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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive le tecniche per isolare gli epatociti primari di topo dal fegato e l'elettroporazione di CRISPR-Cas9 come ribonucleoproteine e mRNA per interrompere un gene bersaglio terapeutico associato a una malattia metabolica ereditaria del fegato. I metodi descritti determinano un'elevata vitalità e alti livelli di modificazione genica dopo l'elettroporazione.

Abstract

Questo protocollo descrive un metodo rapido ed efficace per isolare gli epatociti primari del topo seguito dalla somministrazione mediata dall'elettroporazione di CRISPR-Cas9 come ribonucleoproteine (RNP) e mRNA. Gli epatociti primari di topo sono stati isolati utilizzando un metodo di perfusione retrograda in tre fasi con conseguenti rese elevate fino a 50 × 106 cellule per fegato e vitalità cellulare di >85%. Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per la placcatura, la colorazione e la coltura degli epatociti. I risultati indicano che l'elettroporazione fornisce un'elevata efficienza di trasfezione dell'89%, misurata dalla percentuale di cellule positive alla proteina fluorescente verde (GFP) e dalla modesta vitalità cellulare di >35% negli epatociti di topo.

Per dimostrare l'utilità di questo approccio, CRISPR-Cas9 mirato al gene dell'idrossifenilpiruvato diossigenasi è stato elettroporato in epatociti primari di topo come modifica genetica proof-of-principle per interrompere un gene terapeutico correlato a una malattia metabolica ereditaria (IMD) del fegato. Un editing on-target più elevato del 78% è stato osservato per gli RNP rispetto al 47% di efficienza di editing con mRNA. La funzionalità degli epatociti è stata valutata in vitro utilizzando un test dell'albumina che ha indicato che la somministrazione di CRISPR-Cas9 come RNP e mRNA si traduce in una vitalità cellulare comparabile negli epatociti primari di topo. Un'applicazione promettente per questo protocollo è la generazione di modelli murini per le malattie genetiche umane che colpiscono il fegato.

Introduzione

Le IMD del fegato sono malattie genetiche caratterizzate dalla carenza di un enzima epatico cruciale coinvolto nel metabolismo che porta all'accumulo di metaboliti tossici. Senza trattamento, le IMD del fegato provocano insufficienza d'organo o morte prematura 1,2. L'unica opzione curativa per i pazienti con IMD del fegato è il trapianto di fegato ortotopico, che è limitato a causa della scarsa disponibilità di organi donatori e delle complicanze della terapia immunosoppressiva a seguito della procedura 3,4. Secondo i recenti dati raccolti dall'Organ Procurement and Transplantation Network, solo il 40%-46% dei pazienti adulti in lista d'attesa per il trapianto di fegato riceve un organo, mentre il 12,3% di questi pazienti muore mentre è in lista d'attesa5. Inoltre, solo il 5% di tutte le malattie rare del fegato ha un trattamento approvato dalla FDA6. È chiaro che c'è un bisogno critico di nuovi trattamenti per gli IMD del fegato. Tuttavia, sono necessari modelli di malattia appropriati per sviluppare nuove opzioni terapeutiche.

La modellazione delle malattie umane utilizzando sistemi in vitro e in vivo rimane un ostacolo per lo sviluppo di terapie efficaci e lo studio della patologia delle IMD del fegato. Gli epatociti provenienti da pazienti con malattie rare del fegato sono difficili da ottenere7. I modelli animali sono cruciali per sviluppare una comprensione della patologia della malattia e per testare strategie terapeutiche. Tuttavia, un ostacolo è la generazione di modelli da embrioni portatori di mutazioni letali. Ad esempio, i tentativi di creare modelli murini della sindrome di Alagille (ALGS) con embrioni contenenti delezioni omozigoti di una sequenza di 5 kb vicino alla fine 5′-end del gene Jag1 hanno provocato la morte precoce degli embrioni8. Inoltre, la generazione di modelli murini mediante modifica genetica in cellule staminali embrionali può richiedere molto tempo e risorse9. Infine, le mutazioni appariranno al di fuori del tessuto bersaglio, portando a variabili confondenti che possono impedire lo studio della malattia9. L'editing genetico somatico consentirebbe una modifica più semplice nel tessuto epatico e bypasserebbe le sfide associate alla generazione di modelli che utilizzano cellule staminali embrionali.

L'elettroporazione consente la consegna di CRISPR-Cas9 direttamente nel nucleo applicando correnti ad alta tensione per permeabilizzare la membrana cellulare ed è compatibile con molti tipi di cellule, comprese quelle che sono intransigenti alle tecniche di trasfezione, come le cellule staminali embrionali umane, le cellule staminali pluripotenti e i neuroni 10,11,12 . Tuttavia, la bassa redditività è un potenziale svantaggio dell'elettroporazione; l'ottimizzazione della procedura può produrre alti livelli di consegna limitando la tossicità13. Un recente studio dimostra la fattibilità dell'elettroporazione dei componenti CRISPR-Cas9 in epatociti primari di topo e umani come approccio altamente efficiente14. L'elettroporazione ex vivo negli epatociti ha il potenziale per essere applicata per generare nuovi modelli murini per imD umani del fegato.

Questo protocollo fornisce una procedura dettagliata passo-passo per isolare gli epatociti di topo dal fegato e successivamente elettroporare CRISPR-Cas9 come complessi RNP, costituiti da proteina Cas9 e RNA sintetico a guida singola (sgRNA), o mRNA Cas9 combinato con sgRNA per ottenere alti livelli di editing genico on-target. Inoltre, il protocollo fornisce metodi per quantificare l'efficienza, la vitalità e la funzionalità dell'editing genetico dopo l'elettroporazione di CRISPR-Cas9 in epatociti di topo appena isolati.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati tutti eseguiti in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e i protocolli approvati presso la Clemson University. Le procedure chirurgiche sono state eseguite in topi C57BL / 6J di tipo selvatico anestetizzati tra le 8 e le 10 settimane di età.

1. Chirurgia animale

  1. Preparazione di soluzioni e strumenti
    NOTA: Le soluzioni di perfusione e le ricette dei cocktail per anestesia sono mostrate nella Tabella dei materiali.
    1. Preparare la soluzione di perfusione 1 (HEPES, EGTA ed EBSS), la soluzione di perfusione 2 (HEPES, EGTA, EBSS, CaCl2 e MgSO4) e la soluzione di perfusione 3 (soluzione 2 e liberasi). Assicurati che le soluzioni siano ben miscelate.
    2. Impostare il bagno d'acqua a 42 °C e le soluzioni di perfusione pre-riscaldamento 1, 2 e 3 per un minimo di 30 minuti prima di iniziare la procedura e tenerle a bagnomaria.
      NOTA: Le soluzioni di perfusione 1 e 2 chelano il calcio e scovano il sangue nel fegato. Perfusion Solution 3 contiene l'enzima digestivo liberasi per dissociare la matrice extracellulare.
    3. Posizionare 150 ml di DMEM + 10% di siero bovino fetale (FBS) in tubi conici e tenerli sul ghiaccio.
      NOTA: Questo mezzo verrà utilizzato per rilasciare le cellule dalla capsula epatica e lavare gli epatociti isolati nei passaggi 2.1 e 2.2, rispettivamente.
    4. Impostare la centrifuga a 4 °C.
    5. Sterilizzare il tubo della pompa posizionando entrambe le estremità del tubo in un pallone riempito con etanolo al 70% e riciclando l'etanolo tre volte.
    6. Lavare il tubo con acqua distillata e svuotarlo.
    7. Riempire il tubo con 30 mL preriscaldati di Soluzione di Perfusione 1, seguiti da 8 mL di Soluzione di Perfusione 2. Se il tubo ha ancora spazio per più fluidi, riempire il resto del tubo con Perfusion Solution 3. Arrestare la pompa quando si passa a una soluzione di perfusione diversa per evitare di introdurre bolle d'aria nel tubo.
    8. Posizionare il tubo in eccesso nel bagno d'acqua a 42 °C per mantenere calde le soluzioni di perfusione.
    9. Posizionare l'estremità del tubo della pompa nel tubo conico contenente la soluzione di perfusione 3, mantenendo a bagnomaria.
      NOTA: questo passaggio è necessario per consentire alla pompa di riempirsi continuamente con la soluzione di perfusione 3 durante la perfusione.
  2. Preparazione animale
    1. Anestetizzare il topo iniettando il cocktail anestetico per via intraperitoneale alla dose di 10-11,7 μL/g di peso corporeo. Il cocktail anestetico ha una concentrazione finale di 7,5 mg/mL di ketamina, 0,25 mg/mL di acepromazina e 1,5 mg/mL di xilazina.
    2. Monitorare la respirazione del mouse e verificare che il mouse non stia reagendo al dolore. Attendere fino a quando il topo ha una frequenza respiratoria di ~ 55-65 respiri al minuto, non risponde alle dita dei piedi pizzicate e ha una coda flaccida. Inoltre, controllare il riflesso palpebrale (lampeggiante) toccando leggermente la pelle sul lato mediale dell'occhio chiuso. Se il topo lampeggia o i muscoli oculari si contraggono, aumentare la dose dell'intero cocktail anestetico di 5-10 μL.
    3. Posizionare il mouse sulla schiena in posizione supina e fissare gli arti alla superficie con perni o nastro adesivo (Figura supplementare S1).
    4. Spruzzare l'addome con etanolo al 70% e asciugarlo con un batuffolo di cotone.
  3. Perfusione epatica
    1. Fai un'incisione laterale a forma di U nella pelle dell'addome usando le forbici ed espandi il foro attraverso i lati.
    2. Continuare ad aprire la pelle alla gabbia toracica.
    3. Usando le forbici, tagliare il peritoneo per esporre la cavità addominale fino alla gabbia toracica, facendo attenzione a non colpire alcun organo. Spostare l'intestino sul lato destro usando il retro della pinza o la superficie smussata delle forbici. Identificare la vena cava inferiore e la vena porta (Figura supplementare S1).
    4. Avviare la pompa per lavare la soluzione di perfusione preriscaldata attraverso il catetere.
    5. Arrestare la pompa e rimuovere il catetere una volta che tutta l'aria è stata scaricata attraverso il sistema. Inserire la punta dell'ago collegato al catetere nella vena cava inferiore con un angolo di 10°-20° rispetto alla vena. Rimuovere l'ago dal catetere e spingere delicatamente il catetere nella vena in un movimento parallelo alla vena.
      NOTA: L'utente deve osservare il flashback del sangue nel catetere per verificare la corretta cannulazione nella vena.
    6. Collegare il tubo al catetere senza spostare ulteriormente il catetere nella vena.
    7. Avviare la pompa con una portata di 2 ml/min. Cerca il fegato che diventa immediatamente pallido come segno che la perfusione ha successo.
    8. Tagliare la vena porta usando le forbici.
    9. Aumentare gradualmente la portata a 5 ml/min.
    10. Applicare periodicamente una pressione sulla vena porta nel sito di taglio approssimativo per 3 s usando una pinza o un batuffolo di cotone per bloccare il drenaggio e facilitare una buona perfusione.
    11. Una volta che la soluzione di perfusione 3 sta scorrendo, monitorare attentamente l'elasticità del fegato. Per determinare se il fegato è ammorbidito, premere delicatamente il fegato con un batuffolo di cotone o una pinza e verificare se si formano rientranze sul fegato. Fare attenzione a non perfornare eccessivamente per evitare la perdita di vitalità cellulare.
    12. Una volta che il fegato è ammorbidito (che si verifica dopo 30-50 ml di soluzione di perfusione 3 è fluito attraverso), interrompere la pompa, rimuovere il catetere e sezionare attentamente il fegato. Posizionare il fegato in una capsula di Petri da 100 mm contenente DMEM ghiacciato + 10% FBS medio. Accisciare la cistifellea, facendo attenzione a non versare il suo contenuto. Ruotare la capsula di Petri per rimuovere delicatamente eventuali coaguli di sangue.
    13. Trasferire il fegato in una nuova capsula di Petri contenente DMEM ghiacciato + 10% FBS medio.

2. Isolamento degli epatociti

  1. Rilasciare le cellule dalla capsula del fegato.
    1. Mettere la capsula di Petri sul ghiaccio e usando due paia di pinze sterili, strappare delicatamente la capsula epatica su tutti i lobi. Ruotare delicatamente il fegato nel mezzo usando un sollevatore cellulare o una pinza per rilasciare gli epatociti. Continuare questo movimento fino a quando il fegato diventa molto piccolo e la sospensione diventa marrone e opaca.
    2. Rimuovere i resti del tessuto epatico dalla piastra e utilizzando una pipetta sierologica da 25 mL impostata a bassa velocità, trasferire con cura la sospensione cellulare su un tubo conico da 50 mL (prechilled su ghiaccio) dotato di un filtro cellulare da 100 μm.
    3. Aggiungere il mezzo DMEM fresco e ghiacciato + 10% FBS alla capsula di Petri per lavare e raccogliere le cellule rimanenti dalla superficie e trasferirle nel tubo conico da 50 ml. Ripetere questo passaggio fino a quando non vengono raccolte tutte le celle.
  2. Lavare e purificare gli epatociti dalle cellule non parenchimali.
    1. Centrifugare le celle raccolte nel tubo conico da 50 ml a 50 × g a 4 °C per 5 minuti a bassa decelerazione o senza freni.
    2. Scartare il surnatante contenente detriti e cellule non parenchimali e risospese il pellet nel surnatante rimanente facendo roteare delicatamente il tubo. Dopo che il pellet è stato risospeso, aggiungere 30 ml di DMEM fresco e ghiacciato + 10% FBS medio.
    3. Ripetere la centrifugazione (punto 2.2.1) e il lavaggio (punto 2.2.3) tre volte.
    4. Risospesso il pellet finale della cella in 10 ml di DMEM ghiacciato + 10% di mezzo FBS.
      NOTA: Il volume del mezzo utilizzato per risospesare il pellet dipende dalla dimensione del pellet. Se il pellet è considerevolmente più piccolo di 15 mm, utilizzare 1-5 ml di DMEM ghiacciato + 10% FBS medio.
  3. Quantificazione della vitalità cellulare
    1. In un tubo di microfuga, aggiungere 50 μL di soluzione di Trypan Blue allo 0,4% a 350 μL di Hepatocyte Plating Medium (PM). Quindi, aggiungere 100 μL di sospensione cellulare per effettuare una diluizione finale 1:5 e pipettare su e giù più volte per mescolare.
    2. Contare la densità e la vitalità cellulare usando un emocitometro. Durante il conteggio, posizionare la sospensione degli epatociti sul ghiaccio, quindi posizionare il secchiello del ghiaccio su uno shaker orbitale impostato a 30 giri / min per impedire agli epatociti di depositarsi.
    3. Seguire le fasi di trattamento e centrifugazione di Percoll riportate di seguito se la vitalità cellulare è <70%.
      1. Diluire Percoll con 10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in un rapporto 9:1.
      2. Mescolare la sospensione epatocitaria con il Percoll diluito in un rapporto 1:1.
      3. Centrifugare a 200 × g a 4 °C per 10 min.
      4. Scartare il surnatante contenente cellule morte. Risospese il pellet in DMEM ghiacciato + 10% FBS medium.
      5. Conta di nuovo le celle.
  4. Test degli epatociti per la piastriabilità
    1. Placcare alcune delle cellule su piastre a 6 pozzetti rivestite di collagene I ad una densità di 0,5 × 106 cellule per ml usando 1,5 ml di PM preriscaldato.
    2. Mantenere le celle rimanenti sul ghiaccio mentre si è su uno shaker orbitale fino a quando non sono pronte per eseguire l'elettroporazione.
    3. Posizionare la piastra di celle in un incubatore a CO2 rivestito d'acqua a 37 C. Spostare la piastra orizzontalmente e verticalmente delicatamente in un movimento da nord a sud e da est a ovest per garantire una placcatura omogenea. Ripetere il movimento altre due volte ogni 1,5 ore.
    4. Verificare l'attacco della cella a 3 ore dopo la placcatura.
      NOTA: Almeno il 60% delle cellule deve aderire alla piastra come indicatore di epatociti di buona qualità.
    5. Cambiare il mezzo in mezzo di mantenimento degli epatociti preriscaldato (MM) a 24 ore dopo la placcatura per mantenere le cellule in coltura.
  5. Colorazione del glicogeno
    1. Dopo che le cellule si sono attaccate alle piastre rivestite di collagene a 6 pozzetti, rimuovere il mezzo speso dalle cellule coltivate.
    2. Fissare le celle per 10-15 minuti in etanolo ghiacciato.
    3. Lavare accuratamente con acqua sterile.
    4. Incubare in acido periodico acquoso all'1% per 5 minuti e quindi lavare con acqua sterile.
    5. Incubare in 100% Schiff Reagent per 30 min.
      NOTA: il reagente Schiff non deve essere diluito prima di essere aggiunto alle cellule.
    6. Lavare con acqua tre volte oltre 10 min.
    7. Montare nel mezzo di montaggio.
    8. Immagine utilizzando un microscopio su impostazione a campo luminoso.

3. Progettare sgRNA per l'editing genetico CRISPR-Cas9

NOTA: Questa sezione descrive la progettazione di un sgRNA mirato al gene dell'idrossifenilpiruvato diossigenasi (Hpd) del topo come modifica genetica proof-of-principle per interrompere un gene bersaglio terapeutico correlato a un IMD del fegato.

  1. Progettare la sequenza guida destinata all'Hpd utilizzando il software di riferimento15.
  2. Verificare la sequenza per Hpd con Ensembl Genome Browser.
  3. Utilizzare i seguenti parametri per progettare il gRNA: lunghezza di guida singola di 20 nucleotidi e una sequenza di protospacer-adjacent motif (PAM) NGG (N può essere qualsiasi nucleotide).
  4. Selezionare un'area di destinazione da exon 3 nell'Hpd.
  5. Genera un elenco di sequenze guida dalla regione di destinazione con punteggi On- e Off-Target.
    NOTA: il punteggio On-Target indica l'efficienza di editing prevista per il progetto specificato: un punteggio più alto è correlato a una maggiore efficienza di editing. Il punteggio Off-Target è correlato alla specificità della sequenza guida: un punteggio più alto indica una minore probabilità di editing off-target. Idealmente entrambi i punteggi dovrebbero essere alti: il punteggio On-Target >60 e il punteggio Off-Target >50.
  6. Selezionate la sequenza guida con i punteggi On-Target e Off-Target più alti. Avere l'sgRNA contenente la sequenza guida sintetizzato chimicamente.

4. Elettroporazione e coltura cellulare

  1. Preparazione di substrati, fluidi, celle e strumento di elettroporazione CRISPR-Cas9
    1. Aggiungere l'intero supplemento di accompagnamento al PM e riscaldare a bagnomaria a 37 °C per 10 minuti.
    2. Accendere il dispositivo di elettroporazione premendo il pulsante di accensione e impostare il programma di elettroporazione premendo il pulsante x e quindi il pulsante freccia giù fino a quando il programma T-028 appare sullo schermo.
    3. Preparare i pozzetti di destinazione per gli epatociti elettroporati aggiungendo 1,5 ml di PM a piastre rivestite di collagene a sei pozzetti rivestite con I. Incubare le piastre in un incubatore a 37 °C fino al momento dell'uso.
    4. Aggiungere l'intero integratore di accompagnamento alla soluzione tampone di elettroporazione e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
      NOTA: Etichettare la data di scadenza del tampone elettroporatorio sul flaconcino (3 mesi dopo la data di aggiunta del supplemento).
    5. Rimuovere i recipienti di elettroporazione dalla confezione ed etichettarli per ciascun campione.
    6. Nei tubi a strisce divise PCR, preparare i complessi RNP Cas9 combinando 30 μg di sgRNA con 300 pmol di proteina Cas9 e incubare i complessi a temperatura ambiente per 10 min. Preparare l'mRNA Cas9 combinando 30 μg di sgRNA con 4 μL di mRNA Cas9 (1 μg/μL). Conservare la miscela mRNA-sgRNA su ghiaccio fino all'elettroporazione. Preparare separatamente un tubo contenente 1,0 μg di mRNA eGFP per verificare il successo dell'elettroporazione utilizzando la microscopia a fluorescenza.
    7. Centrifuga 1.2 × 106 celle per reazione di elettroporazione a 100 × g per 2 min a 4 °C.
    8. Rimuovere il surnatante dal pellet di cella e aggiungere 100 μL di soluzione elettroporatoria per reazione lungo il lato della parete del tubo. Risospesso gli epatociti nella soluzione di elettroporazione facendo oscillare delicatamente il tubo a mano.
  2. Elettroporazione di RNP CRISPR-Cas9 e mRNA in epatociti
    1. Una volta che gli epatociti appaiono uniformemente dispersi nella soluzione di elettroporazione, trasferire 100 μL della sospensione epatocitaria alle tube contenenti i complessi Cas9.
      NOTA: utilizzare punte di pipetta a foro largo durante il trasferimento degli epatociti per preservare la vitalità cellulare.
    2. Trasferire bene il contenuto della striscia in un recipiente di elettroporazione.
    3. Posizionare il recipiente nucleovette nella fessura del dispositivo di elettroporazione. Elettroporare gli epatociti premendo il pulsante x . Dopo l'elettroporazione, attendi che sul dispositivo venga visualizzata una schermata che dice OK. Premere nuovamente il pulsante x e rimuovere la nave.
    4. Incubare il recipiente elettroporato sul ghiaccio per 15 min.
    5. Aggiungere 500 μL di PM preriscaldato al recipiente di elettroporazione.
    6. Trasferire 300 μL della reazione di elettroporazione a ciascun pozzo di destinazione sulla piastra preriscaldata.
      NOTA: Ci dovrebbero essere due pozzi di destinazione per reazione di elettroporazione. Un pozzo sarà utilizzato per quantificare l'efficienza dell'editing genetico; l'altro pozzo sarà utilizzato per i saggi MTT e albumina.
    7. Per evitare che gli epatociti si accumulino al centro del pozzo, disperdere le cellule muovendo delicatamente le placche orizzontalmente e verticalmente in un movimento da nord a sud e da est a ovest. Assicurarsi che la piastra mantenga il contatto con lo scaffale dell'incubatore mentre viene spostato. Ripeti questo movimento a 15, 30, 45, 60 e 90 minuti dopo aver placcato gli epatociti elettroporati.
    8. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C.
    9. Rimuovere il mezzo dai pozzetti designati per l'analisi di editing genico 24 ore dopo la placcatura delle cellule e sostituirlo con una sovrapposizione della matrice della membrana basale da 0,25 mg / mL.
      NOTA: Se conservato nel congelatore, trasferire la matrice di membrana a 4 °C e lasciarla scongelare. Poiché la matrice della membrana basale è solida al di sopra di 10 °C, è fondamentale che la matrice della membrana basale rimanga sul ghiaccio o a 4 °C fino al momento dell'uso.

5. Calcolare il volume della matrice di membrana da miscelare con MM per ottenere una concentrazione finale di 0,25 mg/mL

NOTA: per una piastra a 6 pozzetti, sono necessari 2 ml di sovrapposizione per pozzetto.

6. Aggiungere il volume calcolato della matrice di membrana al MM ghiacciato e mescolare pipettando su e giù 10 volte

  1. Pipettare lentamente la miscela sovrapposta sopra le celle e riposizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C.
  2. Sostituire il mezzo con un mezzo di manutenzione fresco ogni 24 ore.
  3. A 24 ore dalla placcatura, trasferire il mezzo condizionato dal pozzo designato per i test MTT e albumina. Conservare il mezzo condizionato in un tubo di microfuga fino al momento di eseguire il test dell'albumina. Procedere al passaggio 7.1 per il test MTT.
    NOTA: Conservare il supporto condizionato a 4 °C per la conservazione a breve termine (meno di un giorno). Per una conservazione più lunga, conservare il supporto a -80 °C.

7. Analisi dell'efficienza di consegna, della vitalità e dell'editing on-target negli epatociti di topo elettroporati

  1. Misurazione della vitalità mediante test MTT
    1. Preparare la soluzione madre MTT da 12 mM aggiungendo 1 mL di PBS a un flaconcino da 5 mg di MTT.
    2. Aggiungere 150 μL della soluzione madre MTT ai pozzetti e incubare per 24 ore.
    3. Dopo l'incubazione, aggiungere 1,5 ml di soluzione di sodio dodecilsolfato-cloridrato (SDS-HCl) a ciascun pozzetto e quindi pipettare per mescolare.
    4. Incubare la piastra per 4 ore a 37 °C e cercare un cambiamento nel colore del mezzo da chiaro a viola per indicare le cellule vitali.
    5. Mescolare nuovamente ogni campione utilizzando una pipetta e leggere l'assorbanza a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
    6. Calcolare la vitalità normalizzata per i campioni trattati con Cas9 utilizzando Eq (1):
      figure-protocol-19359 (1)
  2. Test dell'albumina per valutare la funzionalità degli epatociti
    1. Trasferire 50 μL del mezzo condizionato ai pozzetti nella piastra fornita dal kit di albumina. Coprire i pozzetti e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
    2. Lavare i pozzetti 5x con 200 μL di tampone di lavaggio.
    3. Capovolgere la piastra per svuotare ogni pozzetto su carta velina e picchiettare un paio di volte.
    4. Dopo il lavaggio, aggiungere 50 μL dell'anticorpo biotinilato fornito nel kit di analisi dell'albumina a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
    5. Ripetere i passaggi 5.2.2-5.2.3 per lavare i pozzetti.
    6. Aggiungere 50 μL di streptavidina-perossidasi fornita nel kit di dosaggio dell'albumina a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
    7. Ripetere il passaggio 5.2.2.
    8. Aggiungere 50 μL del substrato cromogeno fornito nel kit di dosaggio dell'albumina per pozzetto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Picchiettare delicatamente la piastra per garantire una miscelazione uniforme. Rimuovere eventuali bolle d'aria con una punta a pipetta.
    9. Infine, aggiungere 50 μL di soluzione di arresto a ciascun pozzetto e cercare un cambiamento di colore dal giallo al blu per indicare le cellule funzionali.
    10. Procedere immediatamente alla lettura dell'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
  3. Stimare l'efficienza di mandata nei pozzi elettroporati con mRNA eGFP.
    1. Cattura immagini di contrasto di fase e fluorescenza verde di epatociti 24 ore dopo l'elettroporazione. Scatta tre immagini in luoghi diversi all'interno del pozzo.
    2. Carica le immagini delle celle su ImageJ. Nella scheda Immagine selezionare Digita | a 16 bit per convertire l'immagine in scala di grigi.
    3. Per evidenziare le strutture cellulari nell'immagine, nella scheda Immagine selezionare Regola | Soglia. Regolare il dispositivo di scorrimento per evidenziare le celle.
    4. Nella scheda Processo , selezionare Sottrai sfondo per rimuovere il rumore di fondo.
    5. Contare le celle facendo clic sulla scheda Analizza e quindi selezionare Analizza particelle. Fare clic su OK per generare un elenco di particelle contate.
    6. Calcola la percentuale di cellule GFP-positive dividendo il numero di particelle contate nelle immagini di fluorescenza verde per il numero di particelle contate nell'immagine di contrasto di fase corrispondente.
  4. Analisi dell'attività Cas9 on-target
    1. Estrarre il DNA genomico dalle cellule elettroporate.
      1. Rimuovere il mezzo dalla piastra 3 giorni dopo l'elettroporazione e aggiungere 500 μL di tripsina allo 0,25%. Incubare a 37 °C per 5 min. Pipettare più volte dopo l'incubazione per garantire che gli epatociti si siano staccati dalla piastra.
      2. Trasferire la sospensione cellulare tripsinizzata in tubi di microcentrifuga e ruotare in una centrifuga da tavolo a 800 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la rotazione, esaminare i tubi per i pellet.
      3. Rimuovere il surnatante contenente tripsina mediante pipettaggio. Assicurati di non disturbare il pellet. Risospesare il pellet in 80 μL di soluzione di estrazione del DNA. Se il pellet è difficile da vedere, risospesciare il contenuto del tubo in 50 μL di soluzione di estrazione del DNA.
      4. Vortice per 30 s per garantire che il pellet venga risospeso. Trasferire la sospensione su tubi a strisce divise PCR e posizionarli nel termociclatore. Eseguire per 15 minuti a 95 °C e 8 minuti a 68 °C.
    2. PCR-amplificare il locus on-target.
    3. Seguire la procedura descritta di seguito per amplificare la regione Hpd sul bersaglio utilizzando la DNA polimerasi.
      1. Preparare una reazione contenente 0,5 μL di 10 mM dNTPs, 0,5 μL di primer Forward da 10 μM, 0,5 μL di primer inverso da 10 μM, 0,125 μL di Taq polimerasi, 5 μL di DNA genomico estratto dagli epatociti e 18,375 μL di acqua priva di nucleasi. Vedere la tabella supplementare S1 per le sequenze di primer.
      2. Ruotare brevemente e centrifugare rapidamente la miscela PCR per assicurarsi che la soluzione sia nella parte inferiore del tubo.
      3. Posizionare la miscela PCR in un termociclatore e amplificare in queste condizioni: 94 °C per 30 s per la denaturazione, 30 cicli di 94 °C per 30 s, 57 °C per 45 s per la ricottura, 68 °C per 1 min e un'estensione finale di 68 °C per 5 min.
        NOTA: La temperatura di ricottura per la reazione PCR varierà a seconda della composizione dei primer. Prendere in considerazione l'utilizzo di un calcolatore della temperatura di fusione prima di eseguire la PCR.
      4. Per confermare la corretta dimensione del prodotto, mescolare 3 μL dei prodotti PCR con 2 μL di acqua e 1 μL di colorante 6x. Eseguire un gel di agarosio all'1,5% e confermare la dimensione corretta del prodotto.
    4. Purificare il DNA usando perline magnetiche.
      NOTA: le colonne di rotazione potrebbero essere utilizzate anche per la pulizia della PCR. Di seguito sono riportate le procedure per purificare i prodotti PCR utilizzando perline magnetiche.
      1. Rimuovere le perle magnetiche da 4 °C e lasciarle raggiungere la temperatura ambiente.
      2. Ruotare brevemente e centrifugare rapidamente la miscela PCR.
      3. Aggiungere un volume di perline pari a 1,8× volume della miscela PCR. Pipettare la miscela PCR-perline 10x per garantire che la soluzione sia ugualmente miscelata.
      4. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
      5. Trasferire la miscela PCR-perline su una piastra PCR e posizionarla su una piastra magnetica.
      6. Incubare la piastra sul magnete per 5 minuti. Dopo i 5 minuti, verificare che la soluzione sia chiara e che le perline siano legate al magnete prima di passare al passaggio successivo.
      7. Scartare il surnatante.
      8. Aggiungere 200 μL di etanolo al 70% al pozzo e incubare per 30 s.
        NOTA: L'etanolo al 70% deve essere preparato poco prima di eseguire la pulizia per prevenire la perdita di DNA.
      9. Scartare il surnatante e ripetere il passaggio 7.4.4.8.
      10. Rimuovere il surnatante e lasciare asciugare per 3 minuti a temperatura ambiente per rimuovere tracce di etanolo.
      11. Rimuovere la piastra dal magnete e aggiungere 22 μL di acqua al campione. Pipetta su e giù 10 volte per mescolare acqua e perline.
      12. Incubare i campioni per 3 minuti a temperatura ambiente.
      13. Trasferire la piastra sul magnete e incubare per 3 minuti o fino a quando la soluzione è limpida.
      14. Trasferire 20 μL del campione in un tubo PCR. Fai attenzione che non vengano trasportate perline.
    5. Amplicon di DNA purificato di sequenza mediante sequenziamento Sanger.
    6. Caricare i file di sequenza .ab1 per i campioni trattati e di controllo (non trattati) in Tracking of indels by Decomposition (TIDE)16 per quantificare gli indels nel sito di destinazione.

Risultati

Isolamento degli epatociti primari piastrizzabili dal fegato
Il processo complessivo di perfusione epatica e isolamento degli epatociti è illustrato nella Figura 1. In questo esperimento sono stati utilizzati topi C57BL6/6J di tipo selvatico di 8-10 settimane. La procedura dovrebbe produrre 20-50 × 106 cellule per topo con una vitalità compresa tra l'85% e il 95%. Se la vitalità è <70%, deve essere seguito il trattamento percoll per rimuovere le cellule mo...

Discussione

I passaggi delineati nel protocollo per l'isolamento degli epatociti sono impegnativi e richiedono pratica per la competenza. Ci sono diversi passaggi chiave per il successo dell'isolamento degli epatociti dal fegato. In primo luogo, una corretta cannulazione della vena cava inferiore è essenziale per la completa perfusione epatica. L'assenza di sbiancamento nel fegato dopo la perfusione indica lo spostamento del catetere (Tabella 1). La vena cava inferiore (perfusione retrograda) è stata cannulata nel...

Divulgazioni

Gli autori non hanno interessi concorrenti da divulgare.

Riconoscimenti

RNC ha ricevuto finanziamenti dal South Carolina Bioengineering Center of Regeneration and Formation of Tissues Pilot grant sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) del National Institutes of Health, dall'American Association for the Study of Liver Diseases Foundation e dall'American Society of Gene & Cell Therapy con i numeri di sovvenzione P30 GM131959, 2021000920, e 2022000099, rispettivamente. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dell'American Society of Gene & Cell Therapy o dell'American Association for the Study of Liver Diseases Foundation. Lo schema per la Figura 1 è stato creato con BioRender.com.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, naturalUSA Scientific1402-4700
6-well Collagen PlatesAdvanced Biomatrix5073
accuSpin Micro 17RFisher Scientific13-100-675
All-in-one Fluorescent MicroscopeKeyenceBZ-X810
Analog Vortex MixerVWR97043-562
ART Wide BORE filtered tips 1,000 µLThermoFisher Scientific2079GPK
Automated Cell CounterBio-Rad LaboratoriesTC20
Blue Wax Dissection TrayBraintree Scientific Inc.DTW19" x 6.5" x 1/2"+F21
Cell scraper/lifterArgos TechnologiesUX-04396-53Non-pyrogenic, sterile
Conical tubes (15 mL)Fisher Scientific339650
Conical tubes (50 mL)Fisher Scientific14-432-22
Cotton applicatorsFisher Scientific22-363-170
Curved scissorsCooper Surgical62131
Disposable Petri DishesFalcon351029100mm,sterile
Disposable Petri DishesVWR25373-10035mm, sterile
Epoch Microplate SpectrophotometerBioTek Instruments250082
Falcon Cell strainer (70 µm)Fisher Scientific08-771-2
ForcepsCooper Surgical61864Euro-Med Adson Tissue Forceps
IV catheters BD38261224 G x 0.75 in
IV infusion setBaxter2C6401
MyFuge 12 Mini CentrifugeBenchmark Scientific1220P38
NeedlesFisher Scientific05-561-2025 G
Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes
Peristaltic PumpMasterflex HV-77120-4210 to 60 rpm; 90 to 260 VAC
Precision pump tubingMasterflexHV-96410-1425 ft, silicone
Primaria Culture PlatesCorning Life Sciences353846Nitrogen-containing tissue culture plates
Serological Pipets (25 mL)Fisher Scientific12-567-604
SyringesBD3294641 mL, sterile
T100 Thermal CyclerBio-Rad Laboratories1861096
Water bathALT27577Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3IDT1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mLFisher ScientificNC9959336
CleanCap Cas9 mRNATrilink BiotechnologiesL-7606-100
CleanCap EGFP mRNATrilink BiotechnologiesL-7201-100
Corning Matrigel MatrixCorning Life Sciences356234
DMEMThermoFisher Scientific11885076Low glucose, pyruvate
Ethanol 70%VWR71001-652
Fetal bovine serumThermoscientific26140-079
Hepatocyte Maintenance Medium (MM)LonzaMM250
Hepatocyte Plating Medium (PM)LonzaMP100
Mouse Albumin ELISA KitFisher ScientificNC0010653
Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector KitLonzaVPL-1004
OneTaq HotStart DNA PolymeraseNew England BiolabsM0481L
PBS 10x pH 7.4 Thermoscientific70011-044No calcium or magnesium chloride
Percoll (PVP solution)Santa Cruz Biotechnologysc-500790A
Periodic acidSigma-AldrichP7875-25G
Permount Mounting MediumVWR100496-550
QuickExtract DNA Extraction SolutionLucigen CorporationQE05090
Schiff’s fuchsin-sulfite reagentSigma-AldrichS5133
Trypsin-EDTA (0.25%)ThermoFisher Scientific25200056Phenol red
Vybrant MTT Cell Viability AssayThermoFisher ScientificV13154
Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) Stable at 4 °C for 2 months
EBSSFisher Scientific14155063Complete to 200 mL
EGTA (0.5 M)Bioworld40520008-1200 µL
HEPES (pH 7.3, 1 M)ThermoFisher ScientificAAJ16924AE2 mL 
Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) Stable at 4 °C for 2 months
CaCl2·2H20 (1.8 mM)SigmaC7902-500G360 µL of 1 M stock 
EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)Fisher Scientific14-155-063Complete to 200 mL
HEPES (1 M)ThermoFisher ScientificAAJ16924AE2 mL 
MgSO4·7H20 (0.8 mM)Sigma30391-25G160 µL of 1 M stock
Perfusion Solution 3 Prepared fresh prior to use
Solution 250 mL
LiberaseRoche54011270010.094 Wunsch units/mL
Mouse Anesthetic Cocktail 
Acepromzine0.25 mg/mL final concentration
Ketamine7.5 mg/mL final concentration
Xylazine1.5 mg/mL final concentration
SoftwareURL
Benchlinghttps://www.benchling.com/
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Tracking of Indels by Decompositionhttps://tide.nki.nl/

Riferimenti

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BioingegneriaNumero 184

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