Entrega mediada por eletroporação de cas9 ribonucleoproteínas e mRNA em hepatócitos de rato primário recém-isolados

Resumo

Este protocolo descreve técnicas para isolar hepatócitos primários do fígado e eletroporar CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas e mRNA para interromper um gene alvo terapêutico associado a uma doença metabólica herdada do fígado. Os métodos descritos resultam em alta viabilidade e altos níveis de modificação genética após a eletroporação.

Resumo

Este protocolo descreve um método rápido e eficaz para isolar hepatócitos primários do rato seguido pela entrega mediada por eletroporação de CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas (RNPs) e mRNA. Os hepatócitos primários do camundongo foram isolados usando um método de perfusão retrógrada de três etapas, resultando em altos rendimentos de até 50 × 10⁶ células por fígado e viabilidade celular de >85%. Este protocolo fornece instruções detalhadas para chapeamento, coloração e hepatócitos. Os resultados indicam que a eletroporação proporciona uma alta eficiência de transfecção de 89%, medida pela porcentagem de células positivas de proteína fluorescente verde (GFP) e viabilidade celular modesta de >35% em hepatócitos de camundongos.

Para demonstrar a utilidade dessa abordagem, o CRISPR-Cas9 direcionado ao gene de dioxygenase hidroxifenyfenyruvate foi eletroporado em hepatócitos primários como prova de princípio de edição de genes para interromper um gene terapêutico relacionado a uma doença metabólica herdada (IMD) do fígado. Observou-se maior escíctil de 78% para RNPs em comparação com 47% de eficiência de edição com mRNA. A funcionalidade dos hepatócitos foi avaliada in vitro usando um ensaio de albumina que indicava que a entrega de CRISPR-Cas9 como RNPs e mRNA resulta em viabilidade celular comparável em hepatócitos de camundongos primários. Uma aplicação promissora para este protocolo é a geração de modelos de camundongos para doenças genéticas humanas que afetam o fígado.

Introdução

IMDs do fígado são distúrbios genéticos caracterizados pela deficiência de uma enzima hepática crucial envolvida no metabolismo que leva ao acúmulo de metabólitos tóxicos. Sem tratamento, as IMDs do fígado resultam em falência de órgãos ou morte prematura ^1,2. A única opção curativa para pacientes com IMDs do fígado é o transplante hepático ortotópico, que é limitado devido à baixa disponibilidade de órgãos doadores e complicações da terapia imunossupressor após o procedimento ^3,4. De acordo com dados recentes coletados pela Rede de Captação e Transplante de Órgãos, apenas 40%-46% dos pacientes adultos na lista de espera por transplante de fígado recebem um órgão, enquanto 12,3% desses pacientes morrem enquanto estão na lista^{de espera 5}. Além disso, apenas 5% de todas as doenças raras do fígado têm um tratamento aprovado pela FDA⁶. É claro que há uma necessidade crítica de novos tratamentos para IMDs do fígado. No entanto, modelos adequados de doenças são necessários para desenvolver novas opções terapêuticas.

Modelar doenças humanas usando sistemas in vitro e in vivo continua sendo um obstáculo para o desenvolvimento de terapias eficazes e o estudo da patologia dos DDM do fígado. Hepatócitos de pacientes com doenças hepáticas raras são desafiadores para obter⁷. Modelos animais são cruciais para o desenvolvimento da compreensão da patologia da doença e para testar estratégias terapêuticas. No entanto, um obstáculo é a geração de modelos a partir de embriões portadores de mutações letais. Por exemplo, tentativas de criar modelos de camundongos da Síndrome de Alagille (ALGS) com embriões contendo exclusões homozigosas de uma sequência de 5 kb perto do final de 5′do gene Jag1 resultaram na morte precoce dos embriões⁸. Além disso, gerar modelos de mouse por edição de genes em células-tronco embrionárias pode ser o^tempo e o recurso intensivo 9. Por fim, mutações aparecerão fora do tecido alvo, levando a variáveis de confusão que podem impedir o estudo da doença⁹. A edição de genes somáticos permitiria uma edição mais fácil no tecido hepático e contornaria os desafios associados à geração de modelos usando células-tronco embrionárias.

A eletroporação permite a entrega do CRISPR-Cas9 diretamente no núcleo, aplicando correntes de alta tensão para permeabiliizar a membrana celular e é compatível com muitos tipos de células, incluindo aquelas que são intransigentes às técnicas de transfecção, como células-tronco embrionárias humanas, células-tronco pluripotentes e neurônios 10,11,12 . No entanto, a baixa viabilidade é uma potencial desvantagem da eletroporação; otimizar o procedimento pode produzir altos níveis de entrega ao mesmo tempo em que limita a toxicidade¹³. Um estudo recente demonstra a viabilidade de eletroporar componentes CRISPR-Cas9 em hepatócitos primários e humanos como uma abordagem altamente eficiente¹⁴. A eletroporação ex vivo em hepatócitos tem potencial para ser aplicada para gerar novos modelos de camundongos para IMDs humanos do fígado.

Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo detalhado para isolar hepatócitos de camundongos do fígado e, posteriormente, eletroporar CRISPR-Cas9 como complexos RNP, consistindo de proteína Cas9 e RNA de guia único sintético (sgRNA), ou Cas9 mRNA combinado com sgRNA para obter altos níveis de edição de genes no alvo. Além disso, o protocolo fornece métodos para quantificar a eficiência, a viabilidade e a funcionalidade de edição de genes após a eletroporação do CRISPR-Cas9 em hepatócitos de camundongos recém-isolados.

Protocolo

Os experimentos em animais foram todos realizados em conformidade com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e protocolos aprovados na Universidade Clemson. Os procedimentos cirúrgicos foram realizados em camundongos C57BL/6J anestoetizados entre 8 e 10 semanas de idade.

1. Cirurgia animal

1. Elaboração de soluções e instrumentos
   NOTA: Soluções de perfusão e receitas de coquetéis de anestesia são mostradas na Tabela de Materiais.
   1. Preparar solução de perfusão 1 (HEPES, EGTA e EBSS), Solução de Perfusão 2 (HEPES, EGTA, EBSS, CaCl₂ e MgSO₄) e Solução perfusion 3 (Solução 2 e Liberase). Certifique-se de que as soluções estão bem misturadas.
   2. Coloque o banho de água em 42 °C e as Soluções de Perfusão pré-intempicas 1, 2 e 3 por um mínimo de 30 minutos antes de iniciar o procedimento e mantenha-as no banho de água.
      NOTA: As soluções de perfusão 1 e 2 vão quimerar o cálcio e lavar o sangue no fígado. A Solução de Perfusão 3 contém a enzima digestiva liberase para dissociar a matriz extracelular.
   3. Coloque 150 mL de DMEM + 10% de soro bovino fetal (FBS) em tubos cônicos e mantenha-os no gelo.
      NOTA: Este meio será usado para liberar as células da cápsula hepática e lavar os hepatócitos isolados nas etapas 2.1 e 2.2, respectivamente.
   4. Coloque a centrífuga para 4 °C.
   5. Esterilize a tubulação da bomba colocando as duas extremidades da tubulação em um frasco cheio de 70% de etanol e pedalando o etanol três vezes.
   6. Lave a tubulação com água destilada e esvazie-a.
   7. Encha o tubo com 30 mL de Perfusion Solution 1, seguido por 8 mL de Solução Perfusion 2. Se a tubulação ainda tiver espaço para mais fluidos, encha o resto da tubulação com solução de perfusão 3. Pare a bomba ao mudar para uma solução de perfusão diferente para evitar a introdução de bolhas de ar na tubulação.
   8. Coloque o excesso de tubos no banho de água de 42 °C para manter as soluções de perfusão aquecidas.
   9. Coloque a extremidade da tubulação da bomba no tubo cônico contendo Solução de Perfusão 3, enquanto mantido no banho de água.
      NOTA: Esta etapa é necessária para permitir que a bomba se encha continuamente com a Solução de Perfusão 3 durante a perfusão.
2. Preparação animal
   1. Anestesia o rato injetando o coquetel anestésico intraperitoneal a uma dose de 10-11,7 μL/g de peso corporal. O coquetel anestésico tem concentração final de 7,5 mg/mL de cetamina, acepromazina de 0,25 mg/mL e 1,5 mg/mL de xilazína.
   2. Monitore a respiração do mouse e verifique se o mouse não está reagindo à dor. Espere até que o mouse tenha uma taxa de respiração de ~55-65 respirações por minuto, não responde a ter seus dedos beliscados, e tem uma cauda flácido. Além disso, verifique o reflexo palpebral (piscando) tocando levemente a pele no lado medial do olho fechado. Se o rato piscar ou os músculos dos olhos se contrairem, aumente a dose de todo o coquetel anestésico em 5-10 μL.
   3. Coloque o mouse de costas em uma posição supina e fixe os membros na superfície usando pinos ou fita (Figura Suplementar S1).
   4. Pulverize o abdômen com 70% de etanol e seque-o usando uma bola de algodão.
3. Perfusão hepática
   1. Faça uma incisão lateral em forma de U na pele do abdômen usando uma tesoura e expanda o orifício através dos lados.
   2. Continue abrindo a pele para a caixa torácica.
   3. Usando uma tesoura, corte o peritônio para expor a cavidade abdominal até a caixa torácica, tomando cuidado para não cortar nenhum órgão. Mova os intestinos para o lado direito usando a parte de trás das fórceps ou a superfície cega da tesoura. Identifique a veia inferior da veia vena e a veia portal (Figura Suplementar S1).
   4. Inicie a bomba para lavar a solução de perfusão pré-armada através do cateter.
   5. Pare a bomba e remova o cateter uma vez que todo o ar tenha sido bombeado através do sistema. Insira a ponta da agulha conectada ao cateter na veia cava inferior em um ângulo de 10°-20° na veia. Retire a agulha do cateter e empurre suavemente o cateter para dentro da veia em um movimento paralelo à veia.
      NOTA: O usuário deve observar flashback de sangue no cateter para verificar a cannulação adequada na veia.
   6. Conecte a tubulação ao cateter sem mover o cateter mais para dentro da veia.
   7. Inicie a bomba com uma vazão de 2 mL/min. Procure o fígado imediatamente ficando pálido como um sinal de que a perfusão é bem sucedida.
   8. Corte a veia do portal usando uma tesoura.
   9. Aumente gradualmente a vazão para 5 mL/min.
   10. Aplique pressão periodicamente na veia portal no local de corte aproximado por 3 s usando fórceps ou um cotonete para bloquear a drenagem e facilitar uma boa perfusão.
   11. Uma vez que a Solução de Perfusão 3 esteja fluindo, monitore cuidadosamente a elasticidade do fígado. Para determinar se o fígado está amolecido, pressione suavemente o fígado com um cotonete ou fórceps e verifique se as indagações se formam no fígado. Tenha cuidado para não exagerar para evitar a perda de viabilidade celular.
   12. Uma vez que o fígado é suavizado (ocorrendo após 30-50 mL de Perfusion Solution 3 fluiu), pare a bomba, remova o cateter e disseque cuidadosamente o fígado. Coloque o fígado em uma placa de Petri de 100 mm contendo DMEM gelado + 10% de FBS médio. Extite a vesícula biliar, tomando cuidado para não derramar seu conteúdo. Gire a placa de Petri para remover suavemente possíveis coágulos sanguíneos.
   13. Transfira o fígado para uma nova placa de Petri contendo DMEM gelado + 10% de FBS médio.

2. Isolamento hepatocito

1. Liberar células da cápsula hepática.
   1. Coloque a placa de Petri no gelo e usando dois pares de fórceps estéreis, rasgue suavemente a cápsula do fígado em todos os lóbulos. Gire suavemente o fígado ao redor no meio usando um levantador de células ou um fórceps para liberar os hepatócitos. Continue este movimento até que o fígado se torne muito pequeno e a suspensão fique marrom e opaca.
   2. Remova os restos do tecido hepático da placa e usando uma pipeta sorológica de 25 mL definida para baixa velocidade, transfira cuidadosamente a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mL (pré-estilhaçado no gelo) equipado com um coador de células de 100 μm.
   3. Adicione DMEM fresco e gelado + 10% de FBS médio à placa de Petri para lavar e coletar as células restantes da superfície e transferir para o tubo cônico de 50 mL. Repita esta etapa até que todas as células sejam coletadas.
2. Lave e purifique hepatócitos de células não parlamentares.
   1. Centrifugar as células coletadas no tubo cônico de 50 mL a 50 × g a 4 °C por 5 min em baixa desaceleração ou sem freios.
   2. Descarte o supernatante contendo detritos e células não-equiquiais e resuspenque a pelota no supernatante restante girando suavemente o tubo. Depois que a pelota for resuspended, adicione 30 mL de DMEM fresco e gelado + 10% de meio FBS.
   3. Repita a centrifugação (etapa 2.2.1) e a lavagem (passo 2.2.3) três vezes.
   4. Resuspende a última pelota celular em 10 mL de DMEM gelado + 10% de FBS médio.
      NOTA: O volume de médio utilizado para resuspensar a pelota depende do tamanho da pelota. Se a pelota for consideravelmente menor que 15 mm, use 1-5 mL de DMEM gelado + 10% de meio FBS.
3. Quantificação de viabilidade celular
   1. Em um tubo de microfuge, adicione 50 μL de solução Trypan Blue de 0,4% a 350 μL de Hepatocyte Plating Medium (PM). Em seguida, adicione 100 μL de suspensão celular para fazer uma diluição final de 1:5 e pipeta para cima e para baixo várias vezes para misturar.
   2. Conte a densidade celular e a viabilidade usando um hemótmetro. Enquanto estiver contando, coloque a suspensão do hepatócito no gelo e, em seguida, coloque o balde de gelo em um agitador orbital definido a 30 rpm para evitar que os hepatócitos se instalem.
   3. Siga o tratamento percoll e as etapas de centrifugação abaixo se a viabilidade celular for <70%.
      1. Percoll diluído com salina tamponada de fosfato de 10x (PBS) em uma proporção de 9:1.
      2. Misture a suspensão do hepatocitado com o Percoll diluído em uma proporção de 1:1.
      3. Centrifugar a 200 × g a 4 °C por 10 min.
      4. Descarte o supernatante contendo células mortas. Resuspense a pelota em DMEM gelado + 10% de FBS médio.
      5. Conte as células de novo.
4. Testando hepatócitos para plaquebilidade
   1. Emplaque algumas das células em placas de 6 poços revestidos de colágeno a uma densidade de 0,5 × 10⁶ células por mL usando 1,5 mL de PM pré-armado.
   2. Mantenha as células restantes no gelo enquanto estiver em um shaker orbital até estar pronto para realizar a eletroporação.
   3. Coloque a placa de células em uma incubadora de CO₂ com revestimento de água a 37 C. Mova a placa horizontal e verticalmente suavemente em um movimento norte-sul e leste-oeste para garantir o revestimento homogêneo. Repita o movimento mais duas vezes a cada 1,5 h.
   4. Verifique o acessório da célula em 3h após o revestimento.
      NOTA: Pelo menos 60% das células devem aderir à placa como um indicador de hepatócitos de boa qualidade.
   5. Mude o meio para o meio de manutenção de hepatócitos pré-armados (MM) em 24 horas após o revestimento para manter as células na cultura.
5. Coloração de glicogênio
   1. Depois que as células se anexaram às placas revestidas de colágeno de 6 poços, remova o meio gasto das células cultivadas.
   2. Conserte as células por 10-15 min em etanol gelado.
   3. Lave bem com água estéril.
   4. Incubar em ácido periódico aquoso de 1% por 5 min e depois lavar com água estéril.
   5. Incubar em Reagente 100% Schiff por 30 min.
      NOTA: O reagente Schiff não deve ser diluído antes de adicionar às células.
   6. Lave com água três vezes mais de 10 minutos.
   7. Monte em meio de montagem.
   8. Imagem usando um microscópio na configuração brightfield.

3. Design sgRNAs para edição de genes CRISPR-Cas9

NOTA: Esta seção descreve o desenho de um sgRNA direcionado ao gene de dioxygenase do camundongo hidroxifenylvote (Hpd) como prova de princípio de edição de genes para interromper um gene alvo terapêutico relacionado a um IMD do fígado.

1. Projete a sequência de guias visando o Hpd usando o software referenciado¹⁵.
2. Verifique a sequência de Hpd com o Navegador genoma Ensembl.
3. Use os seguintes parâmetros para projetar o gRNA: comprimento de guia único de 20 nucleotídeos e uma sequência NGG (N pode ser qualquer nucleotídeo) protoespaço-adjacente (PAM).
4. Selecione uma região alvo do exon 3 no Hpd.
5. Gere uma lista de sequências de guias da região alvo com pontuações on e off-target.
   NOTA: O Placar on-target indica a eficiência de edição no alvo prevista para o design dado: uma pontuação mais alta está correlacionada com maior eficiência de edição. O Escore fora do alvo se correlaciona com a especificidade da sequência guia: uma pontuação maior indica menor probabilidade de edição fora do alvo. O ideal é que ambas as pontuações sejam altas: a pontuação no alvo >60 e a pontuação fora do alvo >50.
6. Selecione a sequência de guias com as pontuações mais altas no alvo e fora do alvo. Tenha o sgRNA contendo a sequência guia quimicamente sintetizada.

4. Eletroporação e cultura celular

1. Preparação de substratos CRISPR-Cas9, mídia, células e o instrumento de eletroporação
   1. Adicione todo o suplemento de acompanhamento ao PM e aqueça no banho de água de 37 °C por 10 minutos.
   2. Ligue o dispositivo de eletroporação pressionando o botão de alimentação e defina o programa de eletroporação pressionando o botão x e, em seguida, o botão de seta para baixo até que o programa T-028 apareça na tela.
   3. Prepare os poços de destino para os hepatócitos eletroporados adicionando 1,5 mL de PM a placas revestidas de colágeno de seis poços. Incubar as placas em uma incubadora de 37 °C até estar pronta para uso.
   4. Adicione todo o suplemento de acompanhamento à solução de tampão de eletroporação e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos.
      NOTA: Rotule a data de validade do tampão de eletroporação no frasco (3 meses após a data de adição do suplemento).
   5. Remova os vasos de eletroporação da embalagem e rotule-os para cada amostra.
   6. Em tubos de tira dividida PCR, prepare os complexos Cas9 RNP combinando 30 μg de sgRNA com 300 pmol de proteína Cas9 e incubar os complexos em temperatura ambiente por 10 minutos. Prepare o Cas9 mRNA combinando 30 μg de sgRNA com 4 μL de Cas9 mRNA (1 μg/μL). Armazene a mistura mRNA-sgRNA no gelo até a eletroporação. Prepare separadamente um tubo contendo 1,0 μg de eGFP mRNA para verificar a eletroporação bem sucedida usando microscopia de fluorescência.
   7. Centrifugar 1,2 × 10⁶ células por reação de eletroporação a 100 × g por 2 min a 4 °C.
   8. Remova o sobrenatante da pelota celular e adicione 100 μL de solução de eletroporação por reação ao longo da lateral da parede do tubo. Resuspenque os hepatócitos na solução de eletroporação balançando o tubo suavemente à mão.
2. Eletroporação de RNPs CRISPR-Cas9 e mRNA em hepatócitos
   1. Uma vez que os hepatócitos pareçam uniformemente dispersos na solução de eletroporação, transfira 100 μL da suspensão do hepatócito para os tubos de tira contendo os complexos Cas9.
      NOTA: Use pontas de pipeta largas ao transferir hepatócitos para preservar a viabilidade celular.
   2. Transfira bem o conteúdo da tira para um vaso de eletroporação.
   3. Coloque o vaso nucleovette na ranhura no dispositivo de eletroporação. Eletroporar os hepatócitos pressionando o botão x . Após a eletroporação, espere uma tela aparecer no dispositivo que diz OK. Pressione novamente o botão x e remova o recipiente.
   4. Incubar o recipiente eletroporado no gelo por 15 minutos.
   5. Adicione 500 μL de PM pré-armado ao navio de eletroporação.
   6. Transfira 300 μL da reação de eletroporação para cada destino bem na placa pré-armada.
      NOTA: Deve haver dois poços de destino por reação de eletroporação. Um poço será usado para quantificar a eficiência de edição de genes; o outro poço será usado para os ensaios MTT e albumina.
   7. Para evitar que os hepatócitos se acumulem no centro do poço, disperse as células movendo suavemente placas horizontal e verticalmente em um movimento norte-sul e leste-oeste. Certifique-se de que a placa mantenha contato com a prateleira da incubadora enquanto ela está sendo movida. Repita este movimento aos 15, 30, 45, 60 e 90 minutos depois de emplacamento dos hepatócitos eletroporados.
   8. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.
   9. Remova o meio dos poços designados para análise de edição de genes 24 horas após o revestimento das células e substitua por sobreposição da matriz da membrana do porão de 0,25 mg/mL.
      NOTA: Se armazenado no congelador, transfira a matriz de membrana para 4 °C e deixe descongelar. Como a matriz de membrana do porão é sólida acima de 10 °C, é crucial que a matriz de membrana do porão permaneça no gelo ou a 4 °C até estar pronta para usar.

5. Calcule o volume da matriz de membrana para misturar com MM para dar uma concentração final de 0,25 mg/mL

NOTA: Para uma placa de 6 poços, é necessário 2 mL de sobreposição por bem.

6. Adicione o volume calculado da matriz de membrana ao mm gelado e misture por pipetar para cima e para baixo 10 vezes

1. Pipeta a mistura de sobreposição lentamente em cima das células e coloque a placa de volta na incubadora de 37 °C.
2. Substitua o meio por meio de manutenção fresco a cada 24 horas.
3. Às 24 horas após o revestimento, transfira o meio condicionado do poço designado para ensaios MTT e albumina. Armazene o meio condicionado em um tubo de microfuge até que esteja pronto para executar o ensaio albumin. Prossiga para a etapa 7.1 para o ensaio MTT.
   NOTA: Armazene o meio condicionado a 4 °C para armazenamento a curto prazo (menos de um dia). Para maior armazenamento, armazene o meio a -80 °C.

7. Análise da eficiência de entrega, viabilidade e edição on-target em hepatócitos de camundongos eletroporados

1. Medição de viabilidade usando ensaio MTT
   1. Prepare a solução de estoque MTT de 12 mM adicionando 1 mL de PBS a um frasco de 5 mg de MTT.
   2. Adicione 150 μL da solução de estoque MTT aos poços e incubar por 24 h.
   3. Após a incubação, adicione 1,5 mL de sulfato-cloridrato de sódio (SDS-HCl) para cada poço e, em seguida, pipeta para misturar.
   4. Incubar a placa por 4h a 37 °C e procurar uma mudança na cor do meio de claro para roxo para indicar células viáveis.
   5. Misture cada amostra novamente usando uma pipeta e leia a absorvância a 570 nm usando um leitor de microplacas.
   6. Calcule a viabilidade normalizada para amostras tratadas com Cas9 usando Eq (1):
      (1)
2. Ensaio de albumina para avaliar a funcionalidade do hepatócito
   1. Transfira 50 μL do meio condicionado para os poços na placa fornecida pelo kit albumina. Cubra os poços e incubar por 2h em temperatura ambiente.
   2. Lave os poços 5x com 200 μL de tampão de lavagem.
   3. Inverta a placa para esvaziar cada poço em papel de tecido e bata algumas vezes.
   4. Após a lavagem, adicione 50 μL do anticorpo biotinínado fornecido no kit de ensaio de albumina a cada poço e incubar à temperatura ambiente por 1h.
   5. Repita as etapas 5.2.2-5.2.3 para lavar os poços.
   6. Adicione 50 μL de streptavidin-peroxidase fornecido no kit de ensaio de albumina para cada poço e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.
   7. Repita o passo 5.2.2.
   8. Adicione 50 μL do substrato de cromosgógo fornecido no kit de ensaio de albumina por poço e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Toque suavemente na placa para garantir a mistura. Remova as bolhas de ar com uma ponta de pipeta.
   9. Por fim, adicione 50 μL de solução stop a cada poço e procure uma mudança de cor de amarelo para azul para indicar células funcionais.
   10. Prossiga imediatamente para ler a absorvância em 450 nm usando um leitor de microplacas.
3. Estime a eficiência de entrega em poços eletroporados com eGFP mRNA.
   1. Capturar imagens de contraste de fase e fluorescência verde de hepatócitos 24 h após eletroporação. Tire três imagens em diferentes locais dentro do poço.
   2. Envie imagens das células para ImageJ. Na guia Imagem , selecione Tipo | 16 bits para converter imagem em escala de cinza.
   3. Para destacar estruturas celulares na imagem, sob a guia Imagem , selecione Ajustar | O limiar. Ajuste o controle deslizante para destacar as células.
   4. Na guia Processar , selecione Subtrair o fundo para remover o ruído de fundo.
   5. Conte as células clicando na guia Analisar e selecione Analisar partículas. Clique em Ok para gerar uma lista de partículas contadas.
   6. Calcule a porcentagem de células positivas de GFP dividindo o número de partículas contadas nas imagens de fluorescência verde pelo número de partículas contadas na imagem de contraste de fase correspondente.
4. Análise da atividade cas9 on-target
   1. Extrair DNA genômico de células eletroporadas.
      1. Retire o meio da placa 3 dias após a eletroporação e adicione 500 μL de trippsina de 0,25%. Incubar a 37 °C por 5 min. Pipeta várias vezes após a incubação para garantir que os hepatócitos tenham se separado da placa.
      2. Transfira a suspensão celular experimentada para tubos de microcentrifuuge e gire em uma centrífuga de mesa a 800 × g por 10 minutos à temperatura ambiente. Depois de girar, examine os tubos em busca de pelotas.
      3. Remova o supernatante contendo trippsina por pipetação. Certifique-se de não perturbar a pelota. Resuspenque a pelota em 80 μL de solução de extração de DNA. Se a pelota for difícil de ver, resuspenque o conteúdo do tubo em 50 μL de solução de extração de DNA.
      4. Vórtice para 30 s para garantir que a pelota seja resuspendida. Transfira a suspensão para tubos de tira dividida PCR e coloque-os no cicloviário térmico. Corra por 15 min a 95 °C e 8 min a 68 °C.
   2. PCR-amplificar o lócus no alvo.
   3. Siga o procedimento descrito abaixo para amplificar a região alvo do Hpd usando polimerase de DNA.
      1. Prepare uma reação contendo 0,5 μL de 10 mM dNTPs, 0,5 μL de primer 10 μM Forward, 0,5 μL de primer reverso de 10 μM, 0,125 μL de polimerase Taq, 5 μL de DNA genômico extraído dos hepatócitos e 18,375 μL de água livre nuclease. Consulte a tabela suplementar S1 para obter sequências de primer.
      2. Brevemente vórtice e centrifugar rapidamente a mistura PCR para garantir que a solução esteja na parte inferior do tubo.
      3. Coloque a mistura de PCR em um cicloviário térmico e amplie nessas condições: 94 °C para 30 s para desnaturação, 30 ciclos de 94 °C para 30 s, 57 °C para 45 s para ressarnamento, 68 °C para 1 min e uma extensão final de 68 °C para 5 min.
         NOTA: A temperatura de ressarcial para a reação pcr varia dependendo da composição dos primers. Considere usar uma calculadora de temperatura de fusão antes de realizar o PCR.
      4. Para confirmar o tamanho correto do produto, misture 3 μL dos produtos PCR com 2 μL de água e 1 μL de corante de 6x. Execute com um gel de 1,5% de agarose e confirme o tamanho correto do produto.
   4. Purificar o DNA usando contas magnéticas.
      NOTA: As colunas de giro também podem ser usadas para limpeza do PCR. Abaixo estão os procedimentos para purificar produtos PCR usando contas magnéticas.
      1. Remova as contas magnéticas a partir de 4 °C e permita que elas atinjam a temperatura ambiente.
      2. Brevemente vórtice e centrifugar rapidamente a mistura PCR.
      3. Adicione um volume de contas iguais a 1,8× o volume da mistura PCR. Pipeta o mix pcr-contas 10x para garantir que a solução seja igualmente misturada.
      4. Incubar em temperatura ambiente por 10 minutos.
      5. Transfira a mistura pcr-contas para uma placa PCR e coloque-a em uma placa magnética.
      6. Incubar a placa no ímã por 5 minutos. Após os 5 minutos, verifique se a solução está clara, e as contas estão ligadas ao ímã antes de passar para o próximo passo.
      7. Descarte o supernatante.
      8. Adicione 200 μL de 70% de etanol ao poço e incubar por 30 s.
         NOTA: O etanol de 70% deve ser preparado pouco antes de realizar a limpeza para evitar a perda de DNA.
      9. Descarte o supernatante e repita o passo 7.4.4.8.
      10. Retire o supernaspe e deixe secar por 3 minutos à temperatura ambiente para remover vestígios de etanol.
      11. Retire a placa do ímã e adicione 22 μL de água à amostra. Pipeta para cima e para baixo 10x para misturar água e contas.
      12. Incubar as amostras por 3 minutos em temperatura ambiente.
      13. Transfira a placa de volta para o ímã e incubar por 3 minutos ou até que a solução esteja clara.
      14. Transfira 20 μL da amostra para um tubo PCR. Tome cuidado para que nenhuma conta seja levada.
   5. Sequência purificada amplicon de DNA por sanger sequenciamento.
   6. Envie arquivos de sequência .ab1 para amostras tratadas e de controle (não tratadas) para rastreamento de indels por Decomposição (TIDE)¹⁶ para quantificar indels no local alvo.

Resultados

Isolamento de hepatócitos primários plateable do fígado
O processo global de perfusão hepática e isolamento hepatocito é ilustrado na Figura 1. Neste experimento, foram utilizados ratos C57BL6/6J de 8-10 semanas de idade. Espera-se que o procedimento produza 20-50 × 10⁶ células por rato com uma viabilidade entre 85% e 95%. Se a viabilidade for <70%, o tratamento percoll deve ser seguido para remover células mortas. Hepatócitos recém-isolados devem se...

Discussão

As etapas descritas no protocolo para isolamento hepatócito são desafiadoras e exigem prática de proficiência. Existem vários passos-chave para o isolamento hepatócito bem sucedido do fígado. Em primeiro lugar, a canulação adequada da veia cava inferior é essencial para a perfusão hepática completa. A ausência de branqueamento no fígado após a perfusão indica deslocamento do cateter (Tabela 1). A veia cava inferior (perfusão retrógrada) foi cânulada no procedimento por ser mais simples...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural	USA Scientific	1402-4700
6-well Collagen Plates	Advanced Biomatrix	5073
accuSpin Micro 17R	Fisher Scientific	13-100-675
All-in-one Fluorescent Microscope	Keyence	BZ-X810
Analog Vortex Mixer	VWR	97043-562
ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL	ThermoFisher Scientific	2079GPK
Automated Cell Counter	Bio-Rad Laboratories	TC20
Blue Wax Dissection Tray	Braintree Scientific Inc.	DTW1	9" x 6.5" x 1/2"+F21
Cell scraper/lifter	Argos Technologies	UX-04396-53	Non-pyrogenic, sterile
Conical tubes (15 mL)	Fisher Scientific	339650
Conical tubes (50 mL)	Fisher Scientific	14-432-22
Cotton applicators	Fisher Scientific	22-363-170
Curved scissors	Cooper Surgical	62131
Disposable Petri Dishes	Falcon	351029	100mm,sterile
Disposable Petri Dishes	VWR	25373-100	35mm, sterile
Epoch Microplate Spectrophotometer	BioTek Instruments	250082
Falcon Cell strainer (70 µm)	Fisher Scientific	08-771-2
Forceps	Cooper Surgical	61864	Euro-Med Adson Tissue Forceps
IV catheters	BD	382612	24 G x 0.75 in
IV infusion set	Baxter	2C6401
MyFuge 12 Mini Centrifuge	Benchmark Scientific	1220P38
Needles	Fisher Scientific	05-561-20	25 G
Nucleofector 2b Device	Lonza	AAB-1001	Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes
Peristaltic Pump	Masterflex	HV-77120-42	10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC
Precision pump tubing	Masterflex	HV-96410-14	25 ft, silicone
Primaria Culture Plates	Corning Life Sciences	353846	Nitrogen-containing tissue culture plates
Serological Pipets (25 mL)	Fisher Scientific	12-567-604
Syringes	BD	329464	1 mL, sterile
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories	1861096
Water bath	ALT	27577	Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3	IDT	1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL	Fisher Scientific	NC9959336
CleanCap Cas9 mRNA	Trilink Biotechnologies	L-7606-100
CleanCap EGFP mRNA	Trilink Biotechnologies	L-7201-100
Corning Matrigel Matrix	Corning Life Sciences	356234
DMEM	ThermoFisher Scientific	11885076	Low glucose, pyruvate
Ethanol 70%	VWR	71001-652
Fetal bovine serum	Thermoscientific	26140-079
Hepatocyte Maintenance Medium (MM)	Lonza	MM250
Hepatocyte Plating Medium (PM)	Lonza	MP100
Mouse Albumin ELISA Kit	Fisher Scientific	NC0010653
Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit	Lonza	VPL-1004
OneTaq HotStart DNA Polymerase	New England Biolabs	M0481L
PBS 10x pH 7.4	Thermoscientific	70011-044	No calcium or magnesium chloride
Percoll (PVP solution)	Santa Cruz Biotechnology	sc-500790A
Periodic acid	Sigma-Aldrich	P7875-25G
Permount Mounting Medium	VWR	100496-550
QuickExtract DNA Extraction Solution	Lucigen Corporation	QE05090
Schiff’s fuchsin-sulfite reagent	Sigma-Aldrich	S5133
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056	Phenol red
Vybrant MTT Cell Viability Assay	ThermoFisher Scientific	V13154
Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized)			Stable at 4 °C for 2 months
EBSS	Fisher Scientific	14155063	Complete to 200 mL
EGTA (0.5 M)	Bioworld	40520008-1	200 µL
HEPES (pH 7.3, 1 M)	ThermoFisher Scientific	AAJ16924AE	2 mL
Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized)			Stable at 4 °C for 2 months
CaCl2·2H20 (1.8 mM)	Sigma	C7902-500G	360 µL of 1 M stock
EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)	Fisher Scientific	14-155-063	Complete to 200 mL
HEPES (1 M)	ThermoFisher Scientific	AAJ16924AE	2 mL
MgSO4·7H20 (0.8 mM)	Sigma	30391-25G	160 µL of 1 M stock
Perfusion Solution 3			Prepared fresh prior to use
Solution 2			50 mL
Liberase	Roche	5401127001	0.094 Wunsch units/mL
Mouse Anesthetic Cocktail
Acepromzine			0.25 mg/mL final concentration
Ketamine			7.5 mg/mL final concentration
Xylazine			1.5 mg/mL final concentration
Software	URL
Benchling	https://www.benchling.com/
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Tracking of Indels by Decomposition	https://tide.nki.nl/