电穿孔介导的Cas9核糖核蛋白和mRNA递送到新鲜分离的初级小鼠肝细胞中

摘要

该协议描述了从肝脏中分离原代小鼠肝细胞并将CRISPR-Cas9电冲为核糖核蛋白和mRNA的技术，以破坏与肝脏遗传性代谢疾病相关的治疗靶基因。所描述的方法导致电穿孔后的高生存能力和高水平的基因修饰。

摘要

该协议描述了一种快速有效的方法，用于分离原代小鼠肝细胞，然后电穿孔介导的CRISPR-Cas9作为核糖核蛋白（RNP）和mRNA递送。使用三步逆行灌注方法分离原代小鼠肝细胞，结果高产率高达50×每肝10⁶ 个细胞，细胞活力>85%。该方案提供了肝细胞电镀、染色和培养的详细说明。结果表明，电穿孔提供了89%的高转染效率，这是通过小鼠肝细胞中绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞的百分比和>35%的适度细胞活力来测量的。

为了证明这种方法的实用性，将靶向羟基苯基丙酮酸二加氧酶基因的CRISPR-Cas9电穿孔到初级小鼠肝细胞中作为原理验证基因编辑，以破坏与肝脏遗传代谢疾病（IMD）相关的治疗基因。RNP的靶向编辑率更高，为78%，而mRNA的编辑效率为47%。使用白蛋白测定 法在体外 评估肝细胞的功能，该测定表明将CRISPR-Cas9作为RNP和mRNA递送导致原代小鼠肝细胞中具有相当的细胞活力。该协议的一个有希望的应用是为影响肝脏的人类遗传疾病生成小鼠模型。

引言

肝脏IMD是遗传性疾病，其特征在于缺乏参与代谢的关键肝酶，导致有毒代谢物的积累。如果不进行治疗，肝脏IMD会导致器官衰竭或过早死亡^1，2。肝脏IMD患者的唯一治疗选择是原位肝移植，由于供体器官的可用性低以及手术^后免疫抑制治疗的并发症，这是有限的3^，4。根据器官采购和移植网络最近收集的数据，肝移植等待名单上只有40%-46%的成年患者接受器官，而这些患者中有12.3%在^{等待名单上死亡}5。此外，只有5%的罕见肝病有FDA批准的治疗方法⁶。很明显，迫切需要对肝脏IMDs进行新的治疗。然而，需要适当的疾病模型来开发新的治疗方案。

使用 体外 和 体内 系统对人类疾病进行建模仍然是开发有效疗法和研究肝脏IMD病理学的障碍。来自罕见肝病患者的肝细胞很难获得⁷。动物模型对于发展对疾病病理学的理解和测试治疗策略至关重要。然而，一个障碍是从携带致命突变的胚胎中生成模型。例如，试图创建Alagille综合征（ALGS）的小鼠模型，其中胚胎含有 Jag1 基因5′端附近5 kb序列的纯合子缺失，导致胚胎⁸的早期死亡。此外，通过在胚胎干细胞中进行基因编辑来生成小鼠模型可能是时间和资源密集型的⁹。最后，突变将出现在目标组织之外，导致混淆变量，可能阻碍对疾病的研究⁹。体细胞基因编辑将允许在肝脏组织中更容易地进行编辑，并绕过与使用胚胎干细胞生成模型相关的挑战。

电穿孔使CRISPR-Cas9能够通过施加高压电流使细胞膜透化而直接输送到细胞核中，并且与许多细胞类型兼容，包括那些对转染技术不妥协的细胞类型，例如人胚胎干细胞，多能干细胞和神经元^10，11，12.然而，低生存能力是电穿孔的潜在缺点;优化程序可以产生高水平的递送，同时限制毒性¹³。最近的一项研究表明，将CRISPR-Cas9组分电穿孔到初级小鼠和人肝细胞中作为一种高效的方法的可行性¹⁴.肝细胞中的 离体 电穿孔有可能应用于为肝脏的人类IMD生成新的小鼠模型。

该协议提供了详细的分步程序，用于从肝脏中分离小鼠肝细胞，随后电穿孔CRISPR-Cas9作为RNP复合物，由Cas9蛋白和合成单向导RNA（sgRNA）组成，或Cas9 mRNA与sgRNA结合以获得高水平的靶向基因编辑。此外，该协议还提供了在CRISPR-Cas9电穿孔到新分离的小鼠肝细胞后量化基因编辑效率，活力和功能的方法。

研究方案

动物实验都是按照机构动物护理和使用委员会指南和克莱姆森大学批准的协议进行的。在8至10周龄的麻醉野生型C57BL / 6J小鼠中进行外科手术。

1. 动物手术

1. 溶液和仪器的制备
   注意:灌注溶液和麻醉鸡尾酒配方显示在 材料表中。
   1. 制备灌注液 1（肝素、EGTA 和 EBSS）、灌注液 2（聚乙二醇、乙二醇、高分子灌注酶、氯化钙₂ 和镁质₄）和灌注液 3（溶液 2 和自由酶）。确保溶液充分混合。
   2. 将水浴设置为42°C，并在开始程序之前预热灌注溶液1，2和3至少30分钟，并将它们保持在水浴中。
      注意:灌注溶液1和2将螯合钙并冲洗肝脏中的血液。灌注溶液3含有消化酶自由酶，以解离细胞外基质。
   3. 将 150 mL DMEM + 10% 胎牛血清 （FBS） 放入锥形管中，并将其保存在冰上。
      注意:该培养基将分别用于从肝囊中释放细胞并洗涤分离的肝细胞2.1和2.2。
   4. 将离心机置于4°C。
   5. 通过将管道的两端放入装有70%乙醇的烧瓶中并对乙醇循环三次来对泵管进行灭菌。
   6. 用蒸馏水清洗管子并清空。
   7. 用预热的30 mL灌注溶液1填充管子，然后填充8 mL灌注溶液2。如果管道仍有空间容纳更多流体，请用灌注溶液3填充管道的其余部分。切换到不同的灌注溶液时停止泵，以避免将气泡引入管道。
   8. 将多余的管子放入42°C水浴中以保持灌注溶液温暖。
   9. 将泵管的末端放在装有灌注溶液3的锥形管中，同时保持在水浴中。
      注意:此步骤对于允许泵在灌注过程中连续填充灌注溶液3是必需的。
2. 动物准备
   1. 通过腹膜内注射麻醉剂鸡尾酒以10-11.7μL / g体重的剂量麻醉小鼠。麻醉鸡尾酒的最终浓度为7.5毫克/毫升氯胺酮，0.25毫克/毫升乙酰丙嗪和1.5毫克/毫升甲苯噻嗪。
   2. 监测鼠标呼吸并检查鼠标是否对疼痛没有反应。等到小鼠的呼吸频率约为每分钟55-65次呼吸，对脚趾被捏住没有反应，并且尾巴松弛。此外，通过轻轻触摸闭合眼睛内侧的皮肤来检查睑板（眨眼）反射。如果小鼠眨眼或眼睛肌肉抽搐，请将整个麻醉鸡尾酒的剂量增加5-10μL。
   3. 将鼠标放在仰卧位，并使用针脚或胶带将四肢固定在表面上（补充图S1）。
   4. 用70%乙醇喷洒腹部，并用棉球拍干。
3. 肝脏灌注
   1. 用剪刀在腹部皮肤上做一个U形的侧切口，并通过侧面扩大孔。
   2. 继续将皮肤打开到肋骨笼。
   3. 使用剪刀，切开腹膜，使腹腔暴露在肋骨笼中，小心不要划伤任何器官。使用镊子的背面或剪刀的钝表面将肠道移动到右侧。识别下腔静脉和门静脉（补充图S1）。
   4. 启动泵以冲洗预热灌注溶液通过导管。
   5. 停止泵，并在所有空气通过系统冲洗后取出导管。将连接到导管的针尖以与静脉10°-20°的角度插入下腔静脉。从导管中取出针头，然后以平行于静脉的运动轻轻地将导管推入静脉。
      注意:用户应观察导管中血液的闪回，以验证静脉中的正确插管。
   6. 将导管连接到导管，而无需将导管进一步移动到静脉中。
   7. 以 2 毫升/分钟的流速启动泵。寻找肝脏立即变苍白，作为灌注成功的标志。
   8. 用剪刀切开门静脉。
   9. 逐渐将流速增加到 5 毫升/分钟。
   10. 使用镊子或棉签定期对大约切口部位的门静脉施加压力3秒，以阻断引流并促进良好的灌注。
   11. 一旦灌注溶液3流过，仔细监测肝脏的弹性。要确定肝脏是否软化，请用棉签或镊子轻轻按压肝脏，并检查肝脏上是否形成压痕。注意不要过度灌注，以避免细胞活力的损失。
   12. 一旦肝脏软化（在30-50 mL灌注溶液3流过后发生），停止泵，取出导管，然后仔细解剖肝脏。将肝脏放入含有冰冷DMEM + 10%FBS培养基的100毫米培养皿中。切除胆囊，小心不要溢出其内容物。旋转培养皿以轻轻去除可能的血凝块。
   13. 将肝脏转移到含有冰冷DMEM + 10%FBS培养基的新培养皿中。

2. 肝细胞分离

1. 从肝囊中释放细胞。
   1. 将培养皿放在冰上，使用两对无菌镊子，轻轻撕开所有叶上的肝囊。使用细胞提升器或镊子在培养基中轻轻旋转肝脏以释放肝细胞。继续这个运动，直到肝脏变得非常小，悬浮液变成棕色和不透明。
   2. 从平板中取出肝组织的残留物，并使用设置为低速的25mL血清学移液器，小心地将细胞悬浮液转移到装有100μm细胞过滤器的50mL锥形管（在冰上预冻）中。
   3. 将新鲜的冰冷DMEM + 10%FBS培养基加入培养皿中，以冲洗并从表面收集剩余的细胞并转移到50 mL锥形管中。重复此步骤，直到收集完所有单元格。
2. 清洗和纯化非实质细胞中的肝细胞。
   1. 在4°C下以50× g 在低减速或没有任何制动器的情况下将收集在50mL锥形管中的细胞离心5分钟。
   2. 丢弃含有碎屑和非实质细胞的上清液，并通过轻轻旋转管将沉淀重悬于剩余的上清液中。重悬沉淀后，加入30毫升新鲜冰冷的DMEM + 10%FBS培养基。
   3. 重复离心（步骤2.2.1）和洗涤（步骤2.2.3）三次。
   4. 将最终的细胞沉淀重悬于10 mL冰冷的DMEM + 10%FBS培养基中。
      注意:用于重悬颗粒的培养基体积取决于颗粒大小。如果颗粒明显小于15毫米，请使用1-5毫升冰冷的DMEM + 10%FBS培养基。
3. 细胞活力定量
   1. 在微量离心管中，将50μL0.4%台盼蓝溶液加入350μL肝细胞电镀培养基（PM）中。然后，加入100μL细胞悬浮液以进行最终的1:5稀释，并上下移液多次以混合。
   2. 使用血细胞计数器计数细胞密度和活力。计数时，将肝细胞悬浮液放在冰上，然后将冰桶放在设置为30rpm的轨道振荡器上，以防止肝细胞沉降。
   3. 如果细胞活力<70%，请按照下面的Percoll处理和离心步骤进行操作。
      1. 用10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）以9:1的比例稀释Percoll。
      2. 将肝细胞悬浮液与稀释的Percoll以1:1的比例混合。
      3. 在4°C下以200× g 离心10分钟。
      4. 丢弃含有死细胞的上清液。将颗粒重悬于冰冷的DMEM + 10%FBS培养基中。
      5. 再次计数细胞。
4. 检测肝细胞的平板性
   1. 使用1.5mL预热PM，以0.5×每mL10 6个细胞的密度将一些细胞铺在胶原I包被的⁶ 孔板上。
   2. 在轨道振荡器上将剩余的细胞保持在冰上，直到准备好进行电穿孔。
   3. 将细胞板置于37°C的水套CO₂ 培养箱中，以从北到南和从东到西的动作水平和垂直轻轻移动板以确保均匀的电镀。每1.5小时重复两次。
   4. 在接种后3小时验证细胞附着。
      注意:至少60%的细胞应粘附在板上，作为优质肝细胞的指标。
   5. 在接种后24小时将培养基改为预热的肝细胞维持培养基（MM），以维持培养物中的细胞。
5. 糖原染色
   1. 在细胞附着在6孔胶原I包被板上后，从培养的细胞中取出用过的培养基。
   2. 将细胞在冰冷的乙醇中固定10-15分钟。
   3. 用无菌水彻底清洗。
   4. 在1%高碘酸水溶液中孵育5分钟，然后用无菌水洗涤。
   5. 在100%希夫试剂中孵育30分钟。
      注意:在加入细胞之前，不得稀释希夫试剂。
   6. 在10分钟内用水洗涤三次。
   7. 安装在安装介质中。
   8. 在明场设置上使用显微镜成像。

3. 设计用于克里斯普瑞-卡斯9基因编辑的sgRNA

注意:本节描述了靶向小鼠羟基苯基丙酮酸双加氧酶（Hpd）基因的sgRNA的设计，作为原理验证基因编辑，以破坏与肝脏IMD相关的治疗靶基因。

1. 使用引用的软件¹⁵设计针对Hpd的引导序列。
2. 使用Ensembl基因组浏览器验证 Hpd 的序列。
3. 使用以下参数设计gRNA:20个核苷酸的单导引长度和NGG（N可以是任何核苷酸）原间隔邻接基序（PAM）序列。
4. 从 Hpd 中的外显子 3 中选择一个目标区域。
5. 从目标区域生成具有目标命中和目标外分数的引导序列列表。
   注意:目标命中分数表示给定设计的预测目标编辑效率:分数越高，编辑效率越高。脱靶分数与指导序列的特异性相关:分数越高表示脱靶编辑的可能性越低。理想情况下，两个分数都应该很高:目标得分>60，脱靶得分>50。
6. 选择目标命中和脱靶分数最高的指导序列。将含有引导序列的sgRNA化学合成。

4. 电穿孔和细胞培养

1. 制备CRISPR-Cas9基板、培养基、电池和电穿孔仪器
   1. 将整个随附的补充剂添加到PM中，并在37°C水浴中加热10分钟。
   2. 按下 电源 按钮打开电穿孔设备，然后按 x 按钮，然后按 向下箭头 按钮设置电穿孔程序，直到程序 T-028 出现在屏幕上。
   3. 通过将1.5 mL PM添加到六孔胶原I包衣板中，为电穿孔肝细胞准备目标孔。将板在37°C培养箱中孵育，直到准备使用。
   4. 将整个随附的补充剂加入电穿孔缓冲溶液中，并在室温下孵育10分钟。
      注意:在小瓶上标记电穿孔缓冲液的有效期（补充添加日期后3个月）。
   5. 从包装中取出电穿孔容器，并为每个样品贴上标签。
   6. 在PCR分条管中，通过将30μgsgRNA与300 pmol的Cas9蛋白结合来制备Cas9 RNP复合物，并在室温下孵育复合物10分钟。通过将30微克的sgRNA与4 μL的Cas9 mRNA（1 μg/ μL）结合来制备Cas9 mRNA。将mRNA-sgRNA混合物储存在冰上直至电穿孔。单独制备含有1.0μgeGFP mRNA的管子，以验证使用荧光显微镜进行电穿孔成功。
   7. 在100×g下以1.2×10⁶ 个细胞在100× g 下离心2分钟。
   8. 从细胞沉淀中除去上清液，并沿着管壁的一侧加入每次反应100μL电穿孔溶液。通过用手轻轻摇动管子将肝细胞重悬于电穿孔溶液中。
2. 将脆皮质酸钙蛋白和核糖核酸电穿孔到肝细胞中
   1. 一旦肝细胞均匀地分散在电穿孔溶液中，将100μL肝细胞悬浮液转移到含有Cas9复合物的条管中。
      注意:转移肝细胞时使用宽孔移液器吸头以保持细胞活力。
   2. 将带状孔的内容物转移到电穿孔容器中。
   3. 将核壳体放入电穿孔装置上的插槽中。通过按 x 按钮电穿孔肝细胞。电穿孔后，等待设备上弹出一个显示 "确定"的屏幕。再次按下 x 按钮并取出容器。
   4. 将电穿孔容器在冰上孵育15分钟。
   5. 向电穿孔容器中加入500μL预热PM。
   6. 将300μL电穿孔反应转移到预热板上的每个目标孔中。
      注意:每个电穿孔反应应该有两个目标孔。一口井将用于量化基因编辑效率;另一口孔将用于MTT和白蛋白测定。
   7. 为了防止肝细胞积聚在孔的中心，通过以从北到南和东西的运动水平和垂直轻轻移动板来分散细胞。确保板在移动时与培养箱架保持接触。在电镀电穿孔肝细胞后15，30，45，60和90分钟重复该运动。
   8. 将板在37°C孵育过夜。
   9. 接种细胞24小时后，从指定用于基因编辑分析的孔中取出培养基，并用0.25mg / mL基底膜基质覆盖物代替。
      注意:如果储存在冰箱中，将膜基质转移到4°C并使其解冻。由于基底膜基质在10°C以上是固体，因此基底膜基质保持在冰上或4°C直到准备使用至关重要。

5.计算与MM混合的膜基质的体积，得到0.25mg / mL的最终浓度

注意:对于6孔板，每孔需要2 mL覆盖物。

6.将计算出的膜基质体积加入冰冷MM中，上下移液10次，混合均匀

1. 将覆盖混合物缓慢移液在细胞顶部，并将板放回37°C培养箱中。
2. 每24小时用新鲜的维护介质替换培养基。
3. 在电镀后24小时，从指定用于MTT和白蛋白测定的孔中转移条件培养基。将条件培养基储存在微量离心管中，直到准备好进行白蛋白测定。继续进行步骤7.1进行MTT测定。
   注意:将调质培养基储存在4°C下进行短期储存（不到一天）。为了延长储存时间，将培养基储存在-80°C。

7. 电穿孔小鼠肝细胞的递送效率、活力和靶向编辑分析

1. 使用 MTT 测定进行活力测量
   1. 通过将1mL PBS加入一个5mg MTT小瓶中来制备12 mM MTT储备溶液。
   2. 向孔中加入150μLMTT储备溶液并孵育24小时。
   3. 孵育后，向每个孔中加入1.5mL十二烷基硫酸钠 - 盐酸盐（SDS-HCl）溶液，然后移液器混合。
   4. 将板在37°C下孵育4小时，并寻找培养基颜色从透明到紫色的变化以指示活细胞。
   5. 使用移液管再次混合每个样品，并使用酶标仪读取570nm处的吸光度。
   6. 使用等式 （1） 计算 Cas9 处理样品的归一化活力:
      （1）
2. 白蛋白测定以评估肝细胞功能
   1. 将50μL调节培养基转移到白蛋白试剂盒提供的板中的孔中。覆盖孔并在室温下孵育2小时。
   2. 用200μL洗涤缓冲液洗涤孔5x。
   3. 倒置板以清空纸巾上的每个孔，然后轻拍几次。
   4. 洗涤后，向每个孔中加入白蛋白测定试剂盒中提供的50μL生物素化抗体，并在室温下孵育1小时。
   5. 重复步骤5.2.2-5.2.3以洗涤孔。
   6. 向每个孔中加入白蛋白测定试剂盒中提供的50μL链霉亲和素 - 过氧化物酶，并在室温下孵育30分钟。
   7. 重复步骤 5.2.2。
   8. 每孔加入白蛋白测定试剂盒中提供的50μL致色性底物，并在室温下孵育30分钟。轻轻敲击盘子以确保均匀混合。用移液器吸头去除任何气泡。
   9. 最后，向每个孔中加入50μL终止溶液，并寻找从黄色到蓝色的颜色变化以指示功能细胞。
   10. 立即使用酶标仪读取450nm处的吸光度。
3. 估计用eGFP mRNA电穿孔的孔中的递送效率。
   1. 电穿孔后24小时捕获肝细胞的相差和绿色荧光图像。在井内的不同位置拍摄三张图像。
   2. 将单元格的图像上传到图像J。在" 图像 "选项卡下，选择" 类型| 16 位 "以将图像转换为灰度。
   3. 若要突出显示图像中的单元格结构，请在" 图像 "选项卡下，选择" 调整|阈值。调整滑块以突出显示单元格。
   4. 在" 进程 "选项卡下，选择" 减去背景" 以消除背景噪音。
   5. 通过单击" 分析 "选项卡对单元格进行计数，然后选择" 分析粒子"。单击 "确定" 生成计数粒子的列表。
   6. 通过将绿色荧光图像中的计数颗粒数除以相应相差图像中计数的颗粒数来计算GFP阳性细胞的百分比。
4. 分析目标Cas9活性
   1. 从电穿孔细胞中提取基因组DNA。
      1. 电穿孔3天后从板中取出培养基，并加入500μL0.25%胰蛋白酶。在37°C孵育5分钟。孵育后移液几次，以确保肝细胞已从板中分离出来。
      2. 将胰蛋白酶消化的细胞悬浮液转移到微量离心管中，并在室温下以800× g 在台式离心机中旋转10分钟。纺纱后，检查管子是否有颗粒。
      3. 通过移液除去含有胰蛋白酶的上清液。确保不要打扰颗粒。将沉淀重悬于80μLDNA提取溶液中。如果沉淀难以看到，则将管的内容物重悬于50μL DNA提取溶液中。
      4. 涡旋30秒，以确保颗粒重悬。将悬浮液转移到PCR分体条管中，并将其置于热循环仪中。在95°C下运行15分钟，在68°C下运行8分钟。
   2. PCR扩增靶位点。
   3. 按照下面描述的步骤，使用DNA聚合酶扩增 Hpd 靶向区域。
      1. 制备含有0.5μL 10 mM dNTPs，0.5μL10μM前向引物，0.5μL10μM反向引物，0.125μLTaq聚合酶，5μL从肝细胞中提取的基因组DNA和18.375μL无核酸酶水的反应。引物序列见 补充表S1 。
      2. 短暂涡旋并快速离心PCR混合物，以确保溶液位于管的底部。
      3. 将PCR混合物置于热循环仪中并在以下条件下扩增:94°C进行30秒变性，30次循环94°C进行30秒，57°C循环45秒退火，68°C增温1分钟，最终延长68°C5分钟。
         注意:PCR反应的退火温度将根据引物的成分而变化。在进行PCR之前，请考虑使用熔解温度计算器。
      4. 为了确认正确的产品尺寸，将3μLPCR产物与2μL水和1μL6x染料混合。在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，并确认正确的产品尺寸。
   4. 使用磁珠纯化DNA。
      注意:离心柱也可用于PCR清理。以下是使用磁珠纯化PCR产物的程序。
      1. 从4°C中取出磁珠，使其达到室温。
      2. 短暂涡旋并快速离心PCR混合物。
      3. 加入相当于PCR混合物体积的1.8×珠体积的珠子。移液PCR微球混合10x以确保溶液均匀混合。
      4. 在室温下孵育10分钟。
      5. 将PCR磁珠混合物转移到PCR板上并将其放在磁板上。
      6. 将板在磁铁上孵育5分钟。5分钟后，检查溶液是否透明，并且磁珠已绑定到磁铁上，然后再进行下一步。
      7. 弃去上清液。
      8. 向孔中加入200μL70%乙醇并孵育30秒。
         注意:在进行清理之前不久应制备70%乙醇，以防止DNA丢失。
      9. 弃去上清液并重复步骤7.4.4.8。
      10. 除去上清液，在室温下干燥3分钟以除去痕量乙醇。
      11. 从磁铁上取下板，向样品中加入22μL水。上下移液10倍，将水和珠子混合。
      12. 将样品在室温下孵育3分钟。
      13. 将板移回磁铁并孵育3分钟或直到溶液澄清。
      14. 将20μL样品转移到PCR管中。注意不要携带珠子。
   5. 通过桑格测序对纯化的DNA扩增子进行序列化。
   6. 将处理过的样品和对照（未处理）样品的 .ab1 序列文件上传到通过分解跟踪 （TIDE）¹⁶ 以量化目标站点的插入量。

结果

从肝脏中分离出可平板的原代肝细胞
肝脏灌注和肝细胞分离的整个过程如图 1所示。在该实验中，使用了野生型，8-10周龄的C57BL6 / 6J小鼠。该程序预计每只小鼠产生20-50个×10⁶ 个细胞，存活率在85%至95%之间。如果活力<70%，则应遵循全唇处理以去除死细胞。新鲜分离的肝细胞应接种在胶原 I 包被或含氮组织培养板上。在电镀的3-12小时内，预计肝细胞将?...

讨论

肝细胞分离方案中概述的步骤具有挑战性，需要熟练练习。从肝脏中成功分离肝细胞有几个关键步骤。首先，下腔静脉的适当插管对于完全肝脏灌注至关重要。灌注后肝脏无变白表明导管移位（表1）。下腔静脉（逆行灌注）在手术中管，因为它比门静脉（顺行灌注）更简单，更容易获得^17，18。一些方案使用缝合线来固定导管^1...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural	USA Scientific	1402-4700
6-well Collagen Plates	Advanced Biomatrix	5073
accuSpin Micro 17R	Fisher Scientific	13-100-675
All-in-one Fluorescent Microscope	Keyence	BZ-X810
Analog Vortex Mixer	VWR	97043-562
ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL	ThermoFisher Scientific	2079GPK
Automated Cell Counter	Bio-Rad Laboratories	TC20
Blue Wax Dissection Tray	Braintree Scientific Inc.	DTW1	9" x 6.5" x 1/2"+F21
Cell scraper/lifter	Argos Technologies	UX-04396-53	Non-pyrogenic, sterile
Conical tubes (15 mL)	Fisher Scientific	339650
Conical tubes (50 mL)	Fisher Scientific	14-432-22
Cotton applicators	Fisher Scientific	22-363-170
Curved scissors	Cooper Surgical	62131
Disposable Petri Dishes	Falcon	351029	100mm,sterile
Disposable Petri Dishes	VWR	25373-100	35mm, sterile
Epoch Microplate Spectrophotometer	BioTek Instruments	250082
Falcon Cell strainer (70 µm)	Fisher Scientific	08-771-2
Forceps	Cooper Surgical	61864	Euro-Med Adson Tissue Forceps
IV catheters	BD	382612	24 G x 0.75 in
IV infusion set	Baxter	2C6401
MyFuge 12 Mini Centrifuge	Benchmark Scientific	1220P38
Needles	Fisher Scientific	05-561-20	25 G
Nucleofector 2b Device	Lonza	AAB-1001	Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes
Peristaltic Pump	Masterflex	HV-77120-42	10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC
Precision pump tubing	Masterflex	HV-96410-14	25 ft, silicone
Primaria Culture Plates	Corning Life Sciences	353846	Nitrogen-containing tissue culture plates
Serological Pipets (25 mL)	Fisher Scientific	12-567-604
Syringes	BD	329464	1 mL, sterile
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories	1861096
Water bath	ALT	27577	Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3	IDT	1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL	Fisher Scientific	NC9959336
CleanCap Cas9 mRNA	Trilink Biotechnologies	L-7606-100
CleanCap EGFP mRNA	Trilink Biotechnologies	L-7201-100
Corning Matrigel Matrix	Corning Life Sciences	356234
DMEM	ThermoFisher Scientific	11885076	Low glucose, pyruvate
Ethanol 70%	VWR	71001-652
Fetal bovine serum	Thermoscientific	26140-079
Hepatocyte Maintenance Medium (MM)	Lonza	MM250
Hepatocyte Plating Medium (PM)	Lonza	MP100
Mouse Albumin ELISA Kit	Fisher Scientific	NC0010653
Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit	Lonza	VPL-1004
OneTaq HotStart DNA Polymerase	New England Biolabs	M0481L
PBS 10x pH 7.4	Thermoscientific	70011-044	No calcium or magnesium chloride
Percoll (PVP solution)	Santa Cruz Biotechnology	sc-500790A
Periodic acid	Sigma-Aldrich	P7875-25G
Permount Mounting Medium	VWR	100496-550
QuickExtract DNA Extraction Solution	Lucigen Corporation	QE05090
Schiff’s fuchsin-sulfite reagent	Sigma-Aldrich	S5133
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056	Phenol red
Vybrant MTT Cell Viability Assay	ThermoFisher Scientific	V13154
Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized)			Stable at 4 °C for 2 months
EBSS	Fisher Scientific	14155063	Complete to 200 mL
EGTA (0.5 M)	Bioworld	40520008-1	200 µL
HEPES (pH 7.3, 1 M)	ThermoFisher Scientific	AAJ16924AE	2 mL
Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized)			Stable at 4 °C for 2 months
CaCl2·2H20 (1.8 mM)	Sigma	C7902-500G	360 µL of 1 M stock
EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)	Fisher Scientific	14-155-063	Complete to 200 mL
HEPES (1 M)	ThermoFisher Scientific	AAJ16924AE	2 mL
MgSO4·7H20 (0.8 mM)	Sigma	30391-25G	160 µL of 1 M stock
Perfusion Solution 3			Prepared fresh prior to use
Solution 2			50 mL
Liberase	Roche	5401127001	0.094 Wunsch units/mL
Mouse Anesthetic Cocktail
Acepromzine			0.25 mg/mL final concentration
Ketamine			7.5 mg/mL final concentration
Xylazine			1.5 mg/mL final concentration
Software	URL
Benchling	https://www.benchling.com/
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Tracking of Indels by Decomposition	https://tide.nki.nl/