vorgestellt. Phosphorylierung und Glykosylierung können gleichzeitig mit einer einzigen Software anstelle von zwei separaten Software, wie hier beschrieben, durchsucht werden, obwohl im Allgemeinen die Softwaresuchzeit proportional zum Suchraum ist, d. H. Anzahl der betrachteten PTMs. Aus diesem Grund werden parallel zur Suche nach Glykopeptiden und Phosphopeptiden zwei verschiedene Software eingesetzt.

  1. Verarbeiten Sie Rohdatendateien mit der entsprechenden Software (siehe Materialverzeichnis).
    1. Suche nach Spektren in der UniProt Humandatenbank (oder einer geeigneten artspezifischen) Datenbank. Setzen Sie die Carbamidomethylierung von Cys als feste Modifikation. Legen Sie die maximale Anzahl der verpassten enzymatischen Spaltungen auf zwei fest.
  2. Suchen Sie in den Rohdatendateien mit einer kommerziellen Software (siehe Tabelle der Materialien) nach Glykopeptiden, dieanalysiert werden sollen 20. Verwenden Sie eine Vorläufermassentoleranz von 10 ppm und eine Fragmentmassentoleranz von 0,01 Da mit einer minimalen Peptidlänge von vier Resten.
    1. Suchen Sie mit der in die Software eingebetteten N-Glykan-Datenbank, die um typische Mannose-6-phosphat(M6P)-Glykane erweitert wurde, einschließlich HexNAc(2)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(3-4)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(2)Hex(3-4)Phospho(1) und HexNAc(3)Hex(3-4)Phospho(1).
    2. Setzen Sie die N-Glykosylierung als übliche Modifikation. Legen Sie die maximalen Gesamtmodifikationen pro Peptid-Spektralübereinstimmung (PSM) als eine häufige und zwei seltene fest.
    3. Legen Sie die folgenden variablen Modifikationen fest: Oxidation von Met (selten), Deamidation bei Asn und Gln (selten) und Phosphorylierung bei Ser, Thr und Tyr (häufig). Legen Sie die folgenden Identifikationsfilter fest: Score-Cutoff-> 150, |Log-Prob| > 1 und Delta Mod > 10.
    4. Exportieren und analysieren Sie Suchergebnisse auf den Registerkarten Proteine und Peptidgruppe.
    5. Scannen Sie die Identifikationen, die M6P-Glykane enthalten, manuell auf das Vorhandensein des PhosphoHex-Oxoniumions (243 m/z) in den MS/MS-Spektren und entfernen Sie falsch positive Identifikationen, die dieses diagnostische Ion nicht enthalten.
  3. Suchen Sie in den Rohdatendateien mit einer Open-Source-Software (siehe Materialverzeichnis) nach Phosphopeptiden, die analysiert werdensollen 21. Verwenden Sie eine Peptidtoleranz von 20 ppm für die erste Suche und eine Peptidtoleranz von 4,5 ppm für die Hauptsuche.
    1. Setzen Sie die maximale Anzahl von Modifikationen pro Peptid auf 5. Setzen Sie die PSM- und Protein-False-Discovery-Rate (FDR) auf 1% und die minimale Peptidlänge auf 7 Reste.
    2. Legen Sie variable Modifikationen wie Oxidation bei Met, N-terminale Proteinacetylierung und Phosphorylierung bei Ser, Thr und Tyr fest. Analysieren Sie Suchergebnisse mit den modificationSpecificPeptides-Dateien.
  4. Bestimmen Sie die Anzahl der Identifizierungen von PTMs auf Protein-, Peptid- und Modifikationsstellenebene.

Ergebnisse

Repräsentative Massenspektrometriedaten, einschließlich Rohdateien und Suchergebnisse, wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD03306522 an das ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt.

In dieser Arbeit wurden doppelte Injektionsreplikate für jede Anreicherungselution analysiert. Identifikationen aus beiden technischen Replikaten wurden in der Endanalyse zusammengetragen. Aufgrund der semi-stochastischen Natur der datenabhängigen E...

Diskussion

Die dual-funktionelle Ti(IV)-IMAC-Strategie ist nützlich für die gleichzeitige Analyse von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus derselben Probe in einem einzigen Probenvorbereitungs-Workflow. Es wurde auch gezeigt, dass ERLIC-basierte Methoden eine gleichzeitige Anreicherung von PTMs durchführen. Beide Strategien wurden zuvor für Deep Coverage in PTM-Analyseneingesetzt 14,18. Durch die Anpassung der dualen Ti-Methode an die Verkürzung der Probeninkubation...

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde zum Teil durch Zuschüsse des NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 und R21AG065728) und der Juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B und SRA-2016-168-S-B) unterstützt. Die hier vorgestellten Daten wurden zum Teil auch durch die Unterstützung eines NIH/NCATS UL1TR002373 Award durch das Institute for Clinical and Translational Research der University of Wisconsin gewonnen. Die Orbitrap-Instrumente wurden durch die Unterstützung eines NIH Shared Instrument Grant (NIH-NCRR S10RR029531) und des Office of the Vice Chancellor for Research and Graduate Education an der University of Wisconsin-Madison erworben. Wir möchten auch die großzügige Unterstützung der Organ- und Gewebespendeorganisation der University of Wisconsin anerkennen, die die menschliche Bauchspeicheldrüse für die Forschung zur Verfügung gestellt hat, und die Hilfe von Dan Tremmel, Dr. Sara D. Sackett und Prof. Jon Odorico für die Bereitstellung der Proben für unser Labor. Unser Forschungsteam möchte sich besonders bei den Familien bedanken, die für diese Studie Taschentücher gespendet haben. L.L. würdigt den NIH-Zuschuss S10OD025084, einen Pankreaskrebs-Pilotzuschuss des Carbone Cancer Center der University of Wisconsin (233-AAI9632) sowie eine Vilas Distinguished Achievement Professorship und die Charles Melbourne Johnson Distinguished Chair Professorship mit Mitteln der Wisconsin Alumni Research Foundation und der University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic Acid, Glacial (Certified ACS)Fisher ScientificA38S-500
Acetone (Certified ACS)Fisher ScientificA18-1
Acetonitrile, Optima LC/MS GradeFisher ScientificA955-4
Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificA637-500
Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus)Fisher ScientificA669-212
Byonic softwareProtein Metricsn/aCommercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/)
C18 BEH materialWaters186002353Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet)
CAE-Ti-IMAC, 100%J&K Scientific2749380-1GMaterial used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment
Cellcrusher kitCellcrushern/aUsed for grinding tissue samples into powder before extraction
Eppendorf 5424R MicrocentrifugeFisher Scientific05-401-205For temperature-controlled centrifugation
cOmplete protease inhibitor cocktail tabletsSigma11697498001
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)PromegaV3151Protein reducing agent
Ethanol, 200 proof (100%), USPFisher22-032-601
Fisherbrand Analog Vortex MixerFisher Scientific02-215-414
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)Fisher Scientific02-681-320
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL)Fisher Scientific02-681-321
Fisherbrand Model 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB120110For sample lysis using ultrasonication
Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS GradeFisher ScientificA117-50
Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter)Polymicro Technologies LLC100 m TSP075375For in-house pulled and packed columns with integrated emitter
Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O)Sigma-Aldrich339261-100MLUsed for opening emitter of pulled capillary column
Iodoacetamide, BioUltraSigmaI1149-5GProtein reducing reagent
MaxQuant softwaren/an/aFree software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/)
Multi-therm Shaker with heating and coolingBenchmark ScientificH5000-HCHeating block
Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pkWaters186000383Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each)
OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tipsAgilentA57003100Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions
P-2000 Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-2000/FFor pulling nano-capillary columns for LC-MS
PhosSTOP phosphatase inhibitor tabletsSigma4906845001
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide AssayThermo Fisher Scientific23275
PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å)PolyLCBMSX1203Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment
Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificP285-500
Pressure injection cell with integrated magnetic stirplateNext AdvancePC77-MAGFor packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit
Proteome Discoverer softwareThermo Fisher Scientificn/aCommercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)
SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120Savantn/aCentrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat)
SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/ElectrophoresisFisher ScientificBP2436200
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificS271-500
TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96Glygen CorporationTT2EMT.96Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile))Sigma90360-100ML
Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99%Fisher Scientific60-017-61
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)Fisher ScientificBP152-500
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec GradePromegaV5071
Urea (Certified ACS)Fisher ScientificU15-500
Water, Optima LC/MS GradeFisher ScientificW64

Referenzen

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