Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שינויים לאחר התרגום (PTMs) משנים את המבנים והתפקודים של חלבונים. שיטות להעשרה בו-זמנית של סוגי PTM מרובים יכולות למקסם את הכיסוי בניתוחים. אנו מציגים פרוטוקול באמצעות כרומטוגרפיית זיקה מתכתית משותקת Ti(IV) דו-תפקודית ואחריה ספקטרומטריית מסה להעשרת וניתוח בו זמנית של חלבון N-גליקוזילציה וזרחון ברקמות הלבלב.

Abstract

ספקטרומטריית מסות יכולה לספק כיסוי מעמיק של שינויים לאחר התרגום (PTMs), אם כי העשרה של שינויים אלה ממטריצות ביולוגיות מורכבות נחוצה לעתים קרובות בשל הסטויכיומטריה הנמוכה שלהם בהשוואה לאנליטים שאינם משתנים. רוב תהליכי ההעשרה של PTMs על פפטידים בתהליכי עבודה של פרוטאומיקה מלמטה למעלה, שבהם חלבונים מתעכלים באופן אנזימטי לפני שנותחים את הפפטידים המתקבלים, מעשירים רק סוג אחד של שינוי. עם זאת, כל ההשלמה של PTMs היא שמובילה לתפקודים ביולוגיים, והעשרת סוג אחד של PTM עלולה לפספס הצלבה כזו של PTMs. הצלבת PTM נצפתה בין גליקוזילציה של חלבונים לזרחון, שני ה-PTMs הנפוצים ביותר בחלבונים אנושיים וגם שני ה-PTMs הנחקרים ביותר באמצעות זרימות עבודה של ספקטרומטריית מסות. באמצעות אסטרטגיית ההעשרה הבו-זמנית המתוארת כאן, שני ה-PTMs מועשרים מרקמת לבלב אנושית שלאחר המוות, מטריצה ביולוגית מורכבת. כרומטוגרפיית זיקה מתכתית משותקת Ti(IV) דו-תפקודית משמשת להפרדת צורות שונות של גליקוסילציה וזרחון בו זמנית במספר שברים בשיטה נוחה המבוססת על קצה ספין, ומאפשרת ניתוחים במורד הזרם של אינטראקציות פוטנציאליות של PTM crosstalk. ניתן ליישם את זרימת העבודה הזו של העשרה עבור גליקו ופוספופפטידים על סוגי דגימות שונים כדי להשיג פרופיל עמוק של מספר PTMs ולזהות מולקולות מטרה פוטנציאליות למחקרים עתידיים.

Introduction

שינויים פוסט-תרגומיים של חלבונים (PTMs) ממלאים תפקיד מרכזי בוויסות מבני חלבונים וכתוצאה מכך בתפקודם ובתהליכים ביולוגיים במורד הזרם. המגוון של הפרוטאום האנושי גדל באופן אקספוננציאלי בשל השונות הקומבינטורית הניתנת על ידי PTMs שונים. גרסאות שונות של חלבונים מהרצפים הקאנוניים שלהם כפי שנחזה על ידי הגנום ידועות בשם פרוטאופורמים, ופרוטאופורמים רבים נובעים מ- PTMs1. חקר מגוון הפרוטאופורמים בבריאות ובמחלות הפך לתחום מחקר בעל עניין רב בשנים האחרונות 2,3.

המחקר של פרוטאופורמים וליתר דיוק PTMs עם עומק רב הפך facile יותר באמצעות פיתוח של ספקטרומטריית מסה (MS) מבוסס שיטות פרוטאומיקה מבוססות. באמצעות טרשת נפוצה, האנליטים מיוננים, מקוטעים ומזהים על סמך m/z של שברים. שיטות העשרה נחוצות לעתים קרובות בשל השפע היחסי הנמוך של PTMs בהשוואה לצורות חלבונים שלא שונו. אף על פי שניתוח של חלבונים שלמים וה-PTMs שלהם, הנקראים ניתוחים מלמעלה למטה, הפכו לשגרתיים יותר, העיכול האנזימטי של חלבונים וניתוח הפפטידים המרכיבים אותם באנליזות מלמטה למעלה הוא עדיין המסלול הנפוץ ביותר לניתוח PTM. שני ה-PTMs הנחקרים ביותר, ושני ה-PTMs הנפוצים ביותר ב-vivo, הם גליקוזילציה וזרחון4. שני PTMs אלה ממלאים תפקידים מרכזיים באיתות וזיהוי תאים ולכן הם שינויים חשובים שיש לאפיין בחקר מחלות.

התכונות הכימיות של PTMs שונים מספקות לעתים קרובות נתיבים לקראת העשרה של PTMs אלה ברמות החלבון והפפטידים לפני הניתוח. גליקוזילציה היא PTM הידרופילי בשל שפע של קבוצות הידרוקסיל על כל חד-סוכר. ניתן להשתמש בתכונה זו כדי להעשיר את הגליקופפטידים בכרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופילית (HILIC), שיכולה להפריד בין גליקופפטידים הידרופיליים יותר לבין הפפטידים ההידרופוביים שאינם מהונדסים5. פוספורילציה מוסיפה את הפוספט מואטי, אשר נטען שלילית למעט ב- pH חומצי. בשל מטען זה, ניתן להשתמש בקטיונים שונים של מתכות, כולל טיטניום, כדי למשוך ולקשור פוספופפטידים בזמן שמינים שאינם זרחניים נשטפים. זהו העיקרון של כרומטוגרפיית זיקה מתכתית משותקת (IMAC). דיונים נוספים על אסטרטגיות העשרה אלה ואחרות לגליקוסילציה וזרחון ניתן למצוא בסקירות אחרונות 6,7.

כמויות גדולות יחסית של חומר פפטידי מתחיל (0.5 מ"ג או יותר) נחוצות לעתים קרובות לפרוטוקולי העשרה בשל הסטויכיומטריה הנמוכה של PTMs על פפטידים. בתרחישים שבהם כמות זו של דגימה עשויה שלא להתקבל בקלות, כגון ביופסיה של ליבת הגידול או ניתוחי נוזל מוחי, כדאי להשתמש בתהליכי עבודה של facile המביאים למידע ביומולקולרי מרבי. אסטרטגיות אחרונות שפותחו על ידי המעבדה שלנו ואחרות הדגישו את הניתוח הבו-זמני והמקביל של גליקוזילציה וזרחון באמצעות אותה זרימת עבודה להעשרת PTM 8,9,10,11,12. אף על פי שהתכונות הכימיות של שני PTMs אלה עשויות להיות שונות, ניתן לנתח PTMs אלה במספר שלבים בשל טכניקות ההפרדה והחומרים החדשניים שבהם נעשה שימוש. לדוגמה, כרומטוגרפיית של דחייה אלקטרוסטטית-הידרופילית (ERLIC) מכסה הפרדות המבוססות על אינטראקציות הידרופיליות בין אנליטים לבין הפאזה הניידת עם אינטראקציות מטען-מטען בין אנליטים לבין חומר הפאזה הנייח 13,14,15,16. ב-pH חומצי, המשיכה של פפטידים זרחניים לשלב הנייח יכולה לשפר את שימורם וההפרדה שלהם מפפטידים שאינם מהונדסים. ניתן להשתמש בחומר המורכב מ-Ti(IV) המשותק במיקרו-ספירות הידרופיליות עבור אלוטיון מבוסס HILIC ו-IMAC כדי להפריד בין פוספופפטידים לבין גליקופפטידים ניטרליים, חומציים וזרחניים מנוז-6-זרחוניים 17,18. אסטרטגיה זו ידועה בשם Ti(IV)-IMAC דו-פונקציונלי. שימוש באסטרטגיות אלה להעשרת מספר PTMs בתהליך עבודה יחיד יכול להפוך ניתוחים של אינטראקציות פוטנציאליות של PTM crosstalk לנגישים יותר. בנוסף, סך כל דרישות כמות המדגם והזמן נמוך משיטות ההעשרה המקובלות כאשר הן מבוצעות במקביל (כלומר, HILIC ו- IMAC על אליקוטים מדגמיים נפרדים).

כדי להדגים את אסטרטגיית Ti(IV)-IMAC הדו-תפקודית לניתוח סימולטני של גליקוסילציה וזרחון של חלבונים, יישמנו אותה כדי לנתח רקמות לבלב אנושיות לאחר המוות. הלבלב מייצר גם אנזימי עיכול וגם הורמונים מווסתים, כולל אינסולין וגלוקגון. תפקוד הלבלב נפגע במחלת הלבלב. בסוכרת, הרגולציה של רמת הסוכר בדם מושפעת, מה שמוביל לרמות גבוהות יותר של גלוקוז בדם. בדלקת הלבלב, דלקת נובעת מעיכול אוטומטי של האיבר3. שינויים בפרופילי PTM, כולל גליקוזילציה וזרחון, עלולים לגרום, כפי שקורה לעתים קרובות, למחלות אחרות.

כאן אנו מתארים פרוטוקול לשיטת העשרה סימולטנית מבוססת ספין-טיפ, המבוססת על אסטרטגיית Ti(IV)-IMAC דו-תפקודית, עבור N-גליקופפטידים ופוספופפטידים המופקים מחלבונים המופקים מרקמת הלבלב. הפרוטוקול כולל מיצוי ועיכול של חלבונים, העשרה, איסוף נתונים של טרשת נפוצה ועיבוד נתונים, כפי שניתן לראות באיור 1. נתונים מייצגים ממחקר זה זמינים באמצעות קונסורציום ProteomeXchange עם מזהה PXD033065.

figure-introduction-5070
איור 1: זרימת עבודה לניתוח סימולטני של N-גליקופפטידים ופוספופפטידים מרקמות הלבלב האנושיות. הרקמות עוברות תחילה לאבקה דקה לפני מיצוי החלבון באמצעות חומר הניקוי נתרן דודציל סולפט (SDS). חלבונים נתונים לאחר מכן לעיכול אנזימטי. הפפטידים המתקבלים עוברים קרדיט לפני ההעשרה באמצעות Ti(IV)-IMAC דו-תפקודי. הנתונים הגולמיים נאספים באמצעות ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית ננומטרית בקנה מידה הפוך הפוך (nRPLC-MS) ומנותחים באמצעות תוכנת חיפוש מסד נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

פרוטוקול זה נועד להפוך את ניתוחי ה-PTM לנגישים יותר ולאפשר ניתוח נרחב יותר של מספר PTMs באותה זרימת עבודה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מטריצות ביולוגיות מורכבות אחרות, כולל תאים וביופילודים.

Protocol

התקבלה הסכמה לשימוש ברקמות הלבלב למחקר מקרובי משפחתו של המנוח והושג אישור מטעם מועצת הביקורת המוסדית למדעי הבריאות של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון. פיקוח IRB אינו נדרש מכיוון שהוא אינו מערב נבדקים אנושיים כפי שהוכר על ידי 45 CFR 46.102(f).

אזהרה: יש לנקוט משנה זהירות בעת טיפול בריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה, הכוללים חומצות (פורמיות, אצטיות, טריפלואורואצטיות), בסיסים (אמוניום הידרוקסיד) וקריוגנים (חנקן נוזלי). קרא את גיליונות נתוני הבטיחות של הריאגנטים המשמשים כדי להכיר את הסכנות הקשורות ואת אמצעי הזהירות הדרושים. הריכוזים המסומנים באחוזים הם נפח/נפח כולל (v/v) והם מדוללים במים.

1. קריו-פולבריזציה של רקמות, ליזיס ומיצוי חלבונים

  1. ממלאים דיואר בחנקן נוזלי. מראש לצנן את החלקים של pulverizer רקמה כי יבוא במגע עם רקמות הלבלב, כלומר, החדר, pulverizer, וכף התאוששות במיכל פוליסטירן.
  2. מעבירים את חלקי הרקמה הקפואים למחזיק הדגימה המצונן מראש ומוסיפים לרקמה כפית של חנקן נוזלי.
  3. מכניסים את הפולברייזר לתוך התא ומכים אותו באמצעות מאלט חמש עד עשר פעמים כדי לרסק את הדגימה. מוציאים את הפולבריזר מהתא ומגרדים את אבקת הרקמות והחתיכות הדבקות.
  4. מוסיפים כפית של חנקן נוזלי לתא אם הרקמות מתחילות להתמוסס. חוזרים על תהליך הפולבריזציה עד שהדגימה היא אבקה עדינה ללא גושי רקמה גדולים. מחלקים את הדגימות לכ-100 מ"ג אליקוטים לתוך צינורות מצוננים מראש.
  5. הכינו מאגר ליזיס המכיל 4% נתרן דודציל סולפט (SDS), 150 mM NaCl ו-25 mM Tris (pH = 7.4). ממיסים טבליה אחת כל אחד של מעכבי פרוטאז ופוספטאז ב-500 מיקרול' מים, לקבלת מלאי של פי 20 מכל אחד מהם. הוסיפו את הנפח הנדרש של פי 20 של כל מעכב למאגר ה-lysis לקבלת ריכוז סופי של פי 1.
  6. מוסיפים 600 μL של חיץ ליזיס לכל רקמה של 100 מ"ג לצינור ודגירה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס בבלוק חימום למשך 10 דקות עם רעידות ב-800 סל"ד. הסר את הדגימות מגוש החימום ותן להן להתקרר לטמפרטורת החדר.
  7. נקו את הדגימות באנרגיה של 60 ואט (20 קילוהרץ) במשך 45 שניות באמצעות פולסים של 15 שניות עם מנוחה של 30 שניות בין לבין. גלול את הדגימות ב 3,000 x g במשך 15 דקות ב 4 ° C.
  8. הוסיפו את הסופרנאטנט לממס משקעים של פי 5, 300 μL של מאגר ליזה ל-1.5 מ"ל של ממס משקעים, המכיל 50% אצטון, 49.9% אתנול ו-0.1% חומצה אצטית. צוננים למשך הלילה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  9. גלול את הדגימות שוב ב 3,000 x g במשך 15 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant. לשטוף את הכדור על ידי פירוק עם מרית וערבוב עם אותה כמות של ממס משקעים. כדור שוב, חוזר על שלב הכביסה 2x.
  10. גלול את הדגימה ב 16,000 x g במשך 15 דקות ב 4 ° C. יש לייבש באוויר את הכדור לדוגמה במכסה אדים למשך 15 דקות ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן להמשך.

2. עיכול והתפלה של חלבונים

  1. בצעו החייאה של גלולת החלבון ב-300 μL של מאגר עיכול טרי המכיל 50 mM טריאתילמוניום ביקרבונט (TEAB) ו-8 M אוריאה.
  2. להעריך את ריכוז החלבון של התמיסה באמצעות בדיקת חלבון על פי פרוטוקול היצרן.
  3. לחלבון שבתמיסה, מוסיפים דיתיותריאטול (DTT) לריכוז סופי של 5 mM, מערבבים ומפחיתים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסיפו יודואצטאמיד (IAA) לריכוז סופי של 15 mM, ערבבו ואלקילאט בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך. מרווים אלקילציה על ידי חזרה על תוספת של DTT באותו נפח כמו קודם ומערבבים.
  4. מוסיפים LysC/טריפסין ב-1:100 יחס אנזים:חלבון ואינקובצים ב-37°C למשך 4 שעות. לאחר מכן, הוסף 50 mM TEAB כדי לדלל את 8 M אוריאה המשמשת < 1 M. הוסף טריפסין ב 1:100 יחס אנזים: חלבון ודגירה ב 37 °C (66 °F) לילה.
  5. מרווים את העיכול עם תוספת של חומצה טריפלואורואצטית (TFA) ל 0.3% v/v. עבור כל 1 מ"ג של חלבון התחלתי, יש להתנות מחסנית התפלה (1 סמ"ק, 10 מ"ג) עם 1 מ"ל של אצטוניטריל (ACN) ופי 3 עם 1 מ"ל של 0.1% TFA.
  6. טען את התערובת המעוכלת על מחסנית ההתפלה. שטפו את התערובת פי 3 באמצעות 1 מ"ל של 0.1% TFA. אם האלוטציה איטית, הפעילו לחץ חיובי אך הימנעו מקצב זרימה > ירידה אחת לשנייה.
  7. אלוט פפטידים המשתמשים בתמיסה של 1 מ"ל של 60% ACN ו-0.1% חומצה פורמית (FA). פפטידים יבשים בטמפרטורה של כ-35 מעלות צלזיוס באמצעות רכז ואקום צנטריפוגלי עד שהממס התאדה לחלוטין.
  8. תחזירו פפטידים ב-300 מיקרול' מים והעריכו את ריכוזי הפפטידים באמצעות בדיקת פפטידים על פי פרוטוקול היצרן. מחלקים את הפפטידים ל-500 מיקרוגרם אליקוטים ומייבשים לחלוטין.

3. העשרת ERLIC N-גליקופפטיד

הערה: מהירויות וזמני צנטריפוגה מדויקים עשויים להשתנות בהתבסס על דגימות ויש לייעל אותם. באופן כללי, 300 x g במשך 2 דקות מתאים להריה ושטיפה של החומר ו 100 x g במשך 5 דקות עבור eluting.

  1. שוקלים כ-3 מ"ג צמר גפן ואורזים אותו לתוך קצה פיפטה ריק של 200 μL (קצה ספין; ראו טבלת חומרים).
  2. מעבירים חומר העשרה חזק להחלפת אניונים לתוך צינור ומוסיפים 200 μL של 0.1% TFA לכל 10 מ"ג חומר. להעשרת 500 מיקרוגרם של פפטידים, יש להשתמש ב-15 מ"ג מהחומר. הפעל את החומר על ידי רעידות במשך 15 דקות.
  3. באמצעות מתאם צינור, מניחים את קצה הספין מעל צינור 2 מ"ל ומוסיפים מספיק סלרי לקצה עבור 15 מ"ג של חומר. הסר את הנוזל על ידי סיבוב בצנטריפוגה על הספסל.
  4. התנה את החומר על ידי צנטריפוגה של 3x עם 200 μL של ACN. חזור על ההתניה המשולשת באמצעות 100 mM אמוניום אצטט (NH4Ac), 1% TFA ו- 80% ACN / 0.1% TFA (מאגר טעינה).
  5. דגימות פפטיד של 500 מיקרוגרם כ-500 מיקרוגרם בכ-200 מיקרוגרם לשנייה של מאגר טעינה וזרמו דרך קצה הספין. טען מחדש את הזרימה דרך 2x כדי להבטיח כריכה מלאה.
  6. שטפו את החומר על ידי צנטריפוגה פי 5 באמצעות 200 μL של 80% ACN/0.1% TFA, ולאחר מכן 2x באמצעות 200 μL של 80% ACN/0.1% FA.
  7. הקפידו על הפפטידים על ידי צנטריפוגה עם 200 μL מכל אחד מהבאים: 50% ACN/0.1% FA (E1); 0.1% FA (E2); 0.1% TFA (E3); 300 mM KH2PO4, 10% ACN (E4).
  8. שטפו את החומר על ידי צנטריפוגה פי 2 עם 200 מיקרול של 80% ACN/5% NH4OH. אל תשכחו את שאר הפפטידים עם 200 μL של 10% NH4OH (E5).
  9. יבשו את כל האלוטציות לחלוטין באמצעות רכז ואקום צנטריפוגלי בטמפרטורה של כ-35 מעלות צלזיוס.
  10. לבצע התפלה של elution הבסיסי (E5) באמצעות קצה התפלה על פי פרוטוקול היצרן.
  11. מייבשים את האלוטציה מקצה ההתפלה באמצעות רכז ואקום צנטריפוגלי בטמפרטורה של כ-35 מעלות צלזיוס עד לשלמות.

4. העשרת פוספופפטידים Ti(IV)-IMAC

הערה: מהירויות וזמני צנטריפוגה מדויקים עשויים להשתנות בהתבסס על דגימות ויש לייעל אותם. באופן כללי, 300 x g במשך 2 דקות מתאים להריה ושטיפה של החומר ו 100 x g במשך 5 דקות עבור eluting.

  1. שוקלים כ-3 מ"ג צמר גפן ואורזים אותו לתוך קצה פיפטה ריק של 200 μL (קצה ספין).
  2. העבר את חומר העשרת הפוספופפטידים של Ti-IMAC לתוך צינור והוסף 200 μL של 0.1% TFA לכל 10 מ"ג חומר. להעשרה של 500 מיקרוגרם פפטידים, יש להשתמש ב-10 מ"ג של חומר.
  3. באמצעות מתאם צינור, מניחים את קצה הספין מעל צינור 2 מ"ל ומוסיפים מספיק לולים לקצה עבור חומר של 10 מ"ג. הסר את הנוזל על ידי סיבוב בצנטריפוגה על הספסל.
  4. התנחו את החומר ב-200 μL של 40% ACN/3% TFA באמצעות אותן הגדרות צנטריפוגה כמתואר לעיל. דגימות פפטידים של Resuspend ב-200 μL של 40% ACN/3% TFA וזורמים דרך קצה הספין. טען מחדש את הזרימה פעמיים כדי להבטיח כריכה מלאה יותר.
  5. שטפו את החומר על ידי צנטריפוגה עם 200 μL של 50% ACN, 6% TFA ו-200 mM תמיסת NaCl, ולאחר מכן שטיפה של 2x ב-200 μL של 30% ACN ו-0.1% פתרון TFA.
  6. פפטידים Elute עם 200 μL של 10% NH4OH. מייבשים את האלוטציה לחלוטין תחת ואקום. בצעו התפלה באמצעות קצה התפלה על פי פרוטוקול היצרן. מייבשים את התרוממות מהקצה המתפלה תחת ואקום לשלמות.

5. העשרה בו-זמנית של Ti(IV) בעלת תפקוד כפול

הערה: מהירויות וזמני צנטריפוגה מדויקים עשויים להשתנות בהתבסס על דגימות ויש לייעל אותם. באופן כללי, 300 x g במשך 2 דקות מתאים להריה ושטיפה של החומר ו 100 x g במשך 5 דקות עבור eluting.

  1. שוקלים כ-3 מ"ג צמר גפן ואורזים אותו לתוך קצה ספין ריק.
  2. העברת כ-1 גרם של חומר Ti(IV)-IMAC לתוך צינור. הוסיפו 0.1% TFA לריכוז ידוע של חומר, למשל, 20 מ"ג/200 μL (ניתן לאחסן חומר בתרחיף זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס).
  3. להעשרה מ-500 מיקרוגרם פפטידים, הוסיפו מספיק סלרי לספין-טיפ כדי להעביר 20 מ"ג של חומר. שטפו את קצה הספין על ידי צנטריפוגה עם 200 μL של 0.1% TFA.
  4. בצעו החייאה של הדגימות ב-200 μL של ממס העמסה/שטיפה (80% ACN ו-3% TFA) וזרמו דרך קצה הספין. טען מחדש את הזרימה-דרך 2x.
  5. שטפו את קצה הספין 6x על ידי צנטריפוגה עם 200 μL של ממס העמסה/כביסה. שטפו את קצה הסיבוב עם 200 μL של 80% ACN/0.1% פתרון FA.
  6. הקפידו על הפפטידים עם 200 μL מכל אחד מהבאים: 60% ACN/0.1% FA (E1) ו-40% ACN/0.1% FA (E2). לנתח כל elution בנפרד.
  7. אל תשכחו את הפפטידים עם 200 μL של כל אחד מהבאים: 20% ACN/0.1% FA ו-0.1% FA. שלבו את שני האלוטיונים ונתחו כדגימה אחת (E3).
  8. הקפידו על הפפטידים עם 200 μL מכל אחד מהבאים: 40% ACN/3% TFA; 50% ACN/6% TFA, 200 mM NaCl; ו-30% ACN/0.1% TFA. שלבו את האלוטיונים הללו ונתחו כאחת (E4) לאחר ההתפלה באמצעות קצה ארוז.
  9. תנו את החומר ל-pH בסיסי באמצעות 200 μL של 90% ACN/2.5% NH4OH עבור 3x. השליכו את הכביסה הזו.
  10. הקפידו על הפפטידים עם 200 μL מכל אחד מהבאים: 60% ACN/10% NH4OH (E5) ו-40% ACN/10% NH4OH (E6). נתחו את ההברקות הללו בנפרד לאחר ההתפלה באמצעות קצה ארוז.
  11. אל תשכחו את הפפטידים עם 200 μL של כל אחד מהבאים: 20% ACN/10% NH4OH; 10% ACN/10% NH4OH; ו-10% NH4OH. שלבו את האלוטיונים הללו ונתחו כאחת (E7) לאחר ההתפלה באמצעות קצה ארוז.
  12. יבשו את כל האלוטות לחלוטין תחת ואקום.

6. ננו-זרימה הפוכה כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריה של מסה (nRPLC-MS)

הערה: שיטות איסוף וניתוח נתוני MS הן מגוונות, ולכן רק צינור LC-MS מוצע אחד (והפרמטרים המשויכים אליו) מתואר כאן בשלבים הבאים. ניתן לנתח דגימות שנוצרו באמצעות שלבי ההכנה וההעשרה של דגימות שתוארו קודם לכן באמצעות מערכים אינסטרומנטליים אחרים, כולל שימוש בעמודות כרומטוגרפיות זמינות מסחרית, בהינתן איכות נתונים מספקת.

  1. משוך וארוז נימי באורך 15 ס"מ (קוטר פנימי של 75 מיקרומטר) תוך שימוש בחומר C18 כמתוארב-19. הכן שלב A נייד (0.1% FA במים) ושלב B נייד (0.1% FA ב- ACN).
  2. שחזרו דגימות פפטיד מועשרות ב-15 μL של 3% פאזה ניידת B. העמיסו 2 μL מהדגימה (כ-13% נפח דגימה) ישירות על העמודה. נתח כל מדגם בשכפול טכני.
  3. אלוט פפטידים המשתמשים בשיפוע מ-3% ל-30% פאזה ניידת B במשך 90 דקות בקצב זרימה של 0.3 μL/min. לשטוף את העמודה באמצעות 75% B במשך 8 דקות ואחריו 95% B במשך 8 דקות, וסיים את השיטה עם שיווי משקל של 3% B למשך 12 דקות.
  4. הפעל את ספקטרומטר המסה במצב היונים החיוביים באמצעות רכישה תלוית נתונים של 20 הפסגות המובילות עם הפרמטרים הבאים: מתח ריסוס 2 kV; זיהוי MS1 ב- LC/MS מ- 400-2,000 m/z ברזולוציה של 120,000, יעד בקרת רווח אוטומטי (AGC) 2E5, זמן הזרקה מרבי של 100 אלפיות השנייה, עדשת RF של 30%, בידוד מרובע עם חלון 1.6 m/z , עבור מצבי טעינה 2-8 ולא נקבעו, ואי הכללה דינמית של 30 שניות; זיהוי MS2 ב-LC/MS באמצעות פיצול HCD מדורג ב-22%, 30% ו-38%, מסה ראשונה קבועה של 120 m/z ברזולוציה של 30,000, יעד 5E4 AGC ודרישת עוצמה מינימלית של 2.5E4.

7. ניתוח נתוני MS

הערה: צינור ניתוח נתונים אחד באמצעות שתי תוכנות שונות לניתוח אותו מערך נתונים מוצג כאן. ניתן לחפש פוספורילציה וגליקוזילציה בו-זמנית באמצעות תוכנה אחת במקום שתי תוכנות נפרדות כמתואר כאן, אם כי באופן כללי, זמן חיפוש התוכנה הוא פרופורציונלי למרחב החיפוש, כלומר מספר ה-PTMs הנחשבים. מסיבה זו, שתי תוכנות שונות משמשות במקביל לחיפוש אחר גליקופפטידים ופוספופפטידים.

  1. עיבד קבצי נתונים גולמיים באמצעות התוכנה המתאימה (ראה טבלת חומרים).
    1. חפש ספקטרום מול מסד הנתונים האנושי של UniProt (או ספציפי למין מתאים). הגדר קרבמידומתילציה של Cys כשינוי קבוע. הגדר את המספר המרבי של מחשוף אנזימטי שהוחמצו כשני.
  2. בקבצי הנתונים הגולמיים, באמצעות תוכנה מסחרית (ראו טבלת חומרים), חפשו גליקופפטידים לניתוח20. השתמש בסבילות מסה מקדימה של 10 ppm ובסובלנות מסה של 0.01 Da fragment עם אורך פפטיד מינימלי של ארבעה שאריות.
    1. החיפוש באמצעות מסד הנתונים N-glycan המוטמע בתוכנה הורחב עם גליקנים טיפוסיים של מנוז-6-פוספט(M6P), כולל HexNAc(2)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(3-4)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(2)Hex(3-4)Phospho(1) ו-HexNAc(3)Hex(3-4)Phospho(1).
    2. הגדר N-גליקוסילציה כשינוי נפוץ. הגדר את השינויים הכוללים המרביים לכל התאמה ספקטרלית של פפטיד (PSM) כאחד נפוץ ושניים נדירים.
    3. הגדר את השינויים המשתנים הבאים: חמצון של Met (נדיר), deamidation ב- Asn ו- Gln (נדיר), וזרחון ב- Ser, Thr ו- Tyr (נפוץ). הגדר את מסנני הזיהוי הבאים: ניקוד מנותק > 150, |בדיקת יומן| > 1, וציון דלתא מוד > 10.
    4. ייצא ונתח תוצאות חיפוש בכרטיסיות קבוצת חלבונים ופפטידים.
    5. סנן באופן ידני את המזהים המכילים גליקנים M6P לנוכחות של יון PhosphoHex oxonium (243 m/z) בספקטרום MS/MS והסר זיהויים חיוביים כוזבים, שאינם מכילים יון אבחון זה.
  3. בקבצי הנתונים הגולמיים, באמצעות תוכנת קוד פתוח (ראו טבלת חומרים), חפשו פוספופפטידים לניתוח21. השתמש בסובלנות פפטיד חיפוש ראשונה של 20 ppm ובסובלנות פפטיד חיפוש ראשית של 4.5 ppm.
    1. הגדר את מספר השינויים המרבי לכל פפטיד ל- 5. הגדר PSM ושיעור גילוי שווא של חלבונים (FDR) ל-1% ואורך פפטיד מינימלי ל-7 שאריות.
    2. הגדר שינויים משתנים כחמצון ב- Met, אצטילציה של חלבון N-terminal וזרחון ב- Ser, Thr ו- Tyr. ניתוח תוצאות חיפוש באמצעות קבצי השינויSpecificPeptides.
  4. קבעו את מספר הזיהויים של PTMs ברמות החלבון, הפפטיד והשינוי באתר.

תוצאות

נתוני ספקטרומטריית מסה מייצגת, כולל קבצים גולמיים ותוצאות חיפוש, הופקדו בקונסורציום ProteomeXchange באמצעות מאגר השותפים PRIDE עם מזהה ערכת הנתונים PXD03306522.

בעבודה זו נותחו שכפולים של הזרקה כפולה עבור כל העשרה. זיהויים שנעשו משני השכפולים הטכניים נאספו בניתוח הסופי...

Discussion

אסטרטגיית Ti(IV)-IMAC הדו-תפקודית שימושית לניתוח סימולטני של N-גליקופפטידים ופוספופפטידים מאותה דגימה בתהליך עבודה של הכנת דגימה אחת. כמו כן, הודגם כי שיטות מבוססות ERLIC מבצעות העשרה בו-זמנית של PTMs. שתי האסטרטגיות שימשו בעבר לכיסוי עמוק בניתוחי PTM14,18. בהתאמת שיטת Ti...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מימון מענקים מה-NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 ו-R21AG065728), והקרן לחקר סוכרת נעורים (1-PNF-2016-250-S-B ו-SRA-2016-168-S-B). הנתונים שהוצגו כאן הושגו בחלקם גם באמצעות תמיכה מפרס NIH/NCATS UL1TR002373 באמצעות המכון למחקר קליני ותרגומי של אוניברסיטת ויסקונסין. מכשירי Orbitrap נרכשו בתמיכת מענק מכשירים משותף של NIH (NIH-NCRR S10RR029531) ומשרד סגן הקנצלר למחקר וחינוך לתארים מתקדמים באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון. אנו רוצים גם להודות על התמיכה הנדיבה של הארגון לתרומת איברים ורקמות של אוניברסיטת ויסקונסין שסיפק לבלב אנושי למחקר ולעזרתם של דן טרמל, ד"ר שרה ד. סקט ופרופ' ג'ון אודוריקו על אספקת הדגימות למעבדה שלנו. צוות המחקר שלנו רוצה להודות תודה מיוחדת למשפחות שתרמו רקמות למחקר זה. L.L. מכיר במענק NIH S10OD025084, במענק פיילוט לסרטן הלבלב ממרכז הסרטן הקרבוני של אוניברסיטת ויסקונסין (233-AAI9632), כמו גם בפרופסור להישגים מכובדים של וילאס ובפרופסור הקתדרה המצטיין על שם צ'ארלס מלבורן ג'ונסון במימון הקרן לחקר בוגרי ויסקונסין ובית הספר לרוקחות של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic Acid, Glacial (Certified ACS)Fisher ScientificA38S-500
Acetone (Certified ACS)Fisher ScientificA18-1
Acetonitrile, Optima LC/MS GradeFisher ScientificA955-4
Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificA637-500
Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus)Fisher ScientificA669-212
Byonic softwareProtein Metricsn/aCommercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/)
C18 BEH materialWaters186002353Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet)
CAE-Ti-IMAC, 100%J&K Scientific2749380-1GMaterial used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment
Cellcrusher kitCellcrushern/aUsed for grinding tissue samples into powder before extraction
Eppendorf 5424R MicrocentrifugeFisher Scientific05-401-205For temperature-controlled centrifugation
cOmplete protease inhibitor cocktail tabletsSigma11697498001
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)PromegaV3151Protein reducing agent
Ethanol, 200 proof (100%), USPFisher22-032-601
Fisherbrand Analog Vortex MixerFisher Scientific02-215-414
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)Fisher Scientific02-681-320
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL)Fisher Scientific02-681-321
Fisherbrand Model 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB120110For sample lysis using ultrasonication
Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS GradeFisher ScientificA117-50
Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter)Polymicro Technologies LLC100 m TSP075375For in-house pulled and packed columns with integrated emitter
Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O)Sigma-Aldrich339261-100MLUsed for opening emitter of pulled capillary column
Iodoacetamide, BioUltraSigmaI1149-5GProtein reducing reagent
MaxQuant softwaren/an/aFree software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/)
Multi-therm Shaker with heating and coolingBenchmark ScientificH5000-HCHeating block
Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pkWaters186000383Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each)
OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tipsAgilentA57003100Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions
P-2000 Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-2000/FFor pulling nano-capillary columns for LC-MS
PhosSTOP phosphatase inhibitor tabletsSigma4906845001
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide AssayThermo Fisher Scientific23275
PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å)PolyLCBMSX1203Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment
Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificP285-500
Pressure injection cell with integrated magnetic stirplateNext AdvancePC77-MAGFor packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit
Proteome Discoverer softwareThermo Fisher Scientificn/aCommercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)
SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120Savantn/aCentrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat)
SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/ElectrophoresisFisher ScientificBP2436200
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificS271-500
TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96Glygen CorporationTT2EMT.96Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile))Sigma90360-100ML
Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99%Fisher Scientific60-017-61
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)Fisher ScientificBP152-500
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec GradePromegaV5071
Urea (Certified ACS)Fisher ScientificU15-500
Water, Optima LC/MS GradeFisher ScientificW64

References

  1. Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
  2. Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).
  3. Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases. Frontiers in Chemistry. 9, 707387 (2021).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
  5. Alpert, A. J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).
  6. Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029 (2020).
  7. Low, T. Y., et al. Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment. Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).
  8. Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides. ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).
  9. Zhou, Y., et al. An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues. Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).
  10. Tang, R., et al. Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).
  11. Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).
  12. Glover, M. S., et al. Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).
  13. Alpert, A. J. Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides. Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).
  14. Cui, Y., et al. Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).
  15. Cui, Y., et al. Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).
  16. Tabang, D. N., et al. Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry. Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).
  17. Huang, J., et al. Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates. Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).
  18. Huang, J., et al. Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides. Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).
  19. Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380 (2021).
  20. Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , (2012).
  21. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  22. Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
  23. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523 (2019).
  24. Zacharias, L. G., et al. HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).
  25. Yang, W., et al. Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography. Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).
  26. Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides. Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).
  27. Liu, M. -. Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
  28. Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
  29. Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010 (2021).
  30. Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The language of histone crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
  31. Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129 (2021).
  32. Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183PTMsTi IVIMACERLICMS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved