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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Las modificaciones post-traduccionales (PTM) cambian las estructuras y funciones de las proteínas. Los métodos para el enriquecimiento simultáneo de múltiples tipos de PTM pueden maximizar la cobertura en los análisis. Presentamos un protocolo que utiliza cromatografía de afinidad metálica inmovilizada ti(IV) de doble funcionalidad seguida de espectrometría de masas para el enriquecimiento y análisis simultáneo de la proteína N-glicosilación y fosforilación en tejidos pancreáticos.

Resumen

La espectrometría de masas puede proporcionar una cobertura profunda de las modificaciones post-traduccionales (PTM), aunque el enriquecimiento de estas modificaciones a partir de matrices biológicas complejas es a menudo necesario debido a su baja estequiometría en comparación con los analitos no modificados. La mayoría de los flujos de trabajo de enriquecimiento de PTM en péptidos en flujos de trabajo de proteómica de abajo hacia arriba, donde las proteínas se digieren enzimáticamente antes de que se analicen los péptidos resultantes, solo enriquecen un tipo de modificación. Sin embargo, es todo el complemento de PTM lo que conduce a las funciones biológicas, y el enriquecimiento de un solo tipo de PTM puede pasar por alto dicha diafonía de PTM. Se ha observado diafonía de PTM entre la glicosilación de proteínas y la fosforilación, los dos PTM más comunes en proteínas humanas y también los dos PTM más estudiados utilizando flujos de trabajo de espectrometría de masas. Utilizando la estrategia de enriquecimiento simultáneo descrita en este documento, ambos PTM se enriquecen a partir de tejido pancreático humano post mortem, una matriz biológica compleja. La cromatografía de afinidad metálica inmovilizada ti(IV) de doble funcionalidad se utiliza para separar varias formas de glicosilación y fosforilación simultáneamente en múltiples fracciones en un método conveniente basado en punta de espín, lo que permite análisis aguas abajo de posibles interacciones de diafonía PTM. Este flujo de trabajo de enriquecimiento para glicopéptidos y fosfopéptidos se puede aplicar a varios tipos de muestras para lograr un perfil profundo de múltiples PTM e identificar posibles moléculas objetivo para futuros estudios.

Introducción

Las modificaciones post-traduccionales de proteínas (PTM) desempeñan un papel importante en la modulación de las estructuras proteicas y, en consecuencia, en sus funciones y procesos biológicos posteriores. La diversidad del proteoma humano aumenta exponencialmente debido a la variabilidad combinatoria que ofrecen varios PTM. Diferentes variantes de proteínas de sus secuencias canónicas predichas por el genoma se conocen como proteoformas, y muchos proteoformas surgen de PTM1. El estudio de la diversidad proteoforma en salud y enfermedad se ha convertido en un área de investigación de gran interés en los últimos años 2,3.

El estudio de proteoformas y más específicamente PTM con gran profundidad se ha vuelto más fácil a través del desarrollo de métodos proteómicos basados en espectrometría de masas (EM). Usando EM, los analitos se ionizan, fragmentan e identifican en función de los m /z de los fragmentos. Los métodos de enriquecimiento a menudo son necesarios debido a la baja abundancia relativa de PTM en comparación con las formas no modificadas de proteínas. Aunque el análisis de proteínas intactas y sus PTM, llamados análisis de arriba hacia abajo, se han vuelto más rutinarios, la digestión enzimática de las proteínas y el análisis de sus péptidos componentes en los análisis de abajo hacia arriba sigue siendo la ruta más utilizada para el análisis de PTM. Los dos PTM más ampliamente estudiados, y los dos PTM más comunes in vivo, son la glicosilación y la fosforilación4. Estos dos PTM desempeñan un papel importante en la señalización y el reconocimiento celular y, por lo tanto, son modificaciones importantes para caracterizar en la investigación de enfermedades.

Las propiedades químicas de varios PTM a menudo proporcionan rutas hacia el enriquecimiento de estos PTM a nivel de proteínas y péptidos antes del análisis. La glicosilación es un PTM hidrófilo debido a la abundancia de grupos hidroxilo en cada monosacárido. Esta propiedad se puede utilizar para enriquecer glicopéptidos en cromatografía de interacción hidrófila (HILIC), que puede separar más glicopéptidos hidrófilos de los péptidos hidrofóbicos no modificados5. La fosforilación agrega la fracción de fosfato, que está cargada negativamente excepto a pH ácido. Debido a esta carga, se pueden usar varios cationes metálicos, incluido el titanio, para atraer y unir fosfopéptidos mientras que las especies no fosforiladas se eliminan. Este es el principio de la cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC). Se pueden encontrar más discusiones sobre estas y otras estrategias de enriquecimiento para la glicosilación y la fosforilación en revisiones recientes 6,7.

A menudo se necesitan cantidades comparativamente grandes de material peptídico de partida (0,5 mg o más) para los protocolos de enriquecimiento debido a la baja estequiometría de los PTM en los péptidos. En escenarios en los que esta cantidad de muestra puede no obtenerse fácilmente, como la biopsia del núcleo tumoral o los análisis del líquido cefalorraquídeo, es beneficioso utilizar flujos de trabajo fáciles que den como resultado la máxima información biomolecular. Las estrategias recientes desarrolladas por nuestro laboratorio y otros han destacado el análisis simultáneo y paralelo de la glicosilación y la fosforilación utilizando el mismo flujo de trabajo de enriquecimiento de PTM 8,9,10,11,12. Aunque las propiedades químicas de estos dos PTM pueden diferir, estos PTM pueden analizarse en múltiples pasos debido a las innovadoras técnicas de separación y materiales utilizados. Por ejemplo, la cromatografía de interacción repulsión-hidrofílica electrostática (ERLIC) superpone separaciones basadas en interacciones hidrófilas entre analitos y la fase móvil con interacciones carga-carga entre analitos y el material de fase estacionaria 13,14,15,16. A pH ácido, la atracción de péptidos fosforilados a la fase estacionaria puede mejorar su retención y separación de péptidos no modificados. El material que consiste en Ti(IV) inmovilizado en microesferas hidrofílicas se puede utilizar para la elución basada en HILIC e IMAC para separar fosfopéptidos y glicopéptidos neutros, ácidos y manosa-6-fosforilados17,18. Esta estrategia se conoce como Ti(IV)-IMAC de doble funcionalidad. El uso de estas estrategias para enriquecer varios PTM en un solo flujo de trabajo puede hacer que los análisis de las posibles interacciones de diafonía de PTM sean más accesibles. Además, la cantidad total de muestra y los requisitos de tiempo son menores que los métodos de enriquecimiento convencionales cuando se realizan en paralelo (es decir, HILIC e IMAC en alícuotas de muestra separadas).

Para demostrar la estrategia dual-funcional Ti(IV)-IMAC para el análisis simultáneo de la glicosilación y fosforilación de proteínas, la hemos aplicado para analizar tejidos pancreáticos humanos post-mortem. El páncreas produce tanto enzimas digestivas como hormonas reguladoras, incluyendo insulina y glucagón. La función pancreática se ve afectada en la enfermedad pancreática. En la diabetes, la regulación del azúcar en la sangre se ve afectada, lo que lleva a niveles más altos de glucosa en la sangre. En la pancreatitis, la inflamación resulta de la autodigestión del órgano3. Los cambios en los perfiles de PTM, incluida la glicosilación y la fosforilación, pueden resultar, como suele ser el caso, en otras enfermedades.

Aquí, describimos un protocolo para un método de enriquecimiento simultáneo basado en punta de espín, basado en una estrategia Ti(IV)-IMAC de doble funcionalidad, para N-glicopéptidos y fosfopéptidos derivados de proteínas extraídas del tejido pancreático. El protocolo incluye extracción y digestión de proteínas, enriquecimiento, recopilación de datos de EM y procesamiento de datos, como se puede ver en la Figura 1. Los datos representativos de este estudio están disponibles a través de ProteomeXchange Consortium con el identificador PXD033065.

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Figura 1: Flujo de trabajo para el análisis simultáneo de N-glicopéptidos y fosfopéptidos de tejidos pancreáticos humanos. Los tejidos primero se criopulforizan en un polvo fino antes de la extracción de proteínas utilizando el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS). Las proteínas se someten a digestión enzimática. Los péptidos resultantes se alicitan antes del enriquecimiento utilizando Ti(IV)-IMAC de doble funcionalidad. Los datos brutos se recopilan utilizando cromatografía líquida de fase inversa a nanoescala-espectrometría de masas (nRPLC-MS) y se analizan utilizando un software de búsqueda de bases de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este protocolo está destinado a hacer que los análisis ptm sean más accesibles y permitir un análisis más generalizado de múltiples PTM en el mismo flujo de trabajo. Este protocolo se puede aplicar a otras matrices biológicas complejas, incluidas las células y los biofluidos.

Protocolo

Se obtuvo el consentimiento para el uso de tejidos pancreáticos para la investigación de los familiares del fallecido y se obtuvo una autorización de la Junta de Revisión Institucional de Ciencias de la Salud de la Universidad de Wisconsin-Madison. La supervisión del IRB no es necesaria porque no involucra sujetos humanos como se reconoce en 45 CFR 46.102 (f).

PRECAUCIÓN: Se debe tener cuidado al manipular los reactivos utilizados en este protocolo, que incluyen ácidos (fórmico, acético, trifluoroacético), bases (hidróxido de amonio) y criógenos (nitrógeno líquido). Lea las hojas de datos de seguridad de los reactivos utilizados para familiarizarse con los peligros asociados y las precauciones necesarias. Las concentraciones denotadas usando porcentajes son volumen/volumen total (v/v) y se diluyen con agua.

1. Criopulforación tisular, lisis y extracción de proteínas

  1. Llena un dewar con nitrógeno líquido. Enfríe previamente las partes del pulverizador de tejido que entrarán en contacto con los tejidos pancreáticos, a saber, la cámara, el pulverizador y la cuchara de recuperación en un recipiente de poliestireno.
  2. Transfiera las piezas de tejido congelado al soporte de muestra preenfriado y agregue una cucharada de nitrógeno líquido al tejido.
  3. Coloque el pulverizador en la cámara y golpee con un mazo de cinco a diez veces para aplastar la muestra. Retire el pulverizador de la cámara y raspe el polvo y los trozos de tejido adherente.
  4. Agregue una cucharada de nitrógeno líquido a la cámara si los tejidos comienzan a derretirse. Repita el proceso de pulverización hasta que la muestra sea un polvo fino sin grandes trozos de tejido. Divida las muestras en aproximadamente 100 mg de alícuotas en tubos preenfriados.
  5. Prepare un tampón de lisis que contenga 4% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 150 mM de NaCl y 25 mM de Tris (pH = 7.4). Disolver un comprimido de proteasa e inhibidor de la fosfatasa en 500 μL de agua para un stock 20x de cada uno. Agregue el volumen requerido de 20x stock de cada inhibidor al tampón de lisis para una concentración final de 1x.
  6. Añadir 600 μL de tampón de lisis por cada 100 mg de tejido al tubo e incubar a 95 °C en un bloque calefactor durante 10 min con agitación a 800 rpm. Retire las muestras del bloque calefactor y déjelas enfriar a temperatura ambiente.
  7. Sonicar las muestras a 60 W de energía (20 kHz) durante 45 s utilizando pulsos de 15 s con un descanso de 30 s en el medio. Pellet las muestras a 3.000 x g durante 15 min a 4 °C.
  8. Agregue el sobrenadante a un disolvente de precipitación 5x, 300 μL de tampón de lisis a 1,5 ml de disolvente de precipitación, que contiene 50% de acetona, 49,9% de etanol y 0,1% de ácido acético. Enfriar durante la noche a -20 °C.
  9. Vuelva a gletizar las muestras a 3.000 x g durante 15 min a 4 °C y retire el sobrenadante. Lave el pellet rompiendo con una espátula y mezclándolo con la misma cantidad de disolvente de precipitación. Pellet de nuevo, repitiendo el paso de lavado 2x.
  10. Pellet la muestra a 16.000 x g durante 15 min a 4 °C. Seque al aire el pellet de muestra en una campana extractora de humos durante 15 minutos y guárdelo a -80 °C hasta que esté listo para continuar.

2. Digestión y desalinización de proteínas

  1. Resuspenda el pellet de proteína en 300 μL de tampón de digestión recién hecho que contiene 50 mM de bicarbonato de trietilamonio (TEAB) y 8 M de urea.
  2. Estimar la concentración de proteínas de la solución utilizando un ensayo de proteínas de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  3. A la proteína en la solución, agregue ditiotreitol (TDT) a una concentración final de 5 mM, mezcle y reduzca a temperatura ambiente durante 1 h. Luego, agregue yodoacetamida (IAA) a una concentración final de 15 mM, mezcle y alquile a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Apague la alquilación repitiendo la adición de TDT en el mismo volumen que antes y mezcle.
  4. Añadir LysC/tripsina en una proporción enzima:100 enzima/proteína e incubar a 37 °C durante 4 h. Luego, agregue 50 mM TEAB para diluir la urea de 8 M utilizada para < 1 M. Agregue tripsina en una proporción de enzima: proteína 1: 100 e incube a 37 ° C durante la noche.
  5. Apague la digestión con la adición de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,3% v / v. Por cada 1 mg de proteína de partida, acondicionar un cartucho desalinizante (1 cc, 10 mg) con 1 ml de acetonitrilo (ACN) y 3x con 1 ml de TFA al 0,1%.
  6. Cargue la mezcla digerida en el cartucho de desalinizante. Lavar la mezcla 3x usando 1 mL de TFA al 0.1%. Si la elución es lenta, aplique presión positiva pero evite un caudal > una gota por segundo.
  7. Péptidos eluto utilizando 1 ml de 60% de ACN y 0,1% de solución de ácido fórmico (FA). Seque los péptidos eluidos a aproximadamente 35 °C utilizando un concentrador de vacío centrífugo hasta que el disolvente se haya evaporado por completo.
  8. Resuspend péptidos en 300 μL de agua y estimar las concentraciones de péptidos utilizando un ensayo de péptidos de acuerdo con el protocolo del fabricante. Divida los péptidos en alícuotas de 500 μg y séquelos por completo.

3. Enriquecimiento ERLIC N-glicopéptido

NOTA: Las velocidades y los tiempos exactos de la centrífuga pueden diferir según las muestras y deben optimizarse. En general, 300 x g durante 2 min es apropiado para el acondicionamiento y lavado del material y 100 x g para 5 min para eluir.

  1. Pesar aproximadamente 3 mg de algodón y empacarlo en una punta de pipeta vacía de 200 μL (punta de espín; ver Tabla de materiales).
  2. Transfiera un fuerte material de enriquecimiento de intercambio aniónico a un tubo y agregue 200 μL de TFA al 0,1% por cada material de 10 mg. Para el enriquecimiento de 500 μg de péptidos, use 15 mg del material. Activar el material agitando durante 15 min.
  3. Usando un adaptador de tubo, coloque la punta de centrifugado sobre un tubo de 2 ml y agregue suficiente suspensión a la punta para 15 mg de material. Retire el líquido girando en una centrífuga de sobremesa.
  4. Acondicionar el material centrifugando 3x con 200 μL de ACN. Repita el acondicionamiento por triplicado con acetato de amonio de 100 mM (NH4Ac), 1% de TFA y 80% de ACN/0,1% de TFA (tampón de carga).
  5. Resuspend 500 μg muestras de péptidos en aproximadamente 200 μL de tampón de carga y flujo a través de la punta de espín. Vuelva a cargar el flujo 2x para garantizar un enlace completo.
  6. Lave el material centrifugando 5x usando 200 μL de 80% ACN/0.1% TFA, y luego 2x usando 200 μL de 80% ACN/0.1% FA.
  7. Eluir los péptidos centrifugando con 200 μL de cada uno de los siguientes: 50% ACN/0,1% FA (E1); 0,1% AF (E2); 0,1% AFC (E3); 300 mM KH2PO4, 10% ACN (E4).
  8. Lave el material centrifugando 2x con 200 μL de 80% ACN/5% NH4OH. Eluir los péptidos restantes con 200 μL de 10% NH4OH (E5).
  9. Seque todas las eluciones completamente utilizando un concentrador de vacío centrífugo a aproximadamente 35 °C.
  10. Realice la desalinización de la elución básica (E5) utilizando una punta de desalinización de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  11. Seque la elución de la punta de desalinización utilizando un concentrador de vacío centrífugo a aproximadamente 35 °C hasta completarla.

4. Enriquecimiento fosfopéptido Ti(IV)-IMAC

NOTA: Las velocidades y los tiempos exactos de la centrífuga pueden diferir según las muestras y deben optimizarse. En general, 300 x g durante 2 min es apropiado para el acondicionamiento y lavado del material y 100 x g para 5 min para eluir.

  1. Pesar aproximadamente 3 mg de algodón y empacarlo en una punta de pipeta vacía de 200 μL (spin-tip).
  2. Transfiera el material de enriquecimiento de fosfopéptidos Ti-IMAC a un tubo y agregue 200 μL de TFA al 0,1% por cada material de 10 mg. Para el enriquecimiento de péptidos de 500 μg, use 10 mg de material.
  3. Usando un adaptador de tubo, coloque la punta de centrifugado sobre un tubo de 2 ml y agregue suficiente suspensión a la punta para obtener material de 10 mg. Retire el líquido girando en una centrífuga de sobremesa.
  4. Acondicione el material con 200 μL de 40% ACN/3% TFA utilizando la misma configuración de centrífuga descrita anteriormente. Muestras de péptidos de resuspend en 200 μL de ACN al 40% /TFA al 3% y flujo a través de la punta de espín. Vuelva a cargar el flujo dos veces para garantizar un enlace más completo.
  5. Lave el material centrifugando con 200 μL de 50% de ACN, 6% de TFA y 200 mM de solución de NaCl, seguido de un lavado 2x en 200 μL de 30% de ACN y 0.1% de solución de TFA.
  6. Péptidos eluto con 200 μL de 10% NH4OH. Secar la elución completamente al vacío. Realice la desalinización utilizando una punta de desalinización de acuerdo con el protocolo del fabricante. Seque la elución de la punta de desalinización al vacío hasta completarla.

5. Enriquecimiento simultáneo de Ti(IV) de doble funcionalidad

NOTA: Las velocidades y los tiempos exactos de la centrífuga pueden diferir según las muestras y deben optimizarse. En general, 300 x g durante 2 min es apropiado para el acondicionamiento y lavado del material y 100 x g para 5 min para eluir.

  1. Pesar aproximadamente 3 mg de algodón y empacarlo en una punta de espín vacía.
  2. Transfiera aproximadamente 1 g de material Ti(IV)-IMAC a un tubo. Añadir 0,1% de AGT a una concentración conocida de material, por ejemplo, 20 mg/200 μL (el material puede almacenarse en esta suspensión a 4 °C).
  3. Para el enriquecimiento a partir de péptidos de 500 μg, agregue suficiente suspensión a una punta de espín para transferir 20 mg de material. Lavar la punta de centrifugado centrifugando con 200 μL de TFA al 0,1%.
  4. Resuspender las muestras en 200 μL de disolvente de carga/lavado (80% ACN y 3% TFA) y fluir a través de la punta de centrifugado. Vuelva a cargar el flujo a través de 2x.
  5. Lave la punta de centrifugado 6x centrifugando con 200 μL de disolvente de carga/lavado. Lave la punta de centrifugado con 200 μL de solución de ACN al 80%/0,1% de FA.
  6. Eluye los péptidos con 200 μL de cada uno de los siguientes: 60% ACN/0.1% FA (E1) y 40% ACN/0.1% FA (E2). Analice cada elución por separado.
  7. Elute los péptidos con 200 μL de cada uno de los siguientes: 20% ACN/0.1% FA y 0.1% FA. Combine las dos eluciones y analice como una muestra (E3).
  8. Eluir los péptidos con 200 μL de cada uno de los siguientes: 40% ACN/3% TFA; 50% ACN/6% TFA, 200 mM NaCl; y 30% ACN/0,1% TFA. Combine estas eluciones y analice como una (E4) después de desalinizar con una punta empaquetada.
  9. Acondicionar el material a pH básico utilizando 200 μL de 90% ACN/2.5% NH4OH para 3x. Deseche estos lavados.
  10. Eluye los péptidos con 200 μL de cada uno de los siguientes: 60% ACN/10% NH4OH (E5) y 40% ACN/10% NH4OH (E6). Analice estas eluciones por separado después de desalinizar con una punta empaquetada.
  11. Eluir los péptidos con 200 μL de cada uno de los siguientes: 20% ACN/10% NH4OH; 10% ACN/10% NH4OH; y 10% NH4OH. Combine estas eluciones y analice como una (E7) después de desalinizar usando una punta empaquetada.
  12. Secar todas las eluciones completamente al vacío.

6. Cromatografía líquida de fase inversa de nanoflujo-espectrometría de masas (nRPLC-MS)

NOTA: Los métodos de adquisición y análisis de datos de MS son diversos y, por lo tanto, solo se describe aquí una canalización LC-MS sugerida (y sus parámetros asociados) en los siguientes pasos. Las muestras generadas utilizando los pasos de preparación y enriquecimiento de muestras descritos anteriormente se pueden analizar utilizando otras configuraciones instrumentales, incluido el uso de columnas cromatográficas disponibles comercialmente, dada la calidad suficiente de los datos.

  1. Tire y empaque un capilar de 15 cm de largo (75 μm de diámetro interior) utilizando material C18 como se describe en19. Preparar la fase A móvil (0,1% FA en agua) y la fase B móvil (0,1% FA en ACN).
  2. Reconstituir muestras de péptidos enriquecidos en 15 μL de fase B móvil al 3%. Carga 2 μL de la muestra (~13% de volumen de muestra) directamente sobre la columna. Analizar cada muestra en duplicado técnico.
  3. Péptidos elutivos utilizando un gradiente de fase B móvil del 3% al 30% durante 90 min a un caudal de 0,3 μL/min. Lavar la columna usando 75% B durante 8 min seguido de 95% B durante 8 min, terminando el método con equilibrio a 3% B durante 12 min.
  4. Operar el espectrómetro de masas en el modo de iones positivos utilizando la adquisición dependiente de datos de los 20 picos superiores con los siguientes parámetros: voltaje de pulverización 2 kV; Detección de MS1 en LC/MS de 400-2.000 m/z a 120.000 de resolución, objetivo de control automático de ganancia (AGC) 2E5, tiempo máximo de inyección de 100 ms, lente RF al 30%, aislamiento cuadrupolo con ventana de 1,6 m/z , para estados de carga 2-8 e indeterminados, y exclusión dinámica de 30 s; Detección de MS2 en lc/MS utilizando fragmentación escalonada de HCD al 22%, 30% y 38%, primera masa fija de 120 m/z a una resolución de 30,000, objetivo de AGC 5E4 y requisito de intensidad mínima de 2.5E4.

7. Análisis de datos de EM

NOTA: Aquí se presenta una canalización de análisis de datos que utiliza dos software diferentes para analizar el mismo conjunto de datos. La fosforilación y la glicosilación se pueden buscar al mismo tiempo utilizando un solo software en lugar de dos software separados como se describe aquí, aunque en general, el tiempo de búsqueda del software es proporcional al espacio de búsqueda, es decir, el número de PTM considerados. Por esta razón, se utilizan dos programas diferentes en paralelo a la búsqueda de glicopéptidos y fosfopéptidos.

  1. Procese archivos de datos sin procesar utilizando el software apropiado (consulte la Tabla de materiales).
    1. Buscar espectros en la base de datos humana UniProt (o apropiada para cada especie). Establecer la carbamidometilación de Cys como una modificación fija. Establezca el número máximo de escisiones enzimáticas perdidas como dos.
  2. En los archivos de datos en bruto, utilizando un software comercial (ver Tabla de Materiales), busque glicopéptidos para ser analizados20. Utilice una tolerancia de masa de precursor de 10 ppm y una tolerancia de masa de fragmento de 0,01 Da con una longitud mínima de péptido de cuatro residuos.
    1. Busque utilizando la base de datos de N-glicanos integrada en software ampliada con los típicos glicanos de manosa-6-fosfato(M6P),incluidos HexNAc(2)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(3-4)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(2)Hex(3-4)Phospho(1) y HexNAc(3)Hex(3-4)Phospho(1).
    2. Establezca la N-glicosilación como una modificación común. Establezca las modificaciones totales máximas por coincidencia espectral peptídica (PSM) como una común y dos raras.
    3. Establezca las siguientes modificaciones variables: oxidación de Met (raro), desamidación en Asn y Gln (raro) y fosforilación en Ser, Thr y Tyr (común). Establezca los siguientes filtros de identificación: corte de puntuación > 150, |problema de registro| > 1, y la puntuación delta mod > 10.
    4. Exporte y analice los resultados de búsqueda en las pestañas Proteínas y Grupo de péptidos.
    5. Examinar manualmente las identificaciones que contienen glicanos M6P para detectar la presencia del ion fosfohex oxonio (243 m/z) en los espectros MS/MS y eliminar las identificaciones de falsos positivos, que no contienen este ion diagnóstico.
  3. En los archivos de datos en bruto, utilizando un software de código abierto (ver Tabla de Materiales), busque fosfopéptidos para ser analizados21. Utilice una tolerancia al péptido de primera búsqueda de 20 ppm y una tolerancia al péptido de búsqueda principal de 4,5 ppm.
    1. Establezca el número máximo de modificaciones por péptido en 5. Establezca la tasa de falso descubrimiento de PSM y proteínas (FDR) en 1% y la longitud mínima del péptido en 7 residuos.
    2. Establezca modificaciones variables como la oxidación en Met, la acetilación de proteínas N-terminales y la fosforilación en Ser, Thr y Tyr. Analice los resultados de búsqueda mediante los archivos modificationSpecificPeptides.
  4. Determine el número de identificaciones de PTM a nivel de proteína, péptido y sitio de modificación.

Resultados

Los datos representativos de espectrometría de masas, incluidos los archivos sin procesar y los resultados de búsqueda, se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador del conjunto de datos PXD03306522.

En este trabajo, se analizaron réplicas de inyección duplicadas para cada elución de enriquecimiento. Las identificaciones realizadas a partir de ambas réplicas técnicas se recopilaron en el...

Discusión

La estrategia Ti(IV)-IMAC de doble funcionalidad es útil para el análisis simultáneo de N-glicopéptidos y fosfopéptidos de la misma muestra en un solo flujo de trabajo de preparación de muestras. También se ha demostrado que los métodos basados en ERLIC realizan un enriquecimiento simultáneo de PTM. Ambas estrategias se han utilizado previamente para la cobertura profunda en los análisis de PTM14,18. Al adaptar el método Ti dual para disminuir el tiemp...

Divulgaciones

Los autores no declaran intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada en parte por fondos de subvención de los NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 y R21AG065728) y juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B y SRA-2016-168-S-B). Los datos presentados aquí también se obtuvieron en parte a través del apoyo de un premio NIH / NCATS UL1TR002373 a través del Instituto de Investigación Clínica y Traslacional de la Universidad de Wisconsin. Los instrumentos Orbitrap se compraron a través del apoyo de una subvención de instrumentos compartidos de los NIH (NIH-NCRR S10RR029531) y la Oficina del Vicerrector de Investigación y Educación de Posgrado de la Universidad de Wisconsin-Madison. También nos gustaría agradecer el generoso apoyo de la Organización de Donación de Órganos y Tejidos de la Universidad de Wisconsin que proporcionó páncreas humano para la investigación y la ayuda de Dan Tremmel, la Dra. Sara D. Sackett y el Prof. Jon Odorico por proporcionar las muestras a nuestro laboratorio. Nuestro equipo de investigación desea dar un agradecimiento especial a las familias que donaron tejidos para este estudio. L.L. reconoce la subvención de los NIH S10OD025084, una subvención piloto de cáncer de páncreas del Centro oncológico Carbone de la Universidad de Wisconsin (233-AAI9632), así como una Cátedra Vilas distinguished Achievement y la Cátedra Charles Melbourne Johnson Distinguished Chair con fondos proporcionados por la Wisconsin Alumni Research Foundation y la Facultad de Farmacia de la Universidad de Wisconsin-Madison.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic Acid, Glacial (Certified ACS)Fisher ScientificA38S-500
Acetone (Certified ACS)Fisher ScientificA18-1
Acetonitrile, Optima LC/MS GradeFisher ScientificA955-4
Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificA637-500
Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus)Fisher ScientificA669-212
Byonic softwareProtein Metricsn/aCommercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/)
C18 BEH materialWaters186002353Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet)
CAE-Ti-IMAC, 100%J&K Scientific2749380-1GMaterial used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment
Cellcrusher kitCellcrushern/aUsed for grinding tissue samples into powder before extraction
Eppendorf 5424R MicrocentrifugeFisher Scientific05-401-205For temperature-controlled centrifugation
cOmplete protease inhibitor cocktail tabletsSigma11697498001
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)PromegaV3151Protein reducing agent
Ethanol, 200 proof (100%), USPFisher22-032-601
Fisherbrand Analog Vortex MixerFisher Scientific02-215-414
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)Fisher Scientific02-681-320
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL)Fisher Scientific02-681-321
Fisherbrand Model 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB120110For sample lysis using ultrasonication
Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS GradeFisher ScientificA117-50
Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter)Polymicro Technologies LLC100 m TSP075375For in-house pulled and packed columns with integrated emitter
Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O)Sigma-Aldrich339261-100MLUsed for opening emitter of pulled capillary column
Iodoacetamide, BioUltraSigmaI1149-5GProtein reducing reagent
MaxQuant softwaren/an/aFree software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/)
Multi-therm Shaker with heating and coolingBenchmark ScientificH5000-HCHeating block
Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pkWaters186000383Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each)
OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tipsAgilentA57003100Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions
P-2000 Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-2000/FFor pulling nano-capillary columns for LC-MS
PhosSTOP phosphatase inhibitor tabletsSigma4906845001
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide AssayThermo Fisher Scientific23275
PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å)PolyLCBMSX1203Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment
Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificP285-500
Pressure injection cell with integrated magnetic stirplateNext AdvancePC77-MAGFor packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit
Proteome Discoverer softwareThermo Fisher Scientificn/aCommercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)
SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120Savantn/aCentrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat)
SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/ElectrophoresisFisher ScientificBP2436200
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificS271-500
TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96Glygen CorporationTT2EMT.96Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile))Sigma90360-100ML
Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99%Fisher Scientific60-017-61
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)Fisher ScientificBP152-500
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec GradePromegaV5071
Urea (Certified ACS)Fisher ScientificU15-500
Water, Optima LC/MS GradeFisher ScientificW64

Referencias

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