JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Посттрансляционные модификации (PTM) изменяют структуры и функции белка. Методы одновременного обогащения нескольких типов PTM могут максимизировать охват в анализах. Представлен протокол с использованием двухфункциональной Ti(IV)-иммобилизованной хроматографии сродства металлов с последующей масс-спектрометрией для одновременного обогащения и анализа белка N-гликозилирования и фосфорилирования в тканях поджелудочной железы.

Аннотация

Масс-спектрометрия может обеспечить глубокий охват посттрансляционных модификаций (ПТМ), хотя обогащение этих модификаций сложными биологическими матрицами часто необходимо из-за их низкой стехиометрии по сравнению с немодифицированными аналитами. Большинство рабочих процессов обогащения PTM на пептидах в рабочих процессах протеомики снизу вверх, где белки ферментативно перевариваются до анализа полученных пептидов, обогащают только один тип модификации. Однако именно весь набор ПТМ приводит к биологическим функциям, и обогащение одного типа ПТМ может пропустить такие перекрестные помехи ПТМ. Перекрестные помехи PTM наблюдались между гликозилированием белка и фосфорилированием, двумя наиболее распространенными ПТМ в белках человека, а также двумя наиболее изученными ПТМ с использованием рабочих процессов масс-спектрометрии. Используя стратегию одновременного обогащения, описанную в настоящем описании, оба ПТМ обогащаются из посмертной ткани поджелудочной железы человека, сложной биологической матрицы. Двухфункциональная Ti(IV)-иммобилизованная хроматография сродства металлов используется для разделения различных форм гликозилирования и фосфорилирования одновременно в нескольких фракциях в удобном методе на основе спин-наконечника, что позволяет проводить последующий анализ потенциальных перекрестных взаимодействий PTM. Этот рабочий процесс обогащения для глико- и фосфопептидов может быть применен к различным типам образцов для достижения глубокого профилирования нескольких ПТМ и выявления потенциальных молекул-мишеней для будущих исследований.

Введение

Посттрансляционные модификации белка (PTM) играют важную роль в модуляции белковых структур и, следовательно, их функций и последующих биологических процессов. Разнообразие человеческого протеома увеличивается экспоненциально из-за комбинаторной изменчивости, обеспечиваемой различными ПТМ. Различные варианты белков из их канонических последовательностей, предсказанных геномом, известны как протеоформы, и многие протеоформы возникают из ПТМ1. Изучение протеоформного разнообразия в здоровье и болезнях стало областью исследований, представляющих большой интерес в последние годы 2,3.

Изучение протеоформ и, более конкретно, ПТМ с большой глубиной стало более поверхностным благодаря развитию методов протеомики на основе масс-спектрометрии (МС). Используя MS, аналиты ионизируются, фрагментируются и идентифицируются на основе m/z фрагментов. Методы обогащения часто необходимы из-за низкого относительного содержания ПТМ по сравнению с немодифицированными формами белков. Хотя анализ интактных белков и их ПТМ, называемый нисходящим анализом, стал более рутинным, ферментативное переваривание белков и анализ их компонентных пептидов в анализах снизу вверх по-прежнему является наиболее широко используемым путем для анализа ПТМ. Двумя наиболее широко изученными ПТМ и двумя наиболее распространенными ПТМ in vivo являются гликозилирование и фосфорилирование4. Эти два PTM играют важную роль в передаче и распознавании клеток и, таким образом, являются важными модификациями для характеристики в исследованиях заболеваний.

Химические свойства различных ПТМ часто обеспечивают пути к обогащению этих ПТМ на уровнях белка и пептида до анализа. Гликозилирование является гидрофильным ПТМ из-за обилия гидроксильных групп на каждом моносахариде. Это свойство может быть использовано для обогащения гликопептидов в гидрофильной хроматографии взаимодействия (HILIC), которая может отделять больше гидрофильных гликопептидов от гидрофобных немодифицированных пептидов5. Фосфорилирование добавляет фосфатный фрагмент, который отрицательно заряжен, за исключением кислотного рН. Благодаря этому заряду различные катионы металлов, включая титан, могут быть использованы для привлечения и связывания фосфопептидов, в то время как нефосфорилированные виды смываются. Таков принцип иммобилизованной аффинной хроматографии металлов (IMAC). Дальнейшие обсуждения этих и других стратегий обогащения для гликозилирования и фосфорилирования можно найти в недавних обзорах 6,7.

Сравнительно большие количества исходного пептидного материала (0,5 мг и более) часто необходимы для протоколов обогащения из-за низкой стехиометрии ПТМ на пептидах. В сценариях, где такое количество образца может быть нелегко получить, таких как биопсия ядра опухоли или анализ спинномозговой жидкости, полезно использовать легкие рабочие процессы, которые приводят к максимальной биомолекулярной информации. Недавние стратегии, разработанные нашей лабораторией и другими, выявили одновременный и параллельный анализ гликозилирования и фосфорилирования с использованием одного и того же рабочего процесса обогащения PTM 8,9,10,11,12. Хотя химические свойства этих двух ПТМ могут отличаться, эти ПТМ могут быть проанализированы в несколько этапов из-за инновационных методов разделения и используемых материалов. Например, электростатическая хроматография отталкивающе-гидрофильного взаимодействия (ERLIC) накладывает разделения на основе гидрофильных взаимодействий между аналитами и подвижной фазой с взаимодействием заряд-заряд между аналитами и материалом стационарной фазы 13,14,15,16. При кислом рН притяжение фосфорилированных пептидов к стационарной фазе может улучшить их удержание и отделение от немодифицированных пептидов. Материал, состоящий из Ti(IV), иммобилизованных на гидрофильных микросферах, может быть использован для элюирования на основе HILIC и IMAC для разделения фосфопептидов и нейтральных, кислых и манноз-6-фосфорилированных гликопептидов17,18. Эта стратегия известна как двухфункциональная Ti(IV)-IMAC. Использование этих стратегий для обогащения нескольких PTM в одном рабочем процессе может сделать анализ потенциальных взаимодействий перекрестных помех PTM более доступным. Кроме того, требования к общему количеству и времени отбора проб меньше, чем у обычных методов обогащения при параллельном выполнении (т.е. HILIC и IMAC на отдельных аликвотах образцов).

Чтобы продемонстрировать двухфункциональную стратегию Ti(IV)-IMAC для одновременного анализа гликозилирования и фосфорилирования белка, мы применили ее для анализа посмертных тканей поджелудочной железы человека. Поджелудочная железа вырабатывает как пищеварительные ферменты, так и регуляторные гормоны, включая инсулин и глюкагон. Функция поджелудочной железы нарушается при заболеваниях поджелудочной железы. При диабете нарушается регуляция уровня сахара в крови, что приводит к повышению уровня глюкозы в крови. При панкреатите воспаление возникает в результате аутопереваривания органа3. Изменения в профилях ПТМ, включая гликозилирование и фосфорилирование, могут привести, как это часто бывает, к другим заболеваниям.

Здесь мы описываем протокол для метода одновременного обогащения на основе спин-наконечника, основанного на двухфункциональной стратегии Ti(IV)-IMAC, для N-гликопептидов и фосфопептидов, полученных из белков, извлеченных из ткани поджелудочной железы. Протокол включает экстракцию и переваривание белка, обогащение, сбор данных MS и обработку данных, как показано на рисунке 1. Репрезентативные данные этого исследования доступны через консорциум ProteomeXchange с идентификатором PXD033065.

figure-introduction-6443
Рисунок 1: Рабочий процесс для одновременного анализа N-гликопептидов и фосфопептидов из тканей поджелудочной железы человека. Ткани сначала крио-измельчены в мелкий порошок перед экстракцией белка с использованием моющего средства додецилсульфата натрия (SDS). Затем белки подвергаются ферментативному перевариванию. Полученные пептиды аликвотируются перед обогащением с использованием двухфункционального Ti(IV)-IMAC. Необработанные данные собираются с помощью наноразмерной обратнофазной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (nRPLC-MS) и анализируются с использованием программного обеспечения для поиска в базе данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Этот протокол предназначен для того, чтобы сделать анализ PTM более доступным и обеспечить более широкий анализ нескольких PTM в одном рабочем процессе. Этот протокол может быть применен к другим сложным биологическим матрицам, включая клетки и биожидкости.

протокол

Было получено согласие на использование тканей поджелудочной железы для исследований от ближайших родственников умершего, и было получено разрешение Институционального наблюдательного совета по медицинским наукам Университета Висконсина-Мэдисона. Надзор IRB не требуется, поскольку он не затрагивает людей, как это признано в 45 CFR 46.102(f).

ВНИМАНИЕ: Следует соблюдать осторожность при обращении с реагентами, используемыми в этом протоколе, которые включают кислоты (муравьиную, уксусную, трифторуксусную), основания (гидроксид аммония) и криогены (жидкий азот). Ознакомьтесь с паспортами безопасности для реагентов, используемых для ознакомления с сопутствующими опасностями и необходимыми мерами предосторожности. Концентрации, обозначаемые с использованием процентных показателей, представляют собой объем/общий объем (v/v) и разбавляются водой.

1. Криопыление тканей, лизис и экстракция белка

  1. Наполните дьюар жидким азотом. Предварительно охладите части тканевого измельчителя, которые будут контактировать с тканями поджелудочной железы, а именно камеру, измельчитель и восстановительную ложку в контейнере из полистирола.
  2. Переложите замороженные кусочки ткани в предварительно охлажденный держатель для образцов и добавьте ложку жидкого азота в ткань.
  3. Поместите измельчитель в камеру и ударьте по нему молотком пять-десять раз, чтобы раздавить образец. Извлеките измельчитель из камеры и соскоблите адгезивный тканевый порошок и кусочки.
  4. Добавьте ложку жидкого азота в камеру, если ткани начнут плавиться. Повторяйте процесс измельчения до тех пор, пока образец не станет мелким порошком без больших кусков ткани. Разложите образцы примерно на 100 мг аликвот в предварительно охлажденные пробирки.
  5. Готовят лизисный буфер, содержащий 4% додецилсульфата натрия (SDS), 150 мМ NaCl и 25 мМ Tris (pH = 7,4). Растворите по одной таблетке протеазы и ингибитора фосфатазы в 500 мкл воды для 20-кратного запаса каждого. Добавьте необходимый объем в 20 раз каждого ингибитора в буфер лизиса для окончательной 1-кратной концентрации.
  6. Добавьте в пробирку 600 мкл лизизного буфера на 100 мг ткани и инкубируйте при 95 °C в нагревательном блоке в течение 10 мин с встряхиванием при 800 об/мин. Извлеките образцы из нагревательного блока и дайте им остыть до комнатной температуры.
  7. Обработка образцов ультразвуком при энергии 60 Вт (20 кГц) в течение 45 с с использованием импульсов 15 с с остатком 30 с между ними. Гранулируют образцы при 3 000 х г в течение 15 мин при 4 °C.
  8. Добавьте супернатант к 5-кратному растворителю осаждения, 300 мкл лизисного буфера к 1,5 мл растворителя осаждения, содержащего 50% ацетона, 49,9% этанола и 0,1% уксусной кислоты. Охладите ночью при -20 °C.
  9. Снова гранулируйте образцы при 3000 х г в течение 15 мин при 4 °C и удалите надосадочное вещество. Вымойте гранулу, разбив шпателем и смешав с таким же количеством растворителя для осаждения. Гранула снова, повторяя этап промывки 2x.
  10. Гранулируйте образец при 16 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Гранулы образца высушены на воздухе в вытяжном шкафу в течение 15 мин и хранят при -80 °C до готовности к продолжению.

2. Переваривание и обессоливание белка

  1. Повторное суспендирование белковой гранулы в 300 мкл свежесваренного буфера пищеварения, содержащего 50 мМ триэтиламмония бикарбоната (TEAB) и 8 М мочевины.
  2. Оцените концентрацию белка в растворе с помощью белкового анализа в соответствии с протоколом производителя.
  3. К белку в растворе добавляют дитиотрейтол (ДТТ) до конечной концентрации 5 мМ, перемешивают и уменьшают при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем добавляют йодоацетамид (IAA) до конечной концентрации 15 мМ, смешивают и алкилат при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. Гасят алкилирование путем повторения добавления ДТТ в том же объеме, что и раньше, и перемешивают.
  4. Добавьте LysC/трипсин в соотношении 1:100 фермент:белок и инкубируйте при 37 °C в течение 4 ч. Затем добавьте 50 мМ TEAB, чтобы разбавить 8 М мочевины, используемой для < 1 М. Добавьте трипсин в соотношении фермент:белок 1:100 и инкубируйте при 37 °C в течение ночи.
  5. Гашение пищеварения с добавлением трифторуксусной кислоты (ТФА) до 0,3% v/v. На каждый 1 мг исходного белка обусловливают обессоливающий картридж (1 куб. см, 10 мг) с 1 мл ацетонитрила (ACN) и 3 раза с 1 мл 0,1% TFA.
  6. Загрузите переваренную смесь в обессоливающий картридж. Промыть смесь 3 раза, используя 1 мл 0,1% TFA. Если элюирование медленное, применяйте положительное давление, но избегайте скорости потока > одной капли в секунду.
  7. Пептиды элюта с использованием 1 мл 60% ACN и 0,1% раствора муравьиной кислоты (FA). Сушите элюированные пептиды при температуре приблизительно 35 °C с помощью центробежного вакуумного концентратора до полного испарения растворителя.
  8. Повторное суспендирование пептидов в 300 мкл воды и оценка концентраций пептидов с использованием пептидного анализа в соответствии с протоколом производителя. Разделить пептиды на 500 мкг аликвот и полностью высушить.

3. Обогащение ERLIC N-гликопептидами

ПРИМЕЧАНИЕ: Точные скорости и время работы центрифуги могут отличаться в зависимости от образцов и должны быть оптимизированы. В общем, 300 х г в течение 2 мин подходит для кондиционирования и промывки материала и 100 х г в течение 5 мин для элюирования.

  1. Взвесьте приблизительно 3 мг ваты и упакуйте ее в пустой наконечник пипетки объемом 200 мкл (спин-кончик; см. Таблицу материалов).
  2. Переложите сильный анионообменный обогатительный материал в пробирку и добавьте 200 мкл 0,1% TFA на 10 мг материала. Для обогащения 500 мкг пептидов используют 15 мг материала. Активируйте материал, встряхивая в течение 15 мин.
  3. Используя адаптер для трубки, поместите отжимной наконечник на трубку объемом 2 мл и добавьте в наконечник достаточное количество суспензии для 15 мг материала. Удалите жидкость, вращаясь в настольной центрифуге.
  4. Кондиционируйте материал центрифугированием 3x с 200 мкл ACN. Повторите трехкратное кондиционирование с использованием 100 мМ ацетата аммония (NH4Ac), 1% TFA и 80% ACN/0,1% TFA (нагрузочный буфер).
  5. Повторное суспендирование 500 мкг пептидных образцов примерно в 200 мкл нагрузочного буфера и протекание через спин-наконечник. Перезагрузите проточный 2x, чтобы обеспечить полное связывание.
  6. Промывайте материал центрифугированием 5 раз с использованием 200 мкл 80% ACN/0,1% TFA, а затем 2x с использованием 200 мкл 80% ACN/0,1% FA.
  7. Элюируют пептиды центрифугированием 200 мкл каждого из следующих веществ: 50% ACN/0,1% FA (E1); 0,1% FA (E2); 0,1% TFA (E3); 300 мМ KH2PO4, 10% ACN (E4).
  8. Промывайте материал центрифугированием 2x с 200 мкл 80% ACN/5% NH4OH. Элюируют оставшиеся пептиды 200 мкл 10% NH4OH (E5).
  9. Полностью высушите все элюи с помощью центробежного вакуумного концентратора при температуре около 35 °C.
  10. Выполните обессоливание основного элюирования (Е5) с помощью обессоливающего наконечника в соответствии с протоколом производителя.
  11. Высушите элюирование от обессоливающего наконечника с помощью центробежного вакуумного концентратора при температуре приблизительно 35 °C до полноты.

4. Обогащение фосфопептидами Ti(IV)-IMAC

ПРИМЕЧАНИЕ: Точные скорости и время работы центрифуги могут отличаться в зависимости от образцов и должны быть оптимизированы. В общем, 300 х г в течение 2 мин подходит для кондиционирования и промывки материала и 100 х г в течение 5 мин для элюирования.

  1. Взвесьте приблизительно 3 мг ваты и упакуйте ее в пустой наконечник пипетки объемом 200 мкл (спин-кончик).
  2. Переложите материал для обогащения фосфопептидов Ti-IMAC в пробирку и добавьте 200 мкл 0,1% TFA на 10 мг материала. Для обогащения 500 мкг пептидов используют 10 мг материала.
  3. Используя адаптер трубки, поместите спин-наконечник на трубку объемом 2 мл и добавьте в наконечник достаточное количество суспензии для материала 10 мг. Удалите жидкость, вращаясь в настольной центрифуге.
  4. Обустройте материал 200 мкл 40% ACN/3% TFA, используя те же настройки центрифуги, что и описанные выше. Повторное суспендирование пептидных образцов в 200 мкл 40% ACN/3% TFA и протекает через спин-наконечник. Перезарядите сквозной поток дважды, чтобы обеспечить более полное связывание.
  5. Промыть материал центрифугированием 200 мкл 50% ACN, 6% TFA и 200 мМ Раствор NaCl с последующей промывкой 2x в 200 мкл 30% ACN и 0,1% раствора TFA.
  6. Пептиды элюта с 200 мкл 10% NH4OH. Полностью высушите элюирование под вакуумом. Выполните обессоливание с помощью обессоливающего наконечника в соответствии с протоколом производителя. Высушите элюирование от обессоливающего наконечника под вакуумом до полноты.

5. Двухфункциональное одновременное обогащение Ti(IV)

ПРИМЕЧАНИЕ: Точные скорости и время работы центрифуги могут отличаться в зависимости от образцов и должны быть оптимизированы. В общем, 300 х г в течение 2 мин подходит для кондиционирования и промывки материала и 100 х г в течение 5 мин для элюирования.

  1. Взвесьте примерно 3 мг ваты и упакуйте ее в пустой отжимной наконечник.
  2. Переложите примерно 1 г материала Ti(IV)-IMAC в пробирку. Добавьте 0,1% TFA к известной концентрации материала, например, 20 мг/200 мкл (материал можно хранить в этой суспензии при 4°C).
  3. Для обогащения из пептидов 500 мкг добавьте достаточное количество суспензии в спин-наконечник для переноса 20 мг материала. Вымойте отжимной наконечник центрифугированием с 200 мкл 0,1% TFA.
  4. Повторно суспендируйте образцы в 200 мкл загрузочного/промывочного растворителя (80% ACN и 3% TFA) и протейте через отжимной наконечник. Перезагрузите проточной в 2 раза.
  5. Промывайте отжимной наконечник 6x центрифугированием 200 мкл загрузочного/промывочного растворителя. Вымойте отжимной наконечник 200 мкл 80% ACN/0,1% раствора FA.
  6. Элюируют пептиды с 200 мкл каждого из следующего: 60% ACN/0,1% FA (E1) и 40% ACN/0,1% FA (E2). Проанализируйте каждое элюирование отдельно.
  7. Элюируют пептиды 200 мкл каждого из следующих: 20% ACN/0,1% FA и 0,1% FA. Объедините два элюирования и проанализируйте как один образец (E3).
  8. Элюируют пептиды с 200 мкл каждого из следующих: 40% ACN/3% TFA; 50% ACN/6% TFA, 200 мМ NaCl; и 30% ACN/0,1% TFA. Объедините эти элюирования и проанализируйте как один (E4) после обессоливания с помощью упакованного наконечника.
  9. Обусловите материал до основного рН, используя 200 мкл 90% ACN/2,5% NH4OH для 3x. Откажитесь от этих стирок.
  10. Элюируют пептиды с 200 мкл каждого из следующего: 60% ACN/10% NH4OH (E5) и 40% ACN/10% NH4OH (E6). Проанализируйте эти элюирования отдельно после обессоливания с помощью упакованного наконечника.
  11. Элюируют пептиды с 200 мкл каждого из следующих веществ: 20% ACN/10% NH4OH; 10% ACN/10% NH4OH; и 10% NH4OH. Объедините эти элюирования и проанализируйте как один (E7) после обессоливания с помощью упакованного наконечника.
  12. Полностью высушите все элюи под вакуумом.

6. Нанопоточная обратная фазовая жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (nRPLC-MS)

ПРИМЕЧАНИЕ: Методы сбора и анализа данных MS разнообразны, и, таким образом, только один предлагаемый конвейер LC-MS (и связанные с ним параметры) описан здесь в следующих шагах. Образцы, полученные с использованием ранее описанных этапов подготовки и обогащения образцов, могут быть проанализированы с использованием других инструментальных установок, в том числе с использованием коммерчески доступных хроматографических колонок, при условии достаточного качества данных.

  1. Потяните и упакуйте капилляр длиной 15 см (внутренний диаметр 75 мкм) с использованием материала C18, как описано в19. Готовят подвижную фазу А (0,1% FA в воде) и подвижную фазу B (0,1% FA в ACN).
  2. Восстанавливайте обогащенные пептидные образцы в 15 мкл 3% подвижной фазы B. Загрузите 2 мкл образца (~13% объема образца) непосредственно на колонну. Проанализируйте каждый образец в техническом дубликате.
  3. Пептиды элюта используют градиент от 3% до 30% подвижной фазы В в течение 90 мин при скорости потока 0,3 мкл/мин. Промыть колонну с использованием 75% В в течение 8 мин, затем 95% В в течение 8 мин, закончив метод уравновешиванием при 3% В в течение 12 мин.
  4. Работа масс-спектрометра в режиме положительных ионов с использованием данных-зависимых сборов верхних 20 пиков со следующими параметрами: напряжение распыления 2 кВ; Обнаружение MS1 в LC/MS от 400-2000 м/з при разрешении 120 000, цель автоматического регулирования усиления (АРУ) 2E5, максимальное время впрыска 100 мс, 30% ВЧ объектив, квадрупольная изоляция с окном 1,6 м/з , для состояний заряда 2-8 и неопределенных, и динамическое исключение 30 с; ОбнаружениеMS 2 в LC/MS с использованием ступенчатой фрагментации HCD при 22%, 30% и 38%, фиксированной первой массы 120 м/z при разрешении 30 000, цели 5E4 AGC и минимальной интенсивности 2,5E4.

7. Анализ данных MS

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь представлен один конвейер анализа данных с использованием двух разных программ для анализа одного и того же набора данных. Фосфорилирование и гликозилирование могут быть найдены одновременно с использованием одного программного обеспечения вместо двух отдельных программ, как описано здесь, хотя в целом время поиска программного обеспечения пропорционально пространству поиска, то есть количеству рассматриваемых ПТМ. По этой причине параллельно с поиском гликопептидов и фосфопептидов используются два разных программного обеспечения.

  1. Обрабатывайте необработанные файлы данных с помощью соответствующего программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
    1. Поиск спектров по базе данных UniProt для человека (или соответствующего видоспецифичного). Установлено карбамидометилирование Cys в качестве фиксированной модификации. Установите максимальное количество пропущенных ферментативных расщеплений как два.
  2. В файлах исходных данных с использованием коммерческого программного обеспечения (см. Таблицу материалов) осуществляется поиск гликопептидов для анализа20. Используйте допуск по массе предшественника 10 ppm и допуск по массе фрагмента 0,01 Da с минимальной длиной пептида в четыре остатка.
    1. Поиск с использованием встроенной в программное обеспечение базы данных N-гликанов, дополненной типичными гликанами маннозы-6-фосфата(M6P),включая гексНАк(2)Гекс(4-9)Фосфо(1-2), ГексНАк(3-4)Гекс(4-9)Фосфо(1-2), ГексНАк(2)Гекс(3-4)Фосфо(1) и ГексНАк(3)Гекс(3-4)Фосфо(1).
    2. Устанавливают N-гликозилирование в качестве общей модификации. Установите максимальное общее количество модификаций на спектральное соответствие пептида (PSM) как одно общее и два редких.
    3. Установлены следующие переменные модификации: окисление Met (редко), деамидирование в Asn и Gln (редко) и фосфорилирование в Ser, Thr и Tyr (общее). Установите следующие идентификационные фильтры: > отсечки баллов 150, |лог-проб| > 1, а дельта-мод > 10.
    4. Экспортируйте и анализируйте результаты поиска на вкладках Группы белков и пептидов.
    5. Вручную проверяют идентификацию, содержащую гликаны M6P, на наличие иона оксония PhosphoHex (243 м/z) в спектрах MS/MS и удаляют ложноположительные идентификации, которые не содержат этого диагностического иона.
  3. В файлах исходных данных с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом (см. Таблицу материалов) поиск фосфопептидов для анализа21. Используйте толерантность к пептидам первого поиска 20 ppm и толерантность к пептидам основного поиска 4,5 ppm.
    1. Установите максимальное количество модификаций на пептид равным 5. Установите PSM и коэффициент ложного обнаружения белка (FDR) на 1% и минимальную длину пептида на 7 остатков.
    2. Установка переменных модификаций, таких как окисление при Met, Ацетилирование N-концевого белка и фосфорилирование при Ser, Thr и Tyr. Анализируйте результаты поиска с помощью файлов modificationSpecificPeptides.
  4. Определите количество идентификаций ПТМ на уровнях белка, пептида и сайта модификации.

Результаты

Репрезентативные данные масс-спектрометрии, включая необработанные файлы и результаты поиска, были переданы консорциуму ProteomeXchange через партнерский репозиторий PRIDE с идентификатором набора данных PXD03306522.

В этой работе дубликаты реплик инъекций были пр?...

Обсуждение

Двухфункциональная стратегия Ti(IV)-IMAC полезна для одновременного анализа N-гликопептидов и фосфопептидов из одного образца в рамках одного рабочего процесса подготовки образца. Было также показано, что методы, основанные на ERLIC, выполняют одновременное обогащение ПТМ. Обе стратегии ран?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Это исследование было частично поддержано грантовым финансированием от NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 и R21AG065728) и Фонда исследований ювенильного диабета (1-PNF-2016-250-S-B и SRA-2016-168-S-B). Данные, представленные здесь, также были частично получены при поддержке NIH / NCATS UL1TR002373 через Институт клинических и трансляционных исследований Университета Висконсина. Приборы Orbitrap были приобретены при поддержке гранта NIH (NIH-NCRR S10RR029531) и Офиса вице-канцлера по исследованиям и высшему образованию в Университете Висконсин-Мэдисон. Мы также хотели бы отметить щедрую поддержку Организации донорства органов и тканей Университета Висконсина, которая предоставила поджелудочную железу человека для исследований, и помощь Дэна Треммеля, доктора Сары Д. Сакетт и профессора Джона Одорико для предоставления образцов в нашу лабораторию. Наша исследовательская группа хотела бы выразить особую благодарность семьям, которые пожертвовали ткани для этого исследования. L.L. признает грант NIH S10OD025084, пилотный грант по борьбе с раком поджелудочной железы от Центра рака карбона Университета Висконсина (233-AAI9632), а также звание профессора выдающихся достижений Виласа и профессора заслуженной кафедры Чарльза Мельбурна Джонсона с финансированием, предоставленным Исследовательским фондом выпускников Висконсина и Школой фармации Университета Висконсин-Мэдисон.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic Acid, Glacial (Certified ACS)Fisher ScientificA38S-500
Acetone (Certified ACS)Fisher ScientificA18-1
Acetonitrile, Optima LC/MS GradeFisher ScientificA955-4
Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificA637-500
Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus)Fisher ScientificA669-212
Byonic softwareProtein Metricsn/aCommercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/)
C18 BEH materialWaters186002353Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet)
CAE-Ti-IMAC, 100%J&K Scientific2749380-1GMaterial used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment
Cellcrusher kitCellcrushern/aUsed for grinding tissue samples into powder before extraction
Eppendorf 5424R MicrocentrifugeFisher Scientific05-401-205For temperature-controlled centrifugation
cOmplete protease inhibitor cocktail tabletsSigma11697498001
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)PromegaV3151Protein reducing agent
Ethanol, 200 proof (100%), USPFisher22-032-601
Fisherbrand Analog Vortex MixerFisher Scientific02-215-414
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)Fisher Scientific02-681-320
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL)Fisher Scientific02-681-321
Fisherbrand Model 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB120110For sample lysis using ultrasonication
Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS GradeFisher ScientificA117-50
Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter)Polymicro Technologies LLC100 m TSP075375For in-house pulled and packed columns with integrated emitter
Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O)Sigma-Aldrich339261-100MLUsed for opening emitter of pulled capillary column
Iodoacetamide, BioUltraSigmaI1149-5GProtein reducing reagent
MaxQuant softwaren/an/aFree software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/)
Multi-therm Shaker with heating and coolingBenchmark ScientificH5000-HCHeating block
Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pkWaters186000383Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each)
OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tipsAgilentA57003100Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions
P-2000 Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-2000/FFor pulling nano-capillary columns for LC-MS
PhosSTOP phosphatase inhibitor tabletsSigma4906845001
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide AssayThermo Fisher Scientific23275
PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å)PolyLCBMSX1203Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment
Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificP285-500
Pressure injection cell with integrated magnetic stirplateNext AdvancePC77-MAGFor packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit
Proteome Discoverer softwareThermo Fisher Scientificn/aCommercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)
SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120Savantn/aCentrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat)
SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/ElectrophoresisFisher ScientificBP2436200
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificS271-500
TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96Glygen CorporationTT2EMT.96Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile))Sigma90360-100ML
Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99%Fisher Scientific60-017-61
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)Fisher ScientificBP152-500
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec GradePromegaV5071
Urea (Certified ACS)Fisher ScientificU15-500
Water, Optima LC/MS GradeFisher ScientificW64

Ссылки

  1. Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
  2. Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).
  3. Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases. Frontiers in Chemistry. 9, 707387 (2021).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
  5. Alpert, A. J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).
  6. Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029 (2020).
  7. Low, T. Y., et al. Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment. Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).
  8. Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides. ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).
  9. Zhou, Y., et al. An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues. Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).
  10. Tang, R., et al. Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).
  11. Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).
  12. Glover, M. S., et al. Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).
  13. Alpert, A. J. Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides. Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).
  14. Cui, Y., et al. Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).
  15. Cui, Y., et al. Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).
  16. Tabang, D. N., et al. Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry. Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).
  17. Huang, J., et al. Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates. Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).
  18. Huang, J., et al. Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides. Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).
  19. Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380 (2021).
  20. Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , (2012).
  21. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  22. Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
  23. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523 (2019).
  24. Zacharias, L. G., et al. HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).
  25. Yang, W., et al. Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography. Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).
  26. Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides. Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).
  27. Liu, M. -. Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
  28. Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
  29. Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010 (2021).
  30. Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The language of histone crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
  31. Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129 (2021).
  32. Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

183Ti IVIMACERLICMS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены