Entrega mediada por electroporación de ribonucleoproteínas Cas9 y ARNm en hepatocitos primarios de ratón recién aislados

Resumen

Este protocolo describe técnicas para aislar hepatocitos primarios de ratón del hígado y electroporar CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas y ARNm para interrumpir un gen diana terapéutico asociado con una enfermedad metabólica hereditaria del hígado. Los métodos descritos dan como resultado una alta viabilidad y altos niveles de modificación genética después de la electroporación.

Resumen

Este protocolo describe un método rápido y eficaz para aislar los hepatocitos primarios de ratón seguido de la administración mediada por electroporación de CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas (RNPs) y ARNm. Los hepatocitos primarios de ratón se aislaron utilizando un método de perfusión retrógrada de tres pasos, lo que resultó en altos rendimientos de hasta 50 × 10⁶ células por hígado y una viabilidad celular de >85%. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas para el recubrimiento, tinción y cultivo de hepatocitos. Los resultados indican que la electroporación proporciona una alta eficiencia de transfección del 89%, medida por el porcentaje de células positivas para proteína fluorescente verde (GFP) y una viabilidad celular modesta de >35% en hepatocitos de ratón.

Para demostrar la utilidad de este enfoque, CRISPR-Cas9 dirigido al gen hidroxifenilpiruvato dioxigenasa se electroporó en hepatocitos primarios de ratón como prueba de principio de edición de genes para interrumpir un gen terapéutico relacionado con una enfermedad metabólica hereditaria (IMD) del hígado. Se observó una mayor edición en el objetivo del 78% para los RNP en comparación con la eficiencia de edición del 47% con ARNm. La funcionalidad de los hepatocitos se evaluó in vitro mediante un ensayo de albúmina que indicó que la administración de CRISPR-Cas9 como RNPs y ARNm da como resultado una viabilidad celular comparable en hepatocitos primarios de ratón. Una aplicación prometedora para este protocolo es la generación de modelos de ratón para enfermedades genéticas humanas que afectan al hígado.

Introducción

Los IMD del hígado son trastornos genéticos caracterizados por la deficiencia de una enzima hepática crucial involucrada en el metabolismo que conduce a la acumulación de metabolitos tóxicos. Sin tratamiento, las IMD del hígado resultan en insuficiencia orgánica o muerte prematura ^1,2. La única opción curativa para los pacientes con IMD del hígado es el trasplante hepático ortotópico, que es limitado debido a la baja disponibilidad de órganos de donantes y las complicaciones de la terapia inmunosupresora después del procedimiento ^3,4. Según datos recientes recopilados por la Red de Procuración y Trasplante de Órganos, solo el 40%-46% de los pacientes adultos en la lista de espera de trasplante hepático reciben un órgano, mientras que el 12,3% de estos pacientes mueren mientras están en la lista de espera⁵. Además, solo el 5% de todas las enfermedades hepáticas raras tienen un tratamiento aprobado por la FDA⁶. Está claro que existe una necesidad crítica de nuevos tratamientos para los IMD del hígado. Sin embargo, se requieren modelos de enfermedad apropiados para desarrollar nuevas opciones terapéuticas.

El modelado de enfermedades humanas utilizando sistemas in vitro e in vivo sigue siendo un obstáculo para desarrollar terapias efectivas y estudiar la patología de los IMD del hígado. Los hepatocitos de pacientes con enfermedades hepáticas raras son difíciles de obtener⁷. Los modelos animales son cruciales para desarrollar una comprensión de la patología de la enfermedad y para probar estrategias terapéuticas. Sin embargo, un obstáculo es la generación de modelos a partir de embriones portadores de mutaciones letales. Por ejemplo, los intentos de crear modelos de ratón del síndrome de Alagille (ALGS) con embriones que contienen deleciones homocigotas de una secuencia de 5 kb cerca del extremo 5′ del gen Jag1 resultaron en la muerte prematura de los embriones⁸. Además, la generación de modelos de ratón mediante edición de genes en células madre embrionarias puede requerir mucho tiempo y recursos⁹. Por último, aparecerán mutaciones fuera del tejido diana, dando lugar a variables de confusión que pueden impedir el estudio de la enfermedad⁹. La edición de genes somáticos permitiría una edición más fácil en el tejido hepático y evitaría los desafíos asociados con la generación de modelos utilizando células madre embrionarias.

La electroporación permite la entrega de CRISPR-Cas9 directamente en el núcleo mediante la aplicación de corrientes de alto voltaje para permeabilizar la membrana celular y es compatible con muchos tipos de células, incluidas aquellas que son intransigentes a las técnicas de transfección, como las células madre embrionarias humanas, las células madre pluripotentes y las neuronas 10,11,12 . Sin embargo, la baja viabilidad es un inconveniente potencial de la electroporación; la optimización del procedimiento puede producir altos niveles de administración al tiempo que limita la toxicidad¹³. Un estudio reciente demuestra la viabilidad de electroporar componentes CRISPR-Cas9 en hepatocitos primarios de ratón y humanos como un enfoque altamente eficiente¹⁴. La electroporación ex vivo en hepatocitos tiene el potencial de ser aplicada para generar nuevos modelos de ratón para IMD humanos del hígado.

Este protocolo proporciona un procedimiento detallado paso a paso para aislar hepatocitos de ratón del hígado y, posteriormente, electroporar CRISPR-Cas9 como complejos RNP, que consisten en proteína Cas9 y ARN sintético de guía única (sgRNA), o ARNm Cas9 combinado con sgRNA para obtener altos niveles de edición de genes en el objetivo. Además, el protocolo proporciona métodos para cuantificar la eficiencia, viabilidad y funcionalidad de la edición de genes después de la electroporación de CRISPR-Cas9 en hepatocitos de ratón recién aislados.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y los protocolos aprobados en la Universidad de Clemson. Los procedimientos quirúrgicos se realizaron en ratones C57BL/6J de tipo salvaje anestesiados entre 8 y 10 semanas de edad.

1. Cirugía animal

1. Preparación de soluciones e instrumentos
   NOTA: Las soluciones de perfusión y las recetas de cócteles de anestesia se muestran en la Tabla de Materiales.
   1. Prepare la Solución de Perfusión 1 (HEPES, EGTA y EBSS), la Solución de Perfusión 2 (HEPES, EGTA, EBSS, CaCl₂ y MgSO₄) y la Solución de Perfusión 3 (Solución 2 y Liberase). Asegúrese de que las soluciones estén bien mezcladas.
   2. Ajuste el baño de agua a 42 °C y precalenta las soluciones de perfusión 1, 2 y 3 durante un mínimo de 30 minutos antes de comenzar el procedimiento y manténgalas en el baño de agua.
      NOTA: Las soluciones de perfusión 1 y 2 quelarán el calcio y eliminarán la sangre en el hígado. Perfusion Solution 3 contiene la enzima digestiva liberase para disociar la matriz extracelular.
   3. Coloque 150 ml de DMEM + 10% de suero fetal bovino (FBS) en tubos cónicos y manténgalos en hielo.
      NOTA: Este medio se utilizará para liberar las células de la cápsula hepática y lavar los hepatocitos aislados en los pasos 2.1 y 2.2, respectivamente.
   4. Ajuste la centrífuga a 4 °C.
   5. Esterilice el tubo de la bomba colocando ambos extremos del tubo en un matraz lleno de etanol al 70% y ciclando el etanol tres veces.
   6. Lavar el tubo con agua destilada y vaciarlo.
   7. Llene el tubo con 30 ml de solución de perfusión 1 precalentada, seguido de 8 ml de solución de perfusión 2. Si el tubo todavía tiene espacio para más líquidos, llene el resto del tubo con Solución de perfusión 3. Detenga la bomba cuando cambie a una solución de perfusión diferente para evitar la introducción de burbujas de aire en el tubo.
   8. Coloque el exceso de tubos en el baño de agua a 42 °C para mantener calientes las soluciones de perfusión.
   9. Coloque el extremo del tubo de la bomba en el tubo cónico que contiene la solución de perfusión 3, mientras se mantiene en el baño de agua.
      NOTA: Este paso es necesario para permitir que la bomba se llene continuamente con solución de perfusión 3 durante la perfusión.
2. Preparación animal
   1. Anestesiar al ratón inyectando el cóctel anestésico por vía intraperitoneal a una dosis de 10-11,7 μL/g de peso corporal. El cóctel anestésico tiene una concentración final de 7,5 mg/ml de ketamina, 0,25 mg/ml de acepromazina y 1,5 mg/ml de xilazina.
   2. Controle la respiración del ratón y compruebe que el ratón no está reaccionando al dolor. Espere hasta que el ratón tenga una frecuencia respiratoria de ~ 55-65 respiraciones por minuto, no responda a que le pellizquen los dedos de los pies y tenga una cola flácida. Además, revise el reflejo palpebral (parpadeo) tocando ligeramente la piel en el lado medial del ojo cerrado. Si el ratón parpadea o los músculos oculares se contraen, aumente la dosis de todo el cóctel anestésico en 5-10 μL.
   3. Coloque el ratón sobre su espalda en posición supina y asegure las extremidades a la superficie con alfileres o cinta adhesiva (Figura suplementaria S1).
   4. Rocíe el abdomen con etanol al 70% y séquelo con una bola de algodón.
3. Perfusión hepática
   1. Haga una incisión lateral en forma de U en la piel del abdomen con tijeras y expanda el orificio a través de los lados.
   2. Continúe abriendo la piel a la caja torácica.
   3. Usando tijeras, corte a través del peritoneo para exponer la cavidad abdominal hasta la caja torácica, teniendo cuidado de no cortar ningún órgano. Mueva los intestinos hacia el lado derecho usando la parte posterior de las pinzas o la superficie roma de las tijeras. Identificar la vena cava inferior y la vena porta (Figura suplementaria S1).
   4. Inicie la bomba para enjuagar la solución de perfusión precalentada a través del catéter.
   5. Detenga la bomba y retire el catéter una vez que todo el aire haya sido enjuagado a través del sistema. Inserte la punta de la aguja conectada al catéter en la vena cava inferior en un ángulo de 10° -20° con respecto a la vena. Retire la aguja del catéter y empuje suavemente el catéter hacia la vena en un movimiento paralelo a la vena.
      NOTA: El usuario debe observar flashback de sangre en el catéter para verificar la canulación adecuada en la vena.
   6. Conecte el tubo al catéter sin mover el catéter más hacia la vena.
   7. Arranque la bomba con un caudal de 2 ml/min. Busque que el hígado se ponga pálido inmediatamente como una señal de que la perfusión es exitosa.
   8. Corte la vena porta con tijeras.
   9. Aumente gradualmente el caudal a 5 ml/ min.
   10. Aplique presión periódicamente a la vena porta en el sitio de corte aproximado durante 3 s usando fórceps o un hisopo de algodón para bloquear el drenaje y facilitar una buena perfusión.
   11. Una vez que la solución de perfusión 3 esté fluyendo, controle cuidadosamente la elasticidad del hígado. Para determinar si el hígado está ablandado, presione suavemente el hígado con un hisopo de algodón o fórceps y verifique si se forman hendiduras en el hígado. Tenga cuidado de no sobreperfusarse para evitar la pérdida de viabilidad celular.
   12. Una vez que el hígado se ablanda (que ocurre después de que hayan pasado 30-50 ml de Solución de Perfusión 3), detenga la bomba, retire el catéter y diseccione cuidadosamente el hígado. Coloque el hígado en una placa de Petri de 100 mm que contenga DMEM helado + medio 10% FBS. Extirpar la vesícula biliar, teniendo cuidado de no derramar su contenido. Gire la placa de Petri para eliminar suavemente los posibles coágulos de sangre.
   13. Transfiera el hígado a una nueva placa de Petri que contenga DMEM helado + 10% FBS medio.

2. Aislamiento de hepatocitos

1. Liberar células de la cápsula hepática.
   1. Coloque la placa de Petri sobre hielo y, con dos pares de fórceps estériles, desgarre suavemente la cápsula hepática en todos los lóbulos. Gire suavemente el hígado alrededor del medio usando un levantador de células o un fórceps para liberar los hepatocitos. Continúe este movimiento hasta que el hígado se vuelva muy pequeño y la suspensión se vuelva marrón y opaca.
   2. Retire los restos del tejido hepático de la placa y, utilizando una pipeta serológica de 25 ml a baja velocidad, transfiera cuidadosamente la suspensión celular a un tubo cónico de 50 ml (prechillado sobre hielo) equipado con un colador de células de 100 μm.
   3. Agregue DMEM fresco y helado + medio FBS al 10% a la placa de Petri para lavar y recoger las células restantes de la superficie y transferirlas al tubo cónico de 50 ml. Repita este paso hasta que se recojan todas las células.
2. Lavar y purificar los hepatocitos de las células no pares.
   1. Centrifugar las células recogidas en el tubo cónico de 50 ml a 50 × g a 4 °C durante 5 min a baja desaceleración o sin frenos.
   2. Deseche el sobrenadante que contiene restos y células no parentales y vuelva a suspender el gránulo en el sobrenadante sobrante girando suavemente el tubo. Después de que el pellet se vuelva a suspender, agregue 30 ml de DMEM fresco y helado + 10% FBS medio.
   3. Repita la centrifugación (paso 2.2.1) y el lavado (paso 2.2.3) tres veces.
   4. Resuspend el pellet de célula final en 10 mL de DMEM helado + 10% FBS medio.
      NOTA: El volumen del medio utilizado para resuspendir el pellet depende del tamaño del pellet. Si el pellet es considerablemente más pequeño que 15 mm, use 1-5 ml de DMEM helado + 10% FBS medio.
3. Cuantificación de la viabilidad celular
   1. En un tubo de microfugio, agregue 50 μL de solución de trypan blue al 0,4% a 350 μL de medio de recubrimiento de hepatocitos (PM). Luego, agregue 100 μL de suspensión celular para hacer una dilución final de 1: 5 y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar.
   2. Cuente la densidad celular y la viabilidad utilizando un hemocitómetro. Mientras cuenta, coloque la suspensión de hepatocitos sobre hielo y luego coloque el cubo de hielo en un agitador orbital ajustado a 30 rpm para evitar que los hepatocitos se asienten.
   3. Siga los pasos de tratamiento y centrifugación de Percoll a continuación si la viabilidad celular es <70%.
      1. Diluya Percoll con solución salina tamponada con fosfato 10x (PBS) en una proporción de 9: 1.
      2. Mezcle la suspensión de hepatocitos con el Percoll diluido en una proporción de 1:1.
      3. Centrifugar a 200 × g a 4 °C durante 10 min.
      4. Deseche el sobrenadante que contiene células muertas. Resuspend el pellet en DMEM helado + 10% FBS medio.
      5. Vuelva a contar las celdas.
4. Pruebas de plateabilidad de los hepatocitos
   1. Placa algunas de las células en placas de 6 pocillos recubiertas de colágeno I a una densidad de 0.5 × 10⁶ células por ml usando 1.5 mL de PM precalentado.
   2. Mantenga las celdas restantes en hielo mientras está en un agitador orbital hasta que esté listo para realizar la electroporación.
   3. Coloque la placa de células en una incubadora de CO₂ con camisa de agua a 37 C. Mueva la placa horizontal y verticalmente suavemente en un movimiento de norte a sur y de este a oeste para garantizar un recubrimiento homogéneo. Repite el movimiento dos veces más cada 1,5 h.
   4. Verifique la fijación de la celda a las 3 h después del revestimiento.
      NOTA: Al menos el 60% de las células deben adherirse a la placa como un indicador de hepatocitos de buena calidad.
   5. Cambie el medio a medio de mantenimiento de hepatocitos (MM) precalentado a las 24 h después del recubrimiento para mantener las células en cultivo.
5. Tinción de glucógeno
   1. Después de que las células se hayan adherido a las placas recubiertas de colágeno I de 6 pocillos, retire el medio gastado de las células cultivadas.
   2. Fije las células durante 10-15 minutos en etanol helado.
   3. Lavar bien con agua estéril.
   4. Incubar en ácido periódico acuoso al 1% durante 5 min y luego lavar con agua estéril.
   5. Incubar en reactivo 100% Schiff durante 30 min.
      NOTA: El reactivo de Schiff no debe diluirse antes de agregarlo a las células.
   6. Lavar con agua tres veces durante 10 min.
   7. Montaje en medio de montaje.
   8. Imagen con un microscopio en un entorno de campo brillante.

3. Diseño de sgRNAs para la edición de genes CRISPR-Cas9

NOTA: Esta sección describe el diseño de un sgRNA dirigido al gen hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (Hpd) de ratón como prueba de principio de edición de genes para interrumpir un gen diana terapéutico relacionado con una IMD del hígado.

1. Diseñe la secuencia de guía dirigida al Hpd utilizando el software al que se hace referencia¹⁵.
2. Verifique la secuencia de Hpd con el navegador del genoma de Ensembl.
3. Utilice los siguientes parámetros para diseñar el ARNg: longitud de guía única de 20 nucleótidos y una secuencia de motivo protoespaciador-adyacente (PAM) NGG (N puede ser cualquier nucleótido).
4. Seleccione una región de destino del exón 3 en el Hpd.
5. Genere una lista de secuencias de guía de la región de destino con puntuaciones dentro y fuera del objetivo.
   NOTA: La puntuación en el objetivo indica la eficiencia de edición prevista en el objetivo para el diseño dado: una puntuación más alta se correlaciona con una mayor eficiencia de edición. La puntuación fuera del objetivo se correlaciona con la especificidad de la secuencia de la guía: una puntuación más alta indica una menor probabilidad de edición fuera del objetivo. Idealmente, ambos puntajes deben ser altos: el puntaje en el objetivo >60 y el puntaje fuera del objetivo > 50.
6. Seleccione la secuencia de guía con las puntuaciones más altas en el objetivo y fuera del objetivo. Haga sintetizar químicamente el sgRNA que contiene la secuencia guía.

4. Electroporación y cultivo celular

1. Preparación de sustratos, medios, celdas y el instrumento de electroporación CRISPR-Cas9
   1. Añadir todo el suplemento que lo acompaña al PM y calentar en el baño de agua a 37 °C durante 10 min.
   2. Encienda el dispositivo de electroporación presionando el botón de encendido y configure el programa de electroporación presionando el botón x y luego el botón de flecha hacia abajo hasta que aparezca el programa T-028 en la pantalla.
   3. Prepare los pocillos de destino para los hepatocitos electroporados agregando 1.5 ml de PM a placas recubiertas de colágeno I de seis pocillos. Incubar las placas en una incubadora de 37 °C hasta que estén listas para usar.
   4. Agregue todo el suplemento que lo acompaña a la solución tampón de electroporación e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.
      NOTA: Etiquete la fecha de vencimiento del tampón de electroporación en el vial (3 meses después de la fecha de adición del suplemento).
   5. Retire los recipientes de electroporación del embalaje y etiquételos para cada muestra.
   6. En tubos de tira dividida de PCR, prepare los complejos Cas9 RNP combinando 30 μg de sgRNA con 300 pmol de proteína Cas9 e incube los complejos a temperatura ambiente durante 10 min. Preparar el ARNm Cas9 combinando 30 μg de sgRNA con 4 μL de ARNm Cas9 (1 μg/μL). Guarde la mezcla de ARNm-SGRNA en hielo hasta la electroporación. Prepare por separado un tubo que contenga 1,0 μg de ARNm eGFP para verificar el éxito de la electroporación mediante microscopía de fluorescencia.
   7. Centrífuga 1,2 × 10⁶ celdas por reacción de electroporación a 100 × g durante 2 min a 4 °C.
   8. Retire el sobrenadante del gránulo de la celda y agregue 100 μL de solución de electroporación por reacción a lo largo del lado de la pared del tubo. Resuspend los hepatocitos en la solución de electroporación balanceando el tubo suavemente a mano.
2. Electroporación de RNPs CRISPR-Cas9 y ARNm en hepatocitos
   1. Una vez que los hepatocitos aparecen uniformemente dispersos en la solución de electroporación, transfiera 100 μL de la suspensión de hepatocitos a los tubos de tira que contienen los complejos Cas9.
      NOTA: Use puntas de pipeta de diámetro ancho al transferir hepatocitos para preservar la viabilidad celular.
   2. Transfiera el contenido del pozo de tira a un recipiente de electroporación.
   3. Coloque el recipiente de la nucleovette en la ranura del dispositivo de electroporación. Electroporar los hepatocitos pulsando el botón x . Después de la electroporación, espere a que aparezca una pantalla en el dispositivo que diga OK. Presione el botón x nuevamente y retire el recipiente.
   4. Incubar el recipiente electroporado en hielo durante 15 min.
   5. Añadir 500 μL de PM precalentado al vaso de electroporación.
   6. Transfiera 300 μL de la reacción de electroporación a cada pozo de destino en la placa precalentada.
      NOTA: Debe haber dos pozos de destino por reacción de electroporación. Se utilizará un pozo para cuantificar la eficiencia de la edición de genes; el otro pozo se utilizará para los ensayos de MTT y albúmina.
   7. Para evitar que los hepatocitos se acumulen en el centro del pozo, disperse las células moviendo suavemente las placas horizontal y verticalmente en un movimiento de norte a sur y de este a oeste. Asegúrese de que la placa mantenga contacto con el estante de la incubadora mientras se mueve. Repita este movimiento a los 15, 30, 45, 60 y 90 minutos después de emplatar los hepatocitos electroporados.
   8. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.
   9. Retire el medio de los pocillos designados para el análisis de edición de genes 24 h después de enchapar las células y reemplácelo con una superposición de matriz de membrana basal de 0,25 mg / ml.
      NOTA: Si se almacena en el congelador, transfiera la matriz de membrana a 4 °C y deje que se descongele. Debido a que la matriz de la membrana basal es sólida por encima de 10 ° C, es crucial que la matriz de la membrana basal permanezca en hielo o a 4 ° C hasta que esté lista para usar.

5. Calcular el volumen de la matriz de membrana a mezclar con MM para dar una concentración final de 0,25 mg/ml

NOTA: Para una placa de 6 pocillos, se necesitan 2 ml de superposición por pozo.

6. Agregue el volumen calculado de la matriz de membrana a MM helado y mezcle mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 10 veces

1. Pipetee la mezcla superpuesta lentamente sobre las celdas y vuelva a colocar la placa en la incubadora de 37 ° C.
2. Reemplace el medio por un medio de mantenimiento nuevo cada 24 h.
3. A las 24 h después del emplatado, transfiera el medio acondicionado del pozo designado para los ensayos de MTT y albúmina. Guarde el medio acondicionado en un tubo de microfuge hasta que esté listo para realizar el ensayo de albúmina. Continúe con el paso 7.1 para el ensayo MTT.
   NOTA: Guarde el medio acondicionado a 4 °C para almacenamiento a corto plazo (menos de un día). Para un almacenamiento más prolongado, guarde el medio a -80 °C.

7. Análisis de la eficiencia de la entrega, la viabilidad y la edición en el objetivo en hepatocitos electroporados de ratón

1. Medición de viabilidad mediante ensayo MTT
   1. Prepare una solución madre de MTT de 12 mM agregando 1 ml de PBS a un vial de 5 mg de MTT.
   2. Añadir 150 μL de la solución madre MTT a los pozos e incubar durante 24 h.
   3. Después de la incubación, agregue 1.5 ml de solución de dodecil sulfato-clorhidrato de sodio (SDS-HCl) a cada pocillo y luego pipetee para mezclar.
   4. Incubar la placa durante 4 h a 37 °C y buscar un cambio en el color del medio de claro a púrpura para indicar células viables.
   5. Mezcle cada muestra de nuevo con una pipeta y lea la absorbancia a 570 nm utilizando un lector de microplacas.
   6. Calcule la viabilidad normalizada para las muestras tratadas con Cas9 utilizando Eq (1):
      (1)
2. Ensayo de albúmina para evaluar la funcionalidad de los hepatocitos
   1. Transfiera 50 μL del medio acondicionado a los pocillos en la placa proporcionada por el kit de albúmina. Cubra los pozos e incube durante 2 h a temperatura ambiente.
   2. Lave los pocillos 5 veces con 200 μL de tampón de lavado.
   3. Invierta la placa para vaciar cada pozo en papel de seda y toque varias veces.
   4. Después del lavado, agregue 50 μL del anticuerpo biotinilado proporcionado en el kit de ensayo de albúmina a cada pozo e incube a temperatura ambiente durante 1 h.
   5. Repita los pasos 5.2.2-5.2.3 para lavar los pozos.
   6. Agregue 50 μL de estreptavidina-peroxidasa proporcionada en el kit de ensayo de albúmina a cada pozo e incube a temperatura ambiente durante 30 min.
   7. Repita el paso 5.2.2.
   8. Añadir 50 μL del sustrato de cromógeno proporcionado en el kit de ensayo de albúmina por pozo e incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Golpee suavemente el plato para asegurar una mezcla uniforme. Retire las burbujas de aire con una punta de pipeta.
   9. Por último, agregue 50 μL de solución de parada a cada pozo y busque un cambio de color de amarillo a azul para indicar las células funcionales.
   10. Proceda inmediatamente a leer la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas.
3. Estimar la eficiencia de entrega en pozos electroporados con ARNm eGFP.
   1. Captura de contraste de fase e imágenes de fluorescencia verde de hepatocitos 24 h después de la electroporación. Tome tres imágenes en diferentes lugares dentro del pozo.
   2. Sube imágenes de las celdas a ImageJ. En la pestaña Imagen , seleccione Tipo | 16 bits para convertir la imagen a escala de grises.
   3. Para resaltar las estructuras de celdas de la imagen, en la pestaña Imagen , seleccione Ajustar | Umbral. Ajuste el control deslizante para resaltar las celdas.
   4. En la pestaña Proceso , seleccione Restar fondo para eliminar el ruido de fondo.
   5. Cuente las celdas haciendo clic en la ficha Analizar y, a continuación, seleccione Analizar partículas. Haga clic en Aceptar para generar una lista de partículas contadas.
   6. Calcule el porcentaje de células GFP positivas dividiendo el número de partículas contadas en las imágenes de fluorescencia verde por el número de partículas contadas en la imagen de contraste de fase correspondiente.
4. Análisis de la actividad cas9 en el objetivo
   1. Extraer ADN genómico de células electroporadas.
      1. Retire el medio de la placa 3 días después de la electroporación y agregue 500 μL de tripsina al 0.25%. Incubar a 37 °C durante 5 min. Pipete varias veces después de la incubación para asegurarse de que los hepatocitos se hayan desprendido de la placa.
      2. Transfiera la suspensión de células tripsinizadas a los tubos de la microcentrífuga y gire en una centrífuga de mesa a 800 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de girar, examine los tubos en busca de gránulos.
      3. Retire el sobrenadante que contiene tripsina mediante pipeteo. Asegúrese de no molestar el pellet. Resuspend el pellet en 80 μL de solución de extracción de ADN. Si el pellet es difícil de ver, vuelva a suspender el contenido del tubo en 50 μL de solución de extracción de ADN.
      4. Vórtice durante 30 s para garantizar que el pellet se resuspenda. Transfiera la suspensión a tubos de tira dividida por PCR y colóquelos en el termociclador. Funciona durante 15 min a 95 °C y 8 min a 68 °C.
   2. PCR-amplificar el locus en el objetivo.
   3. Siga el procedimiento que se describe a continuación para amplificar la región hpd en el objetivo utilizando ADN polimerasa.
      1. Preparar una reacción que contenga 0,5 μL de 10 mM de dNTPs, 0,5 μL de 10 μM de imprimación Forward, 0,5 μL de 10 μM de imprimación inversa, 0,125 μL de Taq polimerasa, 5 μL de ADN genómico extraído de los hepatocitos y 18,375 μL de agua libre de nucleasa. Consulte la Tabla suplementaria S1 para ver las secuencias de imprimación.
      2. Vórtice brevemente y centrífique rápidamente la mezcla de PCR para asegurarse de que la solución esté en la parte inferior del tubo.
      3. Coloque la mezcla de PCR en un termociclador y amplifique en estas condiciones: 94 °C durante 30 s para la desnaturalización, 30 ciclos de 94 °C para 30 s, 57 °C para 45 s para el recocido, 68 °C para 1 min y una extensión final de 68 °C durante 5 min.
         NOTA: La temperatura de recocido para la reacción de PCR variará dependiendo de la composición de los cebadores. Considere usar una calculadora de temperatura de fusión antes de realizar la PCR.
      4. Para confirmar el tamaño correcto del producto, mezcle 3 μL de los productos de PCR con 2 μL de agua y 1 μL de colorante 6x. Ejecute un gel de agarosa al 1.5% y confirme el tamaño correcto del producto.
   4. Purifica el ADN usando perlas magnéticas.
      NOTA: Las columnas de giro también se pueden usar para la limpieza de PCR. A continuación se presentan los procedimientos para purificar los productos de PCR utilizando perlas magnéticas.
      1. Retire las perlas magnéticas de 4 °C y permita que alcancen la temperatura ambiente.
      2. Vórtice brevemente y centrífique rápidamente la mezcla de PCR.
      3. Agregue un volumen de cuentas igual a 1.8× el volumen de la mezcla de PCR. Pipetee la mezcla de cuentas de PCR 10x para garantizar que la solución esté igualmente mezclada.
      4. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
      5. Transfiera la mezcla de PERLAS DE PCR a una placa de PCR y colóquela en una placa magnética.
      6. Incubar la placa en el imán durante 5 min. Después de los 5 minutos, verifique que la solución esté clara y que las perlas estén unidas al imán antes de pasar al siguiente paso.
      7. Deseche el sobrenadante.
      8. Añadir 200 μL de etanol al 70% al pozo e incubar durante 30 s.
         NOTA: El etanol al 70% debe prepararse poco antes de realizar la limpieza para evitar la pérdida de ADN.
      9. Deseche el sobrenadante y repita el paso 7.4.4.8.
      10. Retire el sobrenadante y deje secar durante 3 minutos a temperatura ambiente para eliminar los rastros de etanol.
      11. Retire la placa del imán y agregue 22 μL de agua a la muestra. Pipetea hacia arriba y hacia abajo 10x para mezclar agua y cuentas.
      12. Incubar las muestras durante 3 min a temperatura ambiente.
      13. Transfiera la placa de nuevo al imán e incube durante 3 minutos o hasta que la solución esté clara.
      14. Transfiera 20 μL de la muestra a un tubo de PCR. Tenga cuidado de que no se transfieran cuentas.
   5. Secuencia de amplicon de ADN purificado por secuenciación sanger.
   6. Cargue archivos de secuencia .ab1 para muestras tratadas y de control (no tratadas) en Seguimiento de indels por descomposición (TIDE)¹⁶ para cuantificar indels en el sitio de destino.

Resultados

Aislamiento de hepatocitos primarios plateables del hígado
El proceso general de perfusión hepática y aislamiento de hepatocitos se ilustra en la Figura 1. En este experimento, se utilizaron ratones C57BL6 / 6J de tipo salvaje de 8 a 10 semanas de edad. Se espera que el procedimiento produzca 20-50 × 10⁶ células por ratón con una viabilidad entre el 85% y el 95%. Si la viabilidad es <70%, se debe seguir el tratamiento con percoll para eliminar las célula...

Discusión

Los pasos descritos en el protocolo para el aislamiento de hepatocitos son desafiantes y requieren práctica para la competencia. Hay varios pasos clave para el aislamiento exitoso de hepatocitos del hígado. En primer lugar, la canulación adecuada de la vena cava inferior es esencial para la perfusión hepática completa. La ausencia de blanqueamiento en el hígado después de la perfusión indica desplazamiento del catéter (Tabla 1). La vena cava inferior (perfusión retrógrada) fue canulada en el p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural	USA Scientific	1402-4700
6-well Collagen Plates	Advanced Biomatrix	5073
accuSpin Micro 17R	Fisher Scientific	13-100-675
All-in-one Fluorescent Microscope	Keyence	BZ-X810
Analog Vortex Mixer	VWR	97043-562
ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL	ThermoFisher Scientific	2079GPK
Automated Cell Counter	Bio-Rad Laboratories	TC20
Blue Wax Dissection Tray	Braintree Scientific Inc.	DTW1	9" x 6.5" x 1/2"+F21
Cell scraper/lifter	Argos Technologies	UX-04396-53	Non-pyrogenic, sterile
Conical tubes (15 mL)	Fisher Scientific	339650
Conical tubes (50 mL)	Fisher Scientific	14-432-22
Cotton applicators	Fisher Scientific	22-363-170
Curved scissors	Cooper Surgical	62131
Disposable Petri Dishes	Falcon	351029	100mm,sterile
Disposable Petri Dishes	VWR	25373-100	35mm, sterile
Epoch Microplate Spectrophotometer	BioTek Instruments	250082
Falcon Cell strainer (70 µm)	Fisher Scientific	08-771-2
Forceps	Cooper Surgical	61864	Euro-Med Adson Tissue Forceps
IV catheters	BD	382612	24 G x 0.75 in
IV infusion set	Baxter	2C6401
MyFuge 12 Mini Centrifuge	Benchmark Scientific	1220P38
Needles	Fisher Scientific	05-561-20	25 G
Nucleofector 2b Device	Lonza	AAB-1001	Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes
Peristaltic Pump	Masterflex	HV-77120-42	10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC
Precision pump tubing	Masterflex	HV-96410-14	25 ft, silicone
Primaria Culture Plates	Corning Life Sciences	353846	Nitrogen-containing tissue culture plates
Serological Pipets (25 mL)	Fisher Scientific	12-567-604
Syringes	BD	329464	1 mL, sterile
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories	1861096
Water bath	ALT	27577	Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3	IDT	1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL	Fisher Scientific	NC9959336
CleanCap Cas9 mRNA	Trilink Biotechnologies	L-7606-100
CleanCap EGFP mRNA	Trilink Biotechnologies	L-7201-100
Corning Matrigel Matrix	Corning Life Sciences	356234
DMEM	ThermoFisher Scientific	11885076	Low glucose, pyruvate
Ethanol 70%	VWR	71001-652
Fetal bovine serum	Thermoscientific	26140-079
Hepatocyte Maintenance Medium (MM)	Lonza	MM250
Hepatocyte Plating Medium (PM)	Lonza	MP100
Mouse Albumin ELISA Kit	Fisher Scientific	NC0010653
Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit	Lonza	VPL-1004
OneTaq HotStart DNA Polymerase	New England Biolabs	M0481L
PBS 10x pH 7.4	Thermoscientific	70011-044	No calcium or magnesium chloride
Percoll (PVP solution)	Santa Cruz Biotechnology	sc-500790A
Periodic acid	Sigma-Aldrich	P7875-25G
Permount Mounting Medium	VWR	100496-550
QuickExtract DNA Extraction Solution	Lucigen Corporation	QE05090
Schiff’s fuchsin-sulfite reagent	Sigma-Aldrich	S5133
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056	Phenol red
Vybrant MTT Cell Viability Assay	ThermoFisher Scientific	V13154
Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized)			Stable at 4 °C for 2 months
EBSS	Fisher Scientific	14155063	Complete to 200 mL
EGTA (0.5 M)	Bioworld	40520008-1	200 µL
HEPES (pH 7.3, 1 M)	ThermoFisher Scientific	AAJ16924AE	2 mL
Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized)			Stable at 4 °C for 2 months
CaCl2·2H20 (1.8 mM)	Sigma	C7902-500G	360 µL of 1 M stock
EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)	Fisher Scientific	14-155-063	Complete to 200 mL
HEPES (1 M)	ThermoFisher Scientific	AAJ16924AE	2 mL
MgSO4·7H20 (0.8 mM)	Sigma	30391-25G	160 µL of 1 M stock
Perfusion Solution 3			Prepared fresh prior to use
Solution 2			50 mL
Liberase	Roche	5401127001	0.094 Wunsch units/mL
Mouse Anesthetic Cocktail
Acepromzine			0.25 mg/mL final concentration
Ketamine			7.5 mg/mL final concentration
Xylazine			1.5 mg/mL final concentration
Software	URL
Benchling	https://www.benchling.com/
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Tracking of Indels by Decomposition	https://tide.nki.nl/