JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает методы выделения первичных гепатоцитов мыши из печени и электропорации CRISPR-Cas9 в виде рибонуклеопротеинов и мРНК для нарушения терапевтического гена-мишени, связанного с наследственным метаболическим заболеванием печени. Описанные методы приводят к высокой жизнеспособности и высоким уровням генной модификации после электропорации.

Аннотация

Этот протокол описывает быстрый и эффективный метод выделения первичных гепатоцитов мыши с последующей опосредованной электропорацией доставки CRISPR-Cas9 в виде рибонуклеопротеинов (RNP) и мРНК. Первичные мышиные гепатоциты были выделены с использованием трехступенчатого метода ретроградной перфузии, что привело к высоким выходам до 50 × 106 клеток на печень и жизнеспособности клеток >85%. Этот протокол содержит подробные инструкции по нанесению покрытий, окрашиванию и культивированию гепатоцитов. Результаты показывают, что электропорация обеспечивает высокую эффективность трансфекции в 89%, что измеряется процентом зеленых флуоресцентных белковых (GFP)-положительных клеток и умеренной жизнеспособностью клеток >35% в гепатоцитах мышей.

Чтобы продемонстрировать полезность этого подхода, CRISPR-Cas9, нацеленный на ген гидроксифенилпируватдиоксигеназы, был электропорирован в первичные гепатоциты мыши в качестве доказательства принципиального редактирования генов для нарушения терапевтического гена, связанного с наследственным метаболическим заболеванием (IMD) печени. Более высокое целевое редактирование на 78% наблюдалось для RNP по сравнению с 47% эффективностью редактирования с мРНК. Функциональность гепатоцитов оценивали in vitro с использованием альбуминового анализа, который показал, что доставка CRISPR-Cas9 в виде РНК и мРНК приводит к сопоставимой жизнеспособности клеток в первичных гепатоцитах мышей. Перспективным применением этого протокола является генерация мышиных моделей генетических заболеваний человека, влияющих на печень.

Введение

ИМД печени – это генетические нарушения, характеризующиеся дефицитом важнейшего печеночного фермента, участвующего в метаболизме, что приводит к накоплению токсичных метаболитов. Без лечения ИМД печени приводят к органной недостаточности или преждевременной смерти 1,2. Единственным лечебным вариантом для пациентов с ИМД печени является ортотопическая трансплантация печени, которая ограничена из-за низкой доступности донорских органов и осложнений от иммуносупрессивной терапии после процедуры 3,4. Согласно последним данным, собранным Сетью закупок и трансплантации органов, только 40-46% взрослых пациентов в списке ожидания трансплантации печени получают орган, в то время как 12,3% этих пациентов умирают, находясь в листе ожидания5. Более того, только 5% всех редких заболеваний печени имеют одобренное FDA лечение6. Ясно, что существует критическая потребность в новых методах лечения ИМД печени. Тем не менее, для разработки новых терапевтических вариантов требуются соответствующие модели заболеваний.

Моделирование заболеваний человека с использованием систем in vitro и in vivo остается препятствием для разработки эффективных методов лечения и изучения патологии ИМД печени. Гепатоциты у пациентов с редкими заболеваниями печени трудно получить7. Животные модели имеют решающее значение для развития понимания патологии заболевания и для тестирования терапевтических стратегий. Однако одним из препятствий является создание моделей из эмбрионов, несущих смертельные мутации. Например, попытки создать мышиные модели синдрома Алагилле (ALGS) с эмбрионами, содержащими гомозиготные делеции последовательности 5 кб вблизи 5'-конца гена Jag1 , привели к ранней смерти эмбрионов8. Кроме того, генерация мышиных моделей путем редактирования генов в эмбриональных стволовых клетках может быть трудоемкой и ресурсоемкой9. Наконец, мутации будут появляться вне целевой ткани, что приведет к путанице переменных, которые могут препятствовать изучению заболевания9. Редактирование соматических генов позволит упростить редактирование в ткани печени и обойти проблемы, связанные с созданием моделей с использованием эмбриональных стволовых клеток.

Электропорация позволяет доставлять CRISPR-Cas9 непосредственно в ядро путем применения высоковольтных токов для пермеабилизации клеточной мембраны и совместима со многими типами клеток, включая те, которые непримиримы к методам трансфекции, таким как эмбриональные стволовые клетки человека, плюрипотентные стволовые клетки и нейроны 10,11,12 . Однако низкая жизнеспособность является потенциальным недостатком электропорации; оптимизация процедуры может привести к высоким уровням доставки при ограничении токсичности13. Недавнее исследование демонстрирует возможность электропорации компонентов CRISPR-Cas9 в первичные гепатоциты мыши и человека в качестве высокоэффективного подхода14. Электропорация ex vivo в гепатоцитах может быть применена для создания новых мышиных моделей для человеческих IMD печени.

Этот протокол обеспечивает подробную пошаговую процедуру выделения гепатоцитов мыши из печени и последующего электропорации CRISPR-Cas9 в виде комплексов RNP, состоящих из белка Cas9 и синтетической однонаправленной РНК (sgRNA) или мРНК Cas9 в сочетании с sgRNA для получения высоких уровней редактирования генов на мишени. Кроме того, протокол предоставляет методы количественной оценки эффективности, жизнеспособности и функциональности редактирования генов после электропорации CRISPR-Cas9 в свежеизолированные гепатоциты мыши.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию и утвержденными протоколами в Университете Клемсона. Хирургические процедуры проводились на анестезируемых мышах дикого типа C57BL/6J в возрасте от 8 до 10 недель.

1. Хирургия животных

  1. Подготовка растворов и инструментов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузионные растворы и рецепты коктейлей для анестезии приведены в Таблице материалов.
    1. Готовят перфузионный раствор 1 (HEPES, EGTA и EBSS), перфузионный раствор 2 (HEPES, EGTA, EBSS, CaCl2 и MgSO4) и перфузионный раствор 3 (раствор 2 и либераза). Убедитесь, что решения хорошо перемешаны.
    2. Установите водяную баню на 42 °C и предваренные перфузионные растворы 1, 2 и 3 минимум за 30 минут до начала процедуры и держите их на водяной бане.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузионные растворы 1 и 2 хелатируют кальций и вымывают кровь в печени. Перфузионный раствор 3 содержит пищеварительный фермент либеразу для диссоциации внеклеточного матрикса.
    3. Поместите 150 мл DMEM + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в конические трубки и держите их на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта среда будет использоваться для высвобождения клеток из капсулы печени и промывки изолированных гепатоцитов на этапах 2.1 и 2.2 соответственно.
    4. Установите центрифугу на 4 °C.
    5. Стерилизуйте насосную трубку, поместив оба конца трубки в колбу, заполненную 70% этанолом, и трижды циклически перерабатывайте этанол.
    6. Вымойте трубку дистиллированной водой и опорожните ее.
    7. Наполните трубку предварительно расплавленным 30 мл перфузионного раствора 1, а затем 8 мл перфузионного раствора 2. Если в трубке все еще есть место для большего количества жидкости, заполните остальную часть трубки перфузионным раствором 3. Остановите насос при переходе на другой перфузионный раствор, чтобы избежать введения пузырьков воздуха в трубку.
    8. Поместите излишки трубки в водяную баню при температуре 42 °C, чтобы растворы перфузии оставались теплыми.
    9. Поместите конец насосной трубки в коническую трубку, содержащую перфузионный раствор 3, при этом выдерживая на водяной бане.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для того, чтобы насос непрерывно заполнялся перфузионным раствором 3 во время перфузии.
  2. Подготовка животных
    1. Обезболивают мышь путем введения анестетика коктейля внутрибрюшинно в дозе 10-11,7 мкл/г массы тела. Обезболивающий коктейль имеет конечную концентрацию 7,5 мг/мл кетамина, 0,25 мг/мл ацепромазина и 1,5 мг/мл ксилазина.
    2. Следите за дыханием мыши и убедитесь, что мышь не реагирует на боль. Подождите, пока мышь не будет иметь частоту дыхания ~ 55-65 вдохов в минуту, не реагирует на защемление пальцев ног и имеет вялый хвост. Дополнительно проверьте пальпебральный (мигающий) рефлекс, слегка коснувшись кожи на медиальной стороне закрытого глаза. Если мышь моргает или глазные мышцы дергаются, увеличьте дозу всего обезболивающего коктейля на 5-10 мкл.
    3. Поместите мышь на спину в лежачем положении и прикрепите конечности к поверхности с помощью штифтов или ленты (дополнительный рисунок S1).
    4. Опрыскайте живот 70% этанолом и вытрите его насухо с помощью ватного тампона.
  3. Перфузия печени
    1. Сделайте U-образный боковой разрез в коже живота ножницами и разверните отверстие по бокам.
    2. Продолжайте открывать кожу к грудной клетке.
    3. С помощью ножниц прорежьте брюшину, чтобы обнажить брюшную полость вплоть до грудной клетки, стараясь не проколоть какие-либо органы. Переместите кишечник в правую сторону с помощью задней части щипцов или тупой поверхности ножниц. Определите нижнюю полую вену и воротную вену (дополнительный рисунок S1).
    4. Запустите насос для промывки предварительного перфузионного раствора через катетер.
    5. Остановите насос и извлеките катетер, как только весь воздух будет промыт через систему. Вставьте кончик иглы, соединенной с катетером, в нижнюю полую вену под углом 10°-20° к вене. Извлеките иглу из катетера и осторожно протолкните катетер в вену движением, параллельным вене.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователь должен наблюдать вспышку крови в катетере, чтобы проверить правильность канюляции в вене.
    6. Подключите трубку к катетеру, не перемещая катетер дальше в вену.
    7. Запустите насос со скоростью потока 2 мл/мин. Ищите печень, которая сразу же бледнеет как признак того, что перфузия успешна.
    8. Вырежьте воротную вену ножницами.
    9. Постепенно увеличивайте расход до 5 мл/мин.
    10. Периодически надавливайте на воротную вену в приблизительном месте среза в течение 3 с с помощью щипцов или ватного тампона, чтобы заблокировать дренаж и облегчить хорошую перфузию.
    11. Как только перфузионный раствор 3 протечет насквозь, тщательно контролируйте эластичность печени. Чтобы определить, размягчена ли печень, осторожно надавите на печень ватным тампоном или щипцами и проверьте, образуются ли на печени углубления. Будьте осторожны, чтобы не переплеснуться, чтобы избежать потери жизнеспособности клеток.
    12. Как только печень размягчится (это происходит после того, как 30-50 мл перфузионного раствора 3 протолкнется), остановите насос, удалите катетер и тщательно рассекните печень. Поместите печень в чашку Петри толщиной 100 мм, содержащую холодный DMEM + 10% среды FBS. Иссекайте желчный пузырь, стараясь не пролить его содержимое. Закрутите чашку Петри, чтобы аккуратно удалить возможные сгустки крови.
    13. Переведите печень в новую чашку Петри, содержащую ледяной DMEM + 10% среды FBS.

2. Выделение гепатоцитов

  1. Высвобождение клеток из капсулы печени.
    1. Поместите чашку Петри на лед и, используя две пары стерильных щипцов, аккуратно разорвите капсулу печени на всех долях. Осторожно вращайте печень в среде, используя клеточный лифтер или щипцы, чтобы освободить гепатоциты. Продолжайте это движение до тех пор, пока печень не станет очень маленькой, а суспензия не станет коричневой и непрозрачной.
    2. Извлеките остатки ткани печени из пластины и, используя серологическую пипетку объемом 25 мл, установленную на низкую скорость, осторожно перенесите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 50 мл (предварительно охлажденную на льду), оснащенную клеточным ситечком 100 мкм.
    3. Добавьте свежий, ледяной DMEM + 10% среды FBS в чашку Петри, чтобы промыть и собрать оставшиеся клетки с поверхности и перенести в коническую трубку объемом 50 мл. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока не будут собраны все ячейки.
  2. Промывайте и очищайте гепатоциты от непаренхимальных клеток.
    1. Центрифугирование клеток, собранных в конической трубке объемом 50 мл при 50 × г при 4 °C в течение 5 мин при низком замедлении или без каких-либо тормозов.
    2. Выбросьте супернатант, содержащий мусор и непаренхимальные клетки, и повторно суспендируйте гранулу в оставшемся супернатанте, осторожно закрутив трубку. После того, как гранула будет повторно суспендирована, добавьте 30 мл свежего, ледяного DMEM + 10% среды FBS.
    3. Повторите центрифугирование (этап 2.2.1) и промывку (этап 2.2.3) три раза.
    4. Повторное суспендирование конечной ячейки гранулы в 10 мл ледяного DMEM + 10% среды FBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем среды, используемой для повторного суспендирования гранул, зависит от размера гранул. Если гранула значительно меньше 15 мм, используйте 1-5 мл ледяного DMEM + 10% среды FBS.
  3. Количественная оценка жизнеспособности клеток
    1. В микрофьюжную трубку добавляют 50 мкл 0,4% раствора Трипан Блю к 350 мкл гепатоцитарной гепатоцитарной гальванической среды (ПМ). Затем добавьте 100 мкл клеточной суспензии, чтобы сделать окончательное разбавление 1:5, и пипетку вверх и вниз несколько раз, чтобы перемешать.
    2. Подсчитайте плотность и жизнеспособность клеток с помощью гемоцитометра. Во время подсчета поместите суспензию гепатоцитов на лед, а затем поместите ведро со льдом на орбитальный шейкер, установленный на 30 оборотов в минуту, чтобы гепатоциты не оседали.
    3. Следуйте приведенным ниже этапам лечения и центрифугирования Перколла, если жизнеспособность клеток составляет <70%.
      1. Разбавьте Перколла 10-кратным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) в соотношении 9:1.
      2. Смешайте суспензию гепатоцитов с разбавленным Перколлом в соотношении 1:1.
      3. Центрифуга при 200 × г при 4 °C в течение 10 мин.
      4. Выбросьте супернатант, содержащий мертвые клетки. Повторное суспендирование гранул в ледяной среде DMEM + 10% FBS.
      5. Еще раз подсчитайте ячейки.
  4. Тестирование гепатоцитов на пластинчатость
    1. Обложите некоторые клетки на коллагеновых I-покрытых 6-луночными пластинами при плотности 0,5 × 106 клеток на мл с использованием 1,5 мл предварительно расплавленных ТЧ.
    2. Держите оставшиеся ячейки на льду, находясь на орбитальном шейкере, пока не будете готовы к выполнению электропорации.
    3. Поместите пластину клеток в инкубатор CO2 с водяной рубашкой при 37 С. Осторожно переместите пластину по горизонтали и вертикали с севера на юг и с востока на запад, чтобы обеспечить однородное покрытие. Повторяйте движение еще два раза каждые 1,5 ч.
    4. Проверьте прикрепление ячейки через 3 ч после нанесения покрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не менее 60% клеток должны прилипать к пластинке как показатель хорошего качества гепатоцитов.
    5. Изменяйте среду на доваренную поддерживающую среду гепатоцитов (ММ) через 24 ч после нанесения покрытия для поддержания клеток в культуре.
  5. Окрашивание гликогеном
    1. После того, как клетки прикрепятся к пластинам с 6-луночным коллагеновым покрытием I, удалите отработанную среду из культивируемых клеток.
    2. Зафиксируйте клетки на 10-15 мин в ледяном этаноле.
    3. Тщательно вымойте стерильной водой.
    4. Инкубировать в 1% водной периодической кислоте в течение 5 мин, а затем промыть стерильной водой.
    5. Инкубировать в 100% реагенте Шиффа в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реагент Шиффа не должен быть разбавлен перед добавлением в клетки.
    6. Промыть водой три раза в течение 10 мин.
    7. Монтируйте в монтажную среду.
    8. Изображение с помощью микроскопа на яркой настройке поля.

3. Проектирование sgRNAs для редактирования генов CRISPR-Cas9

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается конструкция sgRNA, нацеленной на ген гидроксифенилпируватдиоксигеназы мыши (Hpd), в качестве доказательства принципиального редактирования генов для нарушения терапевтического гена-мишени, связанного с IMD печени.

  1. Разработайте последовательность направляющих, предназначенных для Hpd , с помощью указанного программного обеспечения15.
  2. Проверьте последовательность для Hpd с помощью браузера генома Ensembl.
  3. Используйте следующие параметры для проектирования гРНК: одинарная направляющая длина 20 нуклеотидов и последовательность протоспейсер-смежных мотивов (PAM) NGG (N может быть любым нуклеотидом).
  4. Выберите целевой регион из экзона 3 в Hpd.
  5. Создайте список направляющих последовательностей из целевой области с оценками on- и Off-Target.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка On-Target указывает на прогнозируемую эффективность целевого редактирования для данного дизайна: более высокий балл коррелирует с более высокой эффективностью редактирования. Off-Target Score коррелирует со спецификой направляющей последовательности: более высокий балл указывает на меньшую вероятность нецелевого редактирования. В идеале оба балла должны быть высокими: оценка в створ >60, а оценка вне цели >50.
  6. Выберите направляющую последовательность с наибольшим количеством баллов On-Target и Off-Target. Химически синтезировать сгРНК, содержащую направляющую последовательность.

4. Электропорация и клеточная культура

  1. Подготовка подложек, сред, ячеек и электропорационного прибора CRISPR-Cas9
    1. Добавьте всю сопутствующую добавку к PM и согрейте на водяной бане при температуре 37 °C в течение 10 минут.
    2. Включите устройство электропорации нажатием кнопки питания и установите программу электропорации, нажав кнопку x , а затем кнопку со стрелкой вниз , пока программа T-028 не появится на экране.
    3. Подготовьте целевые колодцы для электропорированных гепатоцитов, добавив 1,5 мл ТЧ к пластинам с шестилуночным коллагеновым I-покрытием. Инкубируйте пластины в инкубаторе с температурой 37 °C до готовности к использованию.
    4. Добавьте всю сопутствующую добавку в электропорационный буферный раствор и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка срока годности электропорационного буфера на флаконе (3 месяца после даты добавления добавки).
    5. Извлеките сосуды для электропорации из упаковки и нанесите на них этикетку для каждого образца.
    6. В трубках с расщепленной полоской ПЦР готовят комплексы Cas9 RNP, комбинируя 30 мкг сгРНК с 300 пмоль белка Cas9 и инкубируют комплексы при комнатной температуре в течение 10 мин. Получают мРНК Cas9 путем объединения 30 мкг сгРНК с 4 мкл мРНК Cas9 (1 мкг/мкл). Храните смесь мРНК-сгРНК на льду до электропорации. Отдельно подготовьте трубку, содержащую 1,0 мкг мРНК eGFP для проверки успешной электропорации с помощью флуоресцентной микроскопии.
    7. Центрифуга 1,2 × 106 ячеек на реакцию электропорации при 100 × г в течение 2 мин при 4 °С.
    8. Удалите супернатант из гранулы ячейки и добавьте 100 мкл раствора электропорации на реакцию вдоль боковой части стенки трубки. Повторно суспендируйте гепатоциты в растворе электропорации, осторожно раскачивая трубку вручную.
  2. Электропорация CRISPR-Cas9 РНК и мРНК в гепатоциты
    1. Как только гепатоциты окажутся равномерно диспергированными в электропорационном растворе, переместите 100 мкл суспензии гепатоцитов в полосковые трубки, содержащие комплексы Cas9.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте широкопроходные наконечники пипеток при переносе гепатоцитов для сохранения жизнеспособности клеток.
    2. Перенесите содержимое полосы хорошо в электропорационный сосуд.
    3. Поместите сосуд нуклеоветты в прорезь на электропорационном устройстве. Электропорат гепатоцитов нажатием кнопки x . После электропорации подождите, пока на устройстве появится экран с надписью «ОК». Нажмите кнопку x еще раз и извлеките сосуд.
    4. Инкубируйте электропорированное судно на льду в течение 15 минут.
    5. Добавьте 500 мкл предварительно высушенных ТЧ в сосуд для электропорации.
    6. Перенесите 300 мкл реакции электропорации в каждую скважину назначения на предварительно обработанной пластине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На одну реакцию электропорации должно быть две целевые скважины. Одна скважина будет использоваться для количественной оценки эффективности редактирования генов; другая скважина будет использоваться для анализа МТТ и альбумина.
    7. Чтобы предотвратить накопление гепатоцитов в центре лунки, рассеивайте клетки, мягко перемещая пластины горизонтально и вертикально в движении с севера на юг и с востока на запад. Убедитесь, что пластина поддерживает контакт с полкой инкубатора во время ее перемещения. Повторяйте это движение через 15, 30, 45, 60 и 90 мин после покрытия электропорированных гепатоцитов.
    8. Инкубировать пластины в течение ночи при температуре 37 °C.
    9. Удалите среду из скважин, предназначенных для анализа редактирования генов через 24 ч после покрытия клеток, и замените наложением матрицы базальной мембраны 0,25 мг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При хранении в морозильной камере перенесите мембранную матрицу до 4 °C и дайте ей оттаять. Поскольку матрица базальной мембраны является твердой при температуре выше 10 °C, крайне важно, чтобы матрица базальной мембраны оставалась на льду или при 4 °C до тех пор, пока не будет готова к использованию.

5. Рассчитайте объем мембранной матрицы для смешивания с ММ для получения конечной концентрации 0,25 мг/мл

ПРИМЕЧАНИЕ: Для плиты с 6 скважинами на каждую скважину необходимо накладывать 2 мл.

6. Добавьте расчетный объем мембранной матрицы в холодный лед и перемешайте путем пипетирования вверх и вниз 10 раз

  1. Пипетка медленно накладывает смесь поверх клеток и помещает пластину обратно в инкубатор при температуре 37 °C.
  2. Заменяйте среду свежей средой для ухода каждые 24 ч.
  3. Через 24 ч после нанесения покрытия переносят кондиционированную среду из скважины, предназначенной для анализа МТТ и альбумина. Храните кондиционированную среду в микрофьюжной трубке до готовности к выполнению анализа альбумина. Перейдите к шагу 7.1 для анализа MTT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить кондиционированную среду при температуре 4 °C для кратковременного хранения (менее суток). Для более длительного хранения храните носитель при -80 °C.

7. Анализ эффективности доставки, жизнеспособности и целевого редактирования в электропорированных гепатоцитах мышей

  1. Измерение жизнеспособности с помощью анализа MTT
    1. Приготовьте 12 мМ раствора МТТ, добавив 1 мл PBS в один флакон МТТ 5 мг.
    2. Добавить в скважины 150 мкл раствора МТТ и инкубировать в течение 24 ч.
    3. После инкубации добавьте 1,5 мл раствора додецилсульфата-гидрохлорида натрия (SDS-HCl) в каждую лунку, а затем пипетку для смешивания.
    4. Инкубируют пластину в течение 4 ч при 37 °C и ищите изменение цвета среды от прозрачного до фиолетового, чтобы указать на жизнеспособные клетки.
    5. Снова перемешайте каждый образец с помощью пипетки и считайте поглощение при 570 нм с помощью считывателя микропластин.
    6. Рассчитайте нормированную жизнеспособность образцов, обработанных Cas9, используя Eq (1):
      figure-protocol-18538 (1)
  2. Анализ альбумина для оценки функциональности гепатоцитов
    1. Перенесите 50 мкл кондиционированной среды в скважины в пластине, предусмотренной альбуминовым набором. Накрыть колодцы и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
    2. Промывайте колодцы 5x с 200 мкл промывочного буфера.
    3. Переверните пластину, чтобы опорожнить каждую лунку на папиросной бумаге и постучите несколько раз.
    4. После промывки добавляют 50 мкл биотинилированного антитела, содержащегося в наборе для анализа альбумина, в каждую лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч.
    5. Повторите шаги 5.2.2-5.2.3 для промывки колодцев.
    6. Добавьте в каждую лунку 50 мкл стрептавидин-пероксидазы, содержащейся в наборе для анализа альбумина, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 мин.
    7. Повторите шаг 5.2.2.
    8. Добавьте 50 мкл субстрата хромогена, предусмотренного в наборе для анализа альбумина на лунку, и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре. Осторожно постучите по тарелке, чтобы обеспечить равномерное перемешивание. Удалите все пузырьки воздуха с помощью наконечника пипетки.
    9. Наконец, добавьте 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку и найдите изменение цвета с желтого на синий, чтобы указать на функциональные клетки.
    10. Немедленно приступайте к считыванию поглощения при 450 нм с помощью микропластичного считывателя.
  3. Оценить эффективность доставки в скважинах, электропорированных мРНК eGFP.
    1. Захват фазового контраста и зеленых флуоресцентных изображений гепатоцитов через 24 ч после электропорации. Сделайте три снимка в разных местах колодца.
    2. Загрузите изображения ячеек в ImageJ. На вкладке Изображение выберите Введите | 16-бит , чтобы преобразовать изображение в оттенки серого.
    3. Чтобы выделить структуры ячеек на изображении, на вкладке Изображение выберите Настроить | Порог. Отрегулируйте ползунок, чтобы выделить ячейки.
    4. На вкладке Процесс выберите Вычесть фон , чтобы удалить фоновый шум.
    5. Подсчитайте ячейки, щелкнув вкладку Анализ , а затем выберите Анализ частиц. Нажмите кнопку ОК , чтобы создать список подсчитанных частиц.
    6. Рассчитайте процент GFP-положительных клеток, разделив количество подсчитанных частиц на зеленых флуоресцентных изображениях на количество подсчитанных частиц в соответствующем фазоконтрастном изображении.
  4. Анализ целевой активности Cas9
    1. Извлечение геномной ДНК из электропорированных клеток.
      1. Удалить среду из пластины через 3 дня после электропорации и добавить 500 мкл 0,25% трипсина. Инкубировать при 37 °C в течение 5 мин. Пипетка несколько раз после инкубации, чтобы гепатоциты отделились от пластины.
      2. Переложите трипсинизированную клеточную суспензию в микроцентрифужные трубки и вращайте в настольной центрифуге при 800 × г в течение 10 мин при комнатной температуре. После прядения осмотрите трубки на наличие гранул.
      3. Удалите супернатант, содержащий трипсин, путем пипетирования. Следите за тем, чтобы не потревожить гранулу. Повторно суспендировать гранулу в 80 мкл экстракционного раствора ДНК. Если гранулу трудно увидеть, повторно суспендируют содержание пробирки в 50 мкл раствора для экстракции ДНК.
      4. Вихрь в течение 30 с, чтобы обеспечить повторное суспендирование гранул. Перенесите суспензию в трубки с разделенной полосой ПЦР и поместите их в термоциклер. Выдерживайте в течение 15 мин при 95 °C и 8 мин при 68 °C.
    2. ПЦР-амплифицируют целевой локус.
    3. Следуйте описанной ниже процедуре для амплификации области Hpd на мишени с использованием ДНК-полимеразы.
      1. Готовят реакцию, содержащую 0,5 мкл 10 мМ дНТП, 0,5 мкл 10 мкМ прямого праймера, 0,5 мкл обратного праймера 10 мкМ, 0,125 мкл полимеразы Taq, 5 мкл геномной ДНК, извлеченной из гепатоцитов, и 18,375 мкл свободной нуклеазы воды. Последовательности праймеров см. в дополнительной таблице S1 .
      2. Кратковременно вихре и быстро центрифугируйте смесь ПЦР, чтобы убедиться, что раствор находится в нижней части трубки.
      3. Поместите ПЦР-смесь в термоциклер и усиливайте в следующих условиях: 94 °C в течение 30 с для денатурации, 30 циклов 94 °C в течение 30 с, 57 °C в течение 45 с для отжига, 68 °C в течение 1 мин и окончательное продление 68 °C в течение 5 мин.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Температура отжига для реакции ПЦР будет варьироваться в зависимости от состава праймеров. Рассмотрите возможность использования калькулятора температуры плавления перед выполнением ПЦР.
      4. Чтобы подтвердить правильный размер продукта, смешайте 3 мкл продуктов ПЦР с 2 мкл воды и 1 мкл 6-кратного красителя. Нанесите 1,5% агарозный гель и подтвердите правильный размер продукта.
    4. Очистите ДНК с помощью магнитных шариков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Спиновые колонки также могут использоваться для очистки ПЦР. Ниже приведены процедуры очистки продуктов ПЦР с помощью магнитных шариков.
      1. Снимите магнитные шарики с температуры 4 °C и дайте им достичь комнатной температуры.
      2. Кратковременно вихрьте и быстро центрифугируйте смесь ПЦР.
      3. Добавьте объем бусин, равный 1,8× объем ПЦР-смеси. Пипетка ПЦР-шарик смешивается 10x, чтобы убедиться, что раствор равномерно перемешивается.
      4. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
      5. Переложите смесь PCR-шариков на ПЦР-пластину и поместите ее на магнитную пластину.
      6. Инкубируйте пластину на магните в течение 5 мин. Через 5 мин проверьте, что раствор прозрачный, а шарики привязаны к магниту, прежде чем переходить к следующему шагу.
      7. Выбросьте супернатант.
      8. Добавьте в лунку 200 мкл 70% этанола и инкубируйте в течение 30 с.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 70% этанол должен быть приготовлен незадолго до выполнения очистки, чтобы предотвратить потерю ДНК.
      9. Отбросьте супернатант и повторите шаг 7.4.4.8.
      10. Вынуть супернатант и дать высохнуть в течение 3 мин при комнатной температуре, чтобы удалить следы этанола.
      11. Снимите пластину с магнита и добавьте в образец 22 мкл воды. Пипетка вверх и вниз 10x для смешивания воды и бисера.
      12. Инкубировать образцы в течение 3 мин при комнатной температуре.
      13. Переложите пластину обратно на магнит и инкубируйте в течение 3 мин или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
      14. Перенесите 20 мкл образца в ПЦР-трубку. Позаботьтесь о том, чтобы бусины не переносились.
    5. Последовательность очищенного ампликона ДНК методом секвенирования Сэнгера.
    6. Загрузите файлы последовательностей .ab1 для обработанных и контрольных (необработанных) образцов в Tracking of indels by Decomposition (TIDE)16 для количественной оценки indels на целевом сайте.

Результаты

Выделение пластинчатых первичных гепатоцитов из печени
Общий процесс перфузии печени и выделения гепатоцитов проиллюстрирован на рисунке 1. В этом эксперименте использовались мыши дикого типа, 8-10-недельные мыши C57BL6/6J. Ожидается, что процедура даст 20-50 × 106<...

Обсуждение

Шаги, изложенные в протоколе для выделения гепатоцитов, являются сложными и требуют практики для мастерства. Существует несколько ключевых шагов для успешного выделения гепатоцитов из печени. Во-первых, правильная канюляция нижней полой вены необходима для полной перфузии печени. Отс...

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих интересов для раскрытия.

Благодарности

RNC получил финансирование от Центра биоинженерии Южной Каролины по регенерации и формированию тканей Пилотный грант, поддержанный Национальным институтом общих медицинских наук (NIGMS) Национальных институтов здравоохранения, Американской ассоциацией по изучению заболеваний печени и Американским обществом генной и клеточной терапии под номерами гранта P30 GM131959, 2021000920, и 2022000099, соответственно. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Американского общества генной и клеточной терапии или Американской ассоциации по изучению заболеваний печени. Схема для рисунка 1 была создана с помощью BioRender.com.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, naturalUSA Scientific1402-4700
6-well Collagen PlatesAdvanced Biomatrix5073
accuSpin Micro 17RFisher Scientific13-100-675
All-in-one Fluorescent MicroscopeKeyenceBZ-X810
Analog Vortex MixerVWR97043-562
ART Wide BORE filtered tips 1,000 µLThermoFisher Scientific2079GPK
Automated Cell CounterBio-Rad LaboratoriesTC20
Blue Wax Dissection TrayBraintree Scientific Inc.DTW19" x 6.5" x 1/2"+F21
Cell scraper/lifterArgos TechnologiesUX-04396-53Non-pyrogenic, sterile
Conical tubes (15 mL)Fisher Scientific339650
Conical tubes (50 mL)Fisher Scientific14-432-22
Cotton applicatorsFisher Scientific22-363-170
Curved scissorsCooper Surgical62131
Disposable Petri DishesFalcon351029100mm,sterile
Disposable Petri DishesVWR25373-10035mm, sterile
Epoch Microplate SpectrophotometerBioTek Instruments250082
Falcon Cell strainer (70 µm)Fisher Scientific08-771-2
ForcepsCooper Surgical61864Euro-Med Adson Tissue Forceps
IV catheters BD38261224 G x 0.75 in
IV infusion setBaxter2C6401
MyFuge 12 Mini CentrifugeBenchmark Scientific1220P38
NeedlesFisher Scientific05-561-2025 G
Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes
Peristaltic PumpMasterflex HV-77120-4210 to 60 rpm; 90 to 260 VAC
Precision pump tubingMasterflexHV-96410-1425 ft, silicone
Primaria Culture PlatesCorning Life Sciences353846Nitrogen-containing tissue culture plates
Serological Pipets (25 mL)Fisher Scientific12-567-604
SyringesBD3294641 mL, sterile
T100 Thermal CyclerBio-Rad Laboratories1861096
Water bathALT27577Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3IDT1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mLFisher ScientificNC9959336
CleanCap Cas9 mRNATrilink BiotechnologiesL-7606-100
CleanCap EGFP mRNATrilink BiotechnologiesL-7201-100
Corning Matrigel MatrixCorning Life Sciences356234
DMEMThermoFisher Scientific11885076Low glucose, pyruvate
Ethanol 70%VWR71001-652
Fetal bovine serumThermoscientific26140-079
Hepatocyte Maintenance Medium (MM)LonzaMM250
Hepatocyte Plating Medium (PM)LonzaMP100
Mouse Albumin ELISA KitFisher ScientificNC0010653
Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector KitLonzaVPL-1004
OneTaq HotStart DNA PolymeraseNew England BiolabsM0481L
PBS 10x pH 7.4 Thermoscientific70011-044No calcium or magnesium chloride
Percoll (PVP solution)Santa Cruz Biotechnologysc-500790A
Periodic acidSigma-AldrichP7875-25G
Permount Mounting MediumVWR100496-550
QuickExtract DNA Extraction SolutionLucigen CorporationQE05090
Schiff’s fuchsin-sulfite reagentSigma-AldrichS5133
Trypsin-EDTA (0.25%)ThermoFisher Scientific25200056Phenol red
Vybrant MTT Cell Viability AssayThermoFisher ScientificV13154
Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) Stable at 4 °C for 2 months
EBSSFisher Scientific14155063Complete to 200 mL
EGTA (0.5 M)Bioworld40520008-1200 µL
HEPES (pH 7.3, 1 M)ThermoFisher ScientificAAJ16924AE2 mL 
Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) Stable at 4 °C for 2 months
CaCl2·2H20 (1.8 mM)SigmaC7902-500G360 µL of 1 M stock 
EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)Fisher Scientific14-155-063Complete to 200 mL
HEPES (1 M)ThermoFisher ScientificAAJ16924AE2 mL 
MgSO4·7H20 (0.8 mM)Sigma30391-25G160 µL of 1 M stock
Perfusion Solution 3 Prepared fresh prior to use
Solution 250 mL
LiberaseRoche54011270010.094 Wunsch units/mL
Mouse Anesthetic Cocktail 
Acepromzine0.25 mg/mL final concentration
Ketamine7.5 mg/mL final concentration
Xylazine1.5 mg/mL final concentration
SoftwareURL
Benchlinghttps://www.benchling.com/
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Tracking of Indels by Decompositionhttps://tide.nki.nl/

Ссылки

  1. Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
  2. Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).
  3. Arnon, R., et al. Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience. Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).
  4. Maiorana, A., et al. Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia. Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).
  5. . OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx (2019)
  6. Fabris, L., Strazzabosco, M. Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities. Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).
  7. Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).
  8. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  9. Lima, A., Maddalo, D. SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research. Frontiers in Oncology. 11, 1117 (2021).
  10. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  11. Ye, L., et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).
  12. Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
  13. Hoban, M. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells. Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).
  14. Rathbone, T., et al. Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes. The CRISPR Journal. , (2022).
  15. . Benchling [Biology Software] Available from: https://benchling.com (2022)
  16. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
  17. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
  18. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).
  19. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  20. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
  21. Kim, Y., et al. Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure. Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).
  22. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  23. Lattanzi, A., et al. Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements. Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).
  24. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
  25. Grompe, M., Tanguay, R. M. . Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. , 215-230 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены