JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, primer fare hepatositlerini karaciğerden izole etme ve karaciğerin kalıtsal bir metabolik hastalığı ile ilişkili terapötik bir hedef geni bozmak için CRISPR-Cas9'u ribonükleoproteinler ve mRNA olarak elektroporasyon tekniklerini açıklar. Tarif edilen yöntemler, elektroporasyondan sonra yüksek canlılık ve yüksek düzeyde gen modifikasyonu ile sonuçlanır.

Özet

Bu protokol, primer fare hepatositlerini izole etmek için hızlı ve etkili bir yöntemi ve ardından CRISPR-Cas9'un ribonükleoproteinler (RNP'ler) ve mRNA olarak elektroporasyon aracılı olarak verilmesini açıklar. Primer fare hepatositleri, karaciğer başına 50 × 106 hücreye kadar yüksek verim ve% >85 hücre canlılığı ile sonuçlanan üç aşamalı retrograd perfüzyon yöntemi kullanılarak izole edildi. Bu protokol, hepatositlerin kaplanması, boyanması ve kültürlenmesi için ayrıntılı talimatlar sağlar. Sonuçlar, elektroporasyonun, yeşil floresan protein (GFP)-pozitif hücrelerin yüzdesi ve fare hepatositlerinde% >35'lik mütevazı hücre canlılığı ile ölçüldüğü gibi% 89'luk yüksek bir transfeksiyon verimliliği sağladığını göstermektedir.

Bu yaklaşımın yararlılığını göstermek için, hidroksifenilpiruvat dioksijenaz genini hedef alan CRISPR-Cas9, karaciğerin kalıtsal bir metabolik hastalığı (IMD) ile ilgili terapötik bir geni bozmak için prensip kanıtı gen düzenlemesi olarak birincil fare hepatositlerine elektroporate edildi. RNP'ler için% 78'lik daha yüksek bir hedef üzerinde düzenleme, mRNA ile% 47 düzenleme verimliliğine kıyasla gözlenmiştir. Hepatositlerin işlevselliği, CRISPR-Cas9'un RNP'ler ve mRNA olarak verilmesinin, primer fare hepatositlerinde karşılaştırılabilir hücre canlılığı ile sonuçlandığını gösteren bir albümin testi kullanılarak in vitro olarak değerlendirildi. Bu protokol için umut verici bir uygulama, karaciğeri etkileyen insan genetik hastalıkları için fare modellerinin üretilmesidir.

Giriş

Karaciğerin IMD'leri, toksik metabolitlerin birikmesine yol açan metabolizmada rol oynayan çok önemli bir hepatik enzimin eksikliği ile karakterize genetik bozukluklardır. Tedavi olmadan, karaciğerin IMD'leri organ yetmezliği veya erken ölümle sonuçlanır 1,2. Karaciğer IMD'leri olan hastalar için tek küratif seçenek, donör organların düşük mevcudiyeti ve prosedürü takiben immünsüpresif tedaviden kaynaklanan komplikasyonlar nedeniyle sınırlı olan ortopik karaciğer transplantasyonudur 3,4. Organ Tedarik ve Transplantasyon Ağı tarafından toplanan son verilere göre, karaciğer nakli bekleme listesindeki yetişkin hastaların sadece% 40-46'sı bir organ alırken, bu hastaların% 12.3'ü bekleme listesindeyken ölmektedir5. Ayrıca, tüm nadir karaciğer hastalıklarının sadece% 5'inde FDA onaylı bir tedavivardır 6. Karaciğerin IMD'leri için yeni tedavilere kritik bir ihtiyaç olduğu açıktır. Bununla birlikte, yeni tedavi seçenekleri geliştirmek için uygun hastalık modelleri gereklidir.

İn vitro ve in vivo sistemleri kullanarak insan hastalıklarının modellenmesi, etkili tedavilerin geliştirilmesi ve karaciğerin IMD'lerinin patolojisinin incelenmesi için bir engel olmaya devam etmektedir. Nadir karaciğer hastalığı olan hastalardan hepatositlerin elde edilmesi zordur7. Hayvan modelleri, hastalık patolojisi hakkında bir anlayış geliştirmek ve terapötik stratejileri test etmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, bir engel, ölümcül mutasyonlar taşıyan embriyolardan modeller üretmektir. Örneğin, Jag1 geninin 5′ ucuna yakın 5 kb'lik bir dizinin homozigot delesyonlarını içeren embriyolarla Alagille Sendromu'nun (ALGS) fare modellerini oluşturma girişimleri, embriyoların erken ölümüyle sonuçlandı8. Ek olarak, embriyonik kök hücrelerde gen düzenleme ile fare modelleri oluşturmak zaman ve kaynak yoğunolabilir 9. Son olarak, mutasyonlar hedeflenen dokunun dışında ortaya çıkacak ve hastalığın incelenmesini engelleyebilecek kafa karıştırıcı değişkenlere yol açacaktır9. Somatik gen düzenleme, karaciğer dokusunda daha kolay düzenlemeye izin verir ve embriyonik kök hücreleri kullanarak modeller üretmekle ilgili zorlukları atlar.

Elektroporasyon, hücre zarını geçirgenleştirmek için yüksek voltajlı akımlar uygulayarak CRISPR-Cas9'un doğrudan çekirdeğe verilmesini sağlar ve insan embriyonik kök hücreleri, pluripotent kök hücreler ve nöronlar gibi transfeksiyon tekniklerine aykırı olanlar da dahil olmak üzere birçok hücre tipiyle uyumludur10,11,12 . Bununla birlikte, düşük canlılık, elektroporasyonun potansiyel bir dezavantajıdır; prosedürün optimize edilmesi, toksisiteyi sınırlarken yüksek düzeyde doğum sağlayabilir13. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, CRISPR-Cas9 bileşenlerinin birincil fare ve insan hepatositlerine elektroporasyonunun fizibilitesini oldukça verimli bir yaklaşım olarak göstermektedir14. Hepatositlerde Ex vivo elektroporasyon, karaciğerin insan IMD'leri için yeni fare modelleri üretmek için uygulanma potansiyeline sahiptir.

Bu protokol, fare hepatositlerini karaciğerden izole etmek ve daha sonra Cas9 proteini ve sentetik tek kılavuzlu RNA'dan (sgRNA) oluşan RNP kompleksleri olarak CRISPR-Cas9'u elektroporize etmek için ayrıntılı bir adım adım prosedür sağlar veya Cas9 mRNA, yüksek düzeyde hedef gen düzenlemesi elde etmek için sgRNA ile birleştirilmiştir. Ek olarak, protokol, CRISPR-Cas9'un yeni izole edilmiş fare hepatositlerine elektroporasyonunu takiben gen düzenleme verimliliğini, canlılığını ve işlevselliğini ölçmek için yöntemler sağlar.

Protokol

Hayvan deneylerinin tümü, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi yönergelerine ve Clemson Üniversitesi'ndeki onaylanmış protokollere uygun olarak gerçekleştirildi. Cerrahi prosedürler anestezi uygulanan vahşi tip C57BL/6J farelerde 8-10 haftalıkken yapıldı.

1. Hayvan cerrahisi

  1. Çözeltilerin ve aletlerin hazırlanması
    NOT: Perfüzyon solüsyonları ve anestezi kokteyli tarifleri Malzeme Tablosunda gösterilmiştir.
    1. Perfüzyon Çözeltisi 1 (HEPES, EGTA ve EBSS), Perfüzyon Çözeltisi 2'yi (HEPES, EGTA, EBSS, CaCl 2 ve MgSO4) ve Perfüzyon Çözeltisi 3'ü (Çözüm2 ve Liberaz) hazırlayın. Çözeltilerin iyi karıştırıldığından emin olun.
    2. Su banyosunu 42 ° C'ye ayarlayın ve işleme başlamadan önce Perfüzyon Çözeltileri 1, 2 ve 3'ü en az 30 dakika ısıtın ve su banyosunda tutun.
      NOT: Perfüzyon Çözeltileri 1 ve 2, kalsiyumu şelatlayacak ve karaciğerdeki kanı temizleyecektir. Perfüzyon Çözeltisi 3, hücre dışı matrisi ayrıştırmak için sindirim enzimi liberaz içerir.
    3. Konik tüplere 150 mL DMEM + %10 fetal sığır serumu (FBS) yerleştirin ve buz üzerinde tutun.
      NOT: Bu ortam, hücreleri karaciğer kapsülünden serbest bırakmak ve izole hepatositleri sırasıyla adım 2.1 ve 2.2'de yıkamak için kullanılacaktır.
    4. Santrifüjü 4 °C'ye ayarlayın.
    5. Borunun her iki ucunu %70 etanol ile dolu bir şişeye yerleştirerek ve etanolün dönüşümünü üç kez yaparak pompa borusunu sterilize edin.
    6. Boruyu damıtılmış suyla yıkayın ve boşaltın.
    7. Boruyu önceden ısıtılmış 30 mL Perfüzyon Çözeltisi 1, ardından 8 mL Perfüzyon Çözeltisi 2 ile doldurun. Boruda hala daha fazla sıvı için yer varsa, borunun geri kalanını Perfüzyon Çözeltisi 3 ile doldurun. Boruya hava kabarcıkları girmesini önlemek için farklı bir perfüzyon çözeltisine geçerken pompayı durdurun.
    8. Perfüzyon çözeltilerini sıcak tutmak için fazla boruyu 42 °C su banyosuna yerleştirin.
    9. Pompa borusunun ucunu, su banyosunda tutulurken Perfüzyon Çözeltisi 3 içeren konik tüpe yerleştirin.
      NOT: Bu adım, pompanın perfüzyon sırasında Perfüzyon Çözeltisi 3 ile sürekli olarak dolmasını sağlamak için gereklidir.
  2. Hayvan hazırlığı
    1. Anestezik kokteyli intraperitoneal olarak 10-11.7 μL / g vücut ağırlığı dozunda enjekte ederek fareyi anestezi altına alın. Anestezik kokteyl 7.5 mg / mL ketamin, 0.25 mg / mL asepromazin ve 1.5 mg / mL ksilazin nihai konsantrasyonuna sahiptir.
    2. Farenin nefes almasını izleyin ve farenin ağrıya tepki vermediğini kontrol edin. Farenin dakikada ~ 55-65 nefes alma hızına sahip olmasını, ayak parmaklarının sıkışmasına tepki vermemesini ve sarkık bir kuyruğu olmasını bekleyin. Ek olarak, kapalı gözün medial tarafındaki cilde hafifçe dokunarak palpebral (yanıp sönme) refleksini kontrol edin. Fare yanıp sönerse veya göz kasları seğirirse, tüm anestezik kokteylin dozunu 5-10 μL arttırın.
    3. Fareyi sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve uzuvları pimler veya bant kullanarak yüzeye sabitleyin (Ek Şekil S1).
    4. Karnı% 70 etanol ile püskürtün ve bir pamuk topu kullanarak kurulayın.
  3. Karaciğer perfüzyonu
    1. Makas kullanarak karın derisinde U şeklinde bir yanal kesi yapın ve deliği yanlardan genişletin.
    2. Cildi göğüs kafesine açmaya devam edin.
    3. Makas kullanarak, karın boşluğunu göğüs kafesine kadar maruz bırakmak için periton boyunca kesin, herhangi bir organı kesmemeye dikkat edin. Forsepsin arkasını veya makasın künt yüzeyini kullanarak bağırsakları sağ tarafa hareket ettirin. İnferior vena kava ve portal veni tanımlayın (Ek Şekil S1).
    4. Önceden ısıtılmış perfüzyon solüsyonunu kateterden temizlemek için pompayı çalıştırın.
    5. Pompayı durdurun ve tüm hava sistemden atıldıktan sonra kateteri çıkarın. Katetere bağlı iğnenin ucunu inferior vena kavaya damara 10°-20° açıyla yerleştirin. İğneyi kateterden çıkarın ve kateteri damara paralel bir hareketle yavaşça damarın içine itin.
      NOT: Kullanıcı, damardaki uygun kanülasyonu doğrulamak için kateterdeki kanın geri dönüşünü gözlemlemelidir.
    6. Kateteri damarın içine daha fazla hareket ettirmeden tüpü kateterle bağlayın.
    7. Pompayı 2 mL/dak debi ile çalıştırın. Perfüzyonun başarılı olduğunun bir işareti olarak karaciğerin hemen soluklaşmasını bekleyin.
    8. Portal damarı makas kullanarak kesin.
    9. Akış hızını kademeli olarak 5 mL / dak'ya yükseltin.
    10. Drenajı engellemek ve iyi perfüzyonu kolaylaştırmak için forseps veya pamuklu çubuk kullanarak yaklaşık kesim bölgesindeki portal vene periyodik olarak 3 s basınç uygulayın.
    11. Perfüzyon Çözeltisi 3 aktıktan sonra, karaciğerin elastikiyetini dikkatlice izleyin. Karaciğerin yumuşayıp yumuşamadığını belirlemek için, karaciğeri pamuklu çubukla veya forseps ile hafifçe bastırın ve karaciğerde girintilerin oluşup oluşmadığını kontrol edin. Hücre canlılığının kaybını önlemek için aşırı perfüzyon yapmamaya dikkat edin.
    12. Karaciğer yumuşatıldıktan sonra (30-50 mL Perfüzyon Çözeltisi 3 aktıktan sonra meydana gelir), pompayı durdurun, kateteri çıkarın ve karaciğeri dikkatlice diseke edin. Karaciğeri buz gibi soğuk DMEM +% 10 FBS ortamı içeren 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Safra kesesini tüketin, içeriğini dökmemeye dikkat edin. Olası kan pıhtılarını nazikçe çıkarmak için Petri kabını döndürün.
    13. Karaciğeri buz gibi soğuk DMEM +% 10 FBS ortamı içeren yeni bir Petri kabına aktarın.

2. Hepatosit izolasyonu

  1. Karaciğer kapsülünden hücreleri serbest bırakın.
    1. Petri kabını buz üzerine yerleştirin ve iki çift steril forseps kullanarak, karaciğer kapsülünü tüm loblarda yavaşça parçalayın. Hepatositleri serbest bırakmak için bir hücre kaldırıcı veya forseps kullanarak karaciğeri ortamda yavaşça döndürün. Karaciğer çok küçülene ve süspansiyon kahverengi ve opak hale gelene kadar bu harekete devam edin.
    2. Karaciğer dokusunun kalıntılarını plakadan çıkarın ve düşük hıza ayarlanmış 25 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu 100 μm'lik bir hücre süzgeci ile donatılmış 50 mL'lik bir konik tüpe (buz üzerinde önceden soğutulmuş) dikkatlice aktarın.
    3. Petri kabına taze, buz gibi soğuk DMEM +% 10 FBS ortamı ekleyerek kalan hücreleri yüzeyden yıkayın ve toplayın ve 50 mL konik tüpe aktarın. Tüm hücreler toplanana kadar bu adımı yineleyin.
  2. Hepatositleri parankimal olmayan hücrelerden yıkayın ve saflaştırın.
    1. 50 mL konik tüpte toplanan hücreleri, düşük yavaşlamada veya herhangi bir fren olmadan 5 dakika boyunca 4 ° C'de 50 × g'da santrifüj yapın.
    2. Enkaz ve parankimal olmayan hücreler içeren süpernatantı atın ve tüpü yavaşça döndürerek kalan süpernatanttaki peleti yeniden askıya alın. Pelet yeniden askıya alındıktan sonra, 30 mL taze, buz gibi soğuk DMEM +% 10 FBS ortamı ekleyin.
    3. Santrifüjlemeyi (adım 2.2.1) ve yıkamayı (adım 2.2.3) üç kez tekrarlayın.
    4. Son hücre peletini 10 mL buz gibi soğuk DMEM + %10 FBS ortamında yeniden askıya alın.
      NOT: Peletin yeniden askıya alınması için kullanılan ortamın hacmi, pelet boyutuna bağlıdır. Pelet 15 mm'den önemli ölçüde küçükse, 1-5 mL buz gibi soğuk DMEM +% 10 FBS ortamı kullanın.
  3. Hücre canlılığı ölçümü
    1. Bir mikrofüj tüpünde, 350 μL Hepatosit Kaplama Ortamına (PM) 50 μL% 0.4 Tripan Mavisi çözeltisi ekleyin. Ardından, son 1:5 seyreltme yapmak için 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipet ekleyin.
    2. Bir hemositometre kullanarak hücre yoğunluğunu ve canlılığını sayın. Sayma sırasında, hepatosit süspansiyonunu buzun üzerine yerleştirin ve ardından hepatositlerin yerleşmesini önlemek için buz kovasını 30 rpm'ye ayarlanmış bir yörüngesel çalkalayıcıya yerleştirin.
    3. Hücre canlılığı% <70 ise, aşağıdaki Percoll tedavisi ve santrifüjleme adımlarını izleyin.
      1. Percoll'u 10x fosfat tamponlu salin (PBS) ile 9: 1 oranında seyreltin.
      2. Hepatosit süspansiyonunu seyreltilmiş Percoll ile 1: 1 oranında karıştırın.
      3. 10 dakika boyunca 200 × g'da 4 ° C'de santrifüj.
      4. Ölü hücreler içeren süpernatantı atın. Peleti buz gibi soğuk DMEM +% 10 FBS ortamında yeniden askıya alın.
      5. Hücreleri tekrar sayın.
  4. Hepatositlerin plakalanabilirlik açısından test edilmesi
    1. Kollajen I kaplı 6 delikli plakalar üzerindeki hücrelerin bir kısmını 0.5 × 106 hücre yoğunluğunda 1.5 mL önceden ısıtılmış PM kullanarak mL başına plakalayın.
    2. Elektroporasyon yapmaya hazır olana kadar kalan hücreleri yörüngesel bir çalkalayıcıdayken buz üzerinde tutun.
    3. Hücre plakasını 37 C'de su ceketli bir CO2 inkübatöre yerleştirin Homojen kaplama sağlamak için plakayı kuzeyden güneye ve doğudan batıya doğru yatay ve dikey olarak yavaşça hareket ettirin. Hareketi her 1,5 saatte bir iki kez daha tekrarlayın.
    4. Kaplamadan sonra 3 saatte hücre bağlantısını doğrulayın.
      NOT: Hücrelerin en az% 60'ı, kaliteli hepatositlerin bir göstergesi olarak plakaya yapışmalıdır.
    5. Hücreleri kültürde tutmak için kaplamadan sonra 24 saatte ortamı önceden ısıtılmış Hepatosit Bakım Ortamına (MM) değiştirin.
  5. Glikojen boyama
    1. Hücreler 6 delikli kollajen I kaplı plakalara bağlandıktan sonra, harcanan ortamı kültürlenmiş hücrelerden çıkarın.
    2. Hücreleri buz gibi soğuk etanolde 10-15 dakika sabitleyin.
    3. Steril su ile iyice yıkayın.
    4. 5 dakika boyunca% 1 sulu periyodik asit içinde inkübe edin ve daha sonra steril suyla yıkayın.
    5. % 100 Schiff Reaktifinde 30 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Schiff reaktifi, hücrelere eklenmeden önce seyreltilmemelidir.
    6. 10 dakika boyunca üç kez suyla yıkayın.
    7. Montaj ortamına monte edin.
    8. Parlak alan ayarında mikroskop kullanarak görüntü.

3. CRISPR-Cas9 gen düzenlemesi için sgRNA'lar tasarlayın

NOT: Bu bölümde, karaciğerin IMD'si ile ilgili terapötik bir hedef geni bozmak için prensip kanıtı gen düzenlemesi olarak fare hidroksifenilpiruvat dioksijenaz (Hpd) genini hedef alan bir sgRNA'nın tasarımı açıklanmaktadır.

  1. Başvurulan yazılım15'i kullanarak Hpd'yi hedefleyen kılavuz dizisini tasarlayın.
  2. Ensembl Genome Browser ile Hpd dizisini doğrulayın.
  3. gRNA'yı tasarlamak için aşağıdaki parametreleri kullanın: 20 nükleotidin tek kılavuz uzunluğu ve bir NGG (N herhangi bir nükleotid olabilir) protospacer-bitişik motif (PAM) dizisi.
  4. Hpd'deki ekzon 3'ten bir hedef bölge seçin.
  5. Hedef bölgeden Hedef ve Hedef Dışı Puanlarla kılavuz dizilerinin bir listesini oluşturun.
    NOT: Hedef Üzerinde Puan, verilen tasarım için öngörülen hedef üzerinde düzenleme verimliliğini gösterir: daha yüksek bir puan, daha yüksek düzenleme verimliliği ile ilişkilidir. Hedef Dışı Puan, kılavuz dizisinin özgüllüğü ile ilişkilidir: daha yüksek bir puan, hedef dışı düzenleme olasılığının daha düşük olduğunu gösterir. İdeal olarak her iki puan da yüksek olmalıdır: Hedef Üstü Puan >60 ve Hedef Dışı Puan >50.
  6. En yüksek Hedef İçi ve Hedef Dışı Puanlara sahip kılavuz dizisini seçin. Kılavuz dizisini içeren sgRNA'nın kimyasal olarak sentezlenmesini sağlayın.

4. Elektroporasyon ve hücre kültürü

  1. CRISPR-Cas9 substratlarının, ortamlarının, hücrelerinin ve elektroporasyon cihazının hazırlanması
    1. Beraberindeki tüm takviyeyi PM'ye ekleyin ve 37 ° C su banyosunda 10 dakika boyunca ısıtın.
    2. Güç düğmesine basarak elektroporasyon cihazını açın ve ekranda T-028 programı görünene kadar x düğmesine ve ardından aşağı ok düğmesine basarak elektroporasyon programını ayarlayın.
    3. Altı kuyucuklu kollajen I kaplı plakalara 1,5 mL PM ekleyerek elektroporatörlü hepatositler için hedef kuyuları hazırlayın. Plakaları kullanıma hazır olana kadar 37 °C'lik bir inkübatörde inkübe edin.
    4. Beraberindeki tüm takviyeyi elektroporasyon tampon çözeltisine ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Elektroporasyon tamponunun son kullanma tarihini şişe üzerinde etiketleyin (ek ekleme tarihinden 3 ay sonra).
    5. Elektroporasyon kaplarını ambalajdan çıkarın ve her numune için etiketleyin.
    6. PCR bölünmüş şeritli tüplerde, 30 μg sgRNA'yı 300 pmol Cas9 proteini ile birleştirerek Cas9 RNP komplekslerini hazırlayın ve kompleksleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Cas9 mRNA'yı, 30 μg sgRNA'yı 4 μL Cas9 mRNA (1 μg / μL) ile birleştirerek hazırlayın. mRNA-sgRNA karışımını elektroporasyona kadar buz üzerinde saklayın. Floresan mikroskobu kullanarak başarılı elektroporasyonu doğrulamak için ayrı ayrı 1.0 μg eGFP mRNA içeren bir tüp hazırlayın.
    7. Santrifüj 1.2 × 4 ° C'de 2 dakika boyunca 100 × g'da elektroporasyon reaksiyonu başına 106 hücre.
    8. Süpernatantı hücre peletinden çıkarın ve tüp duvarının yan tarafı boyunca reaksiyon başına 100 μL elektroporasyon çözeltisi ekleyin. Elektroporasyon çözeltisindeki hepatositleri, tüpü elle hafifçe sallayarak yeniden askıya alın.
  2. CRISPR-Cas9 RNP'lerin ve mRNA'nın hepatositlere elektroporasyonu
    1. Hepatositler elektroporasyon çözeltisinde eşit olarak dağılmış olarak göründüğünde, hepatosit süspansiyonunun 100 μL'sini Cas9 komplekslerini içeren şerit tüplere aktarın.
      NOT: Hücre canlılığını korumak için hepatositleri aktarırken geniş delikli pipet uçları kullanın.
    2. Şeridin içeriğini bir elektroporasyon kabına iyice aktarın.
    3. Nükleovette kabını elektroporasyon cihazındaki yuvaya yerleştirin. X düğmesine basarak hepatositleri elektroporat yapın. Elektroporasyondan sonra, cihazda Tamam yazan bir ekranın açılmasını bekleyin. X düğmesine tekrar basın ve kabı çıkarın.
    4. Elektroporated kabı 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
    5. Elektroporasyon kabına 500 μL önceden ısıtılmış PM ekleyin.
    6. Elektroporasyon reaksiyonunun 300 μL'sini, önceden ısıtılmış plaka üzerindeki her bir hedefe iyi bir şekilde aktarın.
      NOT: Elektroporasyon reaksiyonu başına iki hedef kuyu bulunmalıdır. Gen düzenleme verimliliğini ölçmek için bir kuyu kullanılacaktır; diğer kuyu MTT ve albümin tahlilleri için kullanılacaktır.
    7. Hepatositlerin kuyunun merkezinde birikmesini önlemek için, plakaları kuzeyden güneye ve doğudan batıya doğru yatay ve dikey olarak hafifçe hareket ettirerek hücreleri dağıtın. Plakanın hareket ettirilirken inkübatör rafı ile teması koruduğundan emin olun. Elektropoze hepatositleri kapladıktan sonra bu hareketi 15, 30, 45, 60 ve 90 dakikada tekrarlayın.
    8. Plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    9. Hücreleri kapladıktan 24 saat sonra gen düzenleme analizi için belirlenen kuyucuklardan ortamı çıkarın ve 0.25 mg / mL bazal membran matris kaplaması ile değiştirin.
      NOT: Dondurucuda saklanırsa, membran matrisini 4 °C'ye aktarın ve çözülmesine izin verin. Bodrum membran matrisi 10 ° C'nin üzerinde katı olduğundan, bazal membran matrisinin kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde veya 4 ° C'de kalması çok önemlidir.

5. 0.25 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyon vermek için MM ile karıştırılacak membran matrisinin hacmini hesaplayın

NOT: 6 delikli bir plaka için, kuyu başına 2 mL kaplama gereklidir.

6. Membran matrisinin hesaplanan hacmini buz gibi soğuk MM'ye ekleyin ve 10 kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın

  1. Bindirme karışımını yavaşça hücrelerin üzerine pipetleyin ve plakayı 37 °C inkübatöre geri yerleştirin.
  2. Ortamı her 24 saatte bir taze bakım ortamıyla değiştirin.
  3. Kaplamadan sonra 24 saatte, şartlandırılmış ortamı MTT ve albümin tahlilleri için iyi belirlenmiş olandan aktarın. Albümin tahlilini yapmaya hazır olana kadar şartlandırılmış ortamı bir mikrofüj tüpünde saklayın. MTT testi için adım 7.1'e geçin.
    NOT: Kısa süreli depolama için (bir günden az) şartlandırılmış ortamı 4 °C'de saklayın. Daha uzun süre saklamak için, ortamı -80 ° C'de saklayın.

7. Elektroporated fare hepatositlerinde teslimat verimliliği, canlılık ve hedef üzerinde düzenleme analizi

  1. MTT testi kullanılarak canlılık ölçümü
    1. Bir 5 mg MTT şişesine 1 mL PBS ekleyerek 12 mM MTT stok çözeltisi hazırlayın.
    2. Kuyucuklara 150 μL MTT stok çözeltisi ekleyin ve 24 saat boyunca inkübe edin.
    3. Kuluçkadan sonra, her bir oyuğa 1,5 mL sodyum dodesil sülfat-hidroklorür (SDS-HCl) çözeltisi ve ardından karıştırmak için pipet ekleyin.
    4. Plakayı 37 ° C'de 4 saat boyunca inkübe edin ve canlı hücreleri belirtmek için ortamın renginde berraktan mora doğru bir değişiklik olup olmadığına bakın.
    5. Her numuneyi bir pipet kullanarak tekrar karıştırın ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak emiciliği 570 nm'de okuyun.
    6. Eq (1) kullanarak Cas9 ile işlenmiş numuneler için normalleştirilmiş canlılığı hesaplayın:
      figure-protocol-17632 (1)
  2. Hepatosit fonksiyonelliğini değerlendirmek için albümin testi
    1. Şartlandırılmış ortamın 50 μL'sini, albümin kiti tarafından sağlanan plakadaki kuyucuklara aktarın. Kuyuları örtün ve oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya yatırın.
    2. Kuyucukları 200 μL yıkama tamponu ile 5 kat yıkayın.
    3. Her bir kuyucuğu kağıt mendil üzerine boşaltmak için plakayı ters çevirin ve birkaç kez dokunun.
    4. Yıkadıktan sonra, albümin tahlil kitinde sağlanan biyotinillenmiş antikorun 50 μL'sini her bir oyuğa ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.
    5. Kuyuları yıkamak için 5.2.2-5.2.3 adımlarını tekrarlayın.
    6. Her bir kuyucuğa albümin tahlil kitinde sağlanan 50 μL streptavidin-peroksidaz ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    7. Adım 5.2.2'yi yineleyin.
    8. Albümin tahlil kitinde sağlanan kromojen substratından kuyu başına 50 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Eşit karıştırmayı sağlamak için plakaya hafifçe dokunun. Pipet ucu ile hava kabarcıklarını çıkarın.
    9. Son olarak, her bir kuyucuğa 50 μL durdurma çözeltisi ekleyin ve fonksiyonel hücreleri belirtmek için sarıdan maviye bir renk değişikliği arayın.
    10. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak emiciliği 450 nm'de okumaya hemen devam edin.
  3. eGFP mRNA ile elektroporated kuyucuklarda dağıtım verimliliğini tahmin edin.
    1. Elektroporasyondan 24 saat sonra hepatositlerin faz kontrastını ve yeşil floresan görüntülerini yakalayın. Kuyunun farklı yerlerinde üç fotoğraf çekin.
    2. Hücrelerin resimlerini ImageJ'ye yükleyin. Görüntü sekmesinin altında, görüntüyü gri tonlamaya dönüştürmek için Type | 16-bit (16 bit) seçeneğini belirleyin.
    3. Görüntüdeki hücre yapılarını vurgulamak için, Görüntü sekmesinin altında | Ayarla'yı seçin Eşik. Hücreleri vurgulamak için kaydırıcıyı ayarlayın.
    4. İşlem sekmesi altında, arka plan gürültüsünü gidermek için Arka Planı Çıkar'ı seçin.
    5. Analiz sekmesini tıklatarak hücreleri sayın ve ardından Parçacıkları analiz et'i seçin. Sayılan parçacıkların listesini oluşturmak için Tamam'ı tıklatın.
    6. Yeşil floresan görüntülerindeki sayılan parçacıkların sayısını, karşılık gelen faz kontrast görüntüsündeki sayılan parçacıkların sayısına bölerek GFP-pozitif hücrelerin yüzdesini hesaplayın.
  4. Hedef üzerindeki Cas9 aktivitesinin analizi
    1. Elektroporatörlü hücrelerden genomik DNA'yı ayıklayın.
      1. Elektroporasyondan 3 gün sonra plakadan ortamı çıkarın ve 500 μL% 0.25 tripsin ekleyin. 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Hepatositlerin plakadan ayrılmasını sağlamak için inkübasyondan sonra birkaç kez pipet.
      2. Tripsinize hücre süspansiyonunu mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 800 × g'da bir masa üstü santrifüjde döndürün. Eğirdikten sonra, tüpleri pelet için inceleyin.
      3. Tripsin içeren süpernatantı pipetle çekerek çıkarın. Pelet'i rahatsız etmediğinizden emin olun. Peleti 80 μL DNA ekstraksiyon çözeltisinde yeniden askıya alın. Peletin görülmesi zorsa, tüpün içeriğini 50 μL DNA ekstraksiyon çözeltisinde yeniden askıya alın.
      4. Peletin yeniden askıya alınmasını sağlamak için 30 sn boyunca vorteks. Süspansiyonu PCR bölünmüş şeritli tüplere aktarın ve termal döngüleyiciye yerleştirin. 95 °C'de 15 dakika ve 68 °C'de 8 dakika boyunca çalıştırın.
    2. Hedef lokusu PCR-yükseltin.
    3. DNA polimeraz kullanarak Hpd hedef bölgesini yükseltmek için aşağıda açıklanan prosedürü izleyin.
      1. 0.5 μL 10 mM dNTP, 0.5 μL 10 μM İleri astar, 0.5 μL 10 μM Ters astar, 0.125 μL Taq polimeraz, hepatositlerden ekstrakte edilen 5 μL genomik DNA ve 18.375 μL nükleaz içermeyen su içeren bir reaksiyon hazırlayın. Astar dizileri için Ek Tablo S1'e bakınız.
      2. Çözeltinin tüpün dibinde olduğundan emin olmak için PCR karışımını kısaca vorteks yapın ve hızlı bir şekilde santrifüj yapın.
      3. PCR karışımını bir termal döngüye yerleştirin ve şu koşullar altında yükseltin: denatürasyon için 30 s için 94 °C, 30 s için 94 °C'lik 30 döngü, tavlama için 45 s için 57 °C, 1 dakika için 68 °C ve 5 dakika için 68 °C'lik son uzatma.
        NOT: PCR reaksiyonu için tavlama sıcaklığı, astarların bileşimine bağlı olarak değişecektir. PCR yapmadan önce bir erime sıcaklığı hesaplayıcısı kullanmayı düşünün.
      4. Doğru ürün boyutunu onaylamak için, PCR ürünlerinin 3 μL'sini 2 μL su ve 1 μL 6x boya ile karıştırın. % 1,5'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın ve doğru ürün boyutunu onaylayın.
    4. Manyetik boncuklar kullanarak DNA'yı arındırın.
      NOT: Spin sütunları PCR temizliği için de kullanılabilir. Aşağıda manyetik boncuklar kullanarak PCR ürünlerini saflaştırmak için prosedürler bulunmaktadır.
      1. Manyetik boncukları 4 ° C'den çıkarın ve oda sıcaklığına ulaşmalarını sağlayın.
      2. Kısaca vorteks yapın ve PCR karışımını hızlı bir şekilde santrifüj edin.
      3. PCR karışımının hacmine× 1.8'e eşit bir boncuk hacmi ekleyin. Çözeltinin eşit şekilde karıştırıldığından emin olmak için PCR-boncuk karışımını 10x pipetleyin.
      4. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
      5. PCR-boncuk karışımını bir PCR plakasına aktarın ve manyetik bir plakaya yerleştirin.
      6. Mıknatıs üzerindeki plakayı 5 dakika boyunca inkübe edin. 5 dakika sonra, çözeltinin net olduğunu ve bir sonraki adıma geçmeden önce boncukların mıknatısa bağlandığını kontrol edin.
      7. Süper natantı atın.
      8. Kuyuya 200 μL% 70 etanol ekleyin ve 30 s boyunca inkübe edin.
        NOT: DNA kaybını önlemek için% 70 etanol, temizliği yapmadan kısa bir süre önce hazırlanmalıdır.
      9. Üst öğeyi atın ve adım 7.4.4.8'i yineleyin.
      10. Süpernatantı çıkarın ve etanol izlerini gidermek için oda sıcaklığında 3 dakika kurumaya bırakın.
      11. Plakayı mıknatıstan çıkarın ve numuneye 22 μL su ekleyin. Su ve boncukları karıştırmak için 10 kat yukarı ve aşağı pipet.
      12. Numuneleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca inkübe edin.
      13. Plakayı mıknatısa geri aktarın ve 3 dakika boyunca veya çözelti temizlenene kadar inkübe edin.
      14. Numunenin 20 μL'sini bir PCR tüpüne aktarın. Boncukların taşınmamasına dikkat edin.
    5. Sanger dizilimi ile DNA amplikonunu saflaştırdı.
    6. Hedef bölgedeki delleri ölçmek için işlenen ve kontrol edilen (işlenmemiş) örnekler için .ab1 dizi dosyalarını Ayrıştırma Yoluyla Kutucukların İzlenmesi (TIDE)16'ya yükleyin.

Sonuçlar

Kaplanabilir primer hepatositlerin karaciğerden izolasyonu
Karaciğer perfüzyonu ve hepatosit izolasyonunun genel süreci Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu deneyde vahşi tip, 8-10 haftalık C57BL6/6J fareler kullanıldı. Prosedürün% 85 ila% 95 arasında bir canlılığa sahip fare başına 20-50 × 106 hücre vermesi beklenmektedir. Canlılık% <70 ise, ölü hücreleri çıkarmak için perkollasyon tedavisi izlenmelidir. Yeni izole edilmiş hepatositler k...

Tartışmalar

Hepatosit izolasyonu protokolünde belirtilen adımlar zordur ve yeterlilik için pratik gerektirir. Karaciğerden başarılı hepatosit izolasyonu için birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, inferior vena kavanın uygun şekilde kanülasyonu tam karaciğer perfüzyonu için gereklidir. Perfüzyon sonrası karaciğerde beyazlatma olmaması kateterin yer değiştirmesini gösterir (Tablo 1). İnferior vena kava (retrograd perfüzyon) portal venden (antegrad perfüzyon) daha basit ve daha erişilebil...

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmek için rakip çıkarları yoktur.

Teşekkürler

RNC, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS), Amerikan Karaciğer Hastalıkları Çalışmaları Derneği Vakfı ve Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği tarafından desteklenen Güney Carolina Biyomühendislik Rejenerasyon ve Doku Oluşumu Merkezi Pilot hibesinden P30 GM131959, 2021000920 hibe numaraları altında fon aldı. ve sırasıyla 2022000099. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği veya Amerikan Karaciğer Hastalıkları Çalışmaları Vakfı'nın resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Şekil 1'in şeması BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, naturalUSA Scientific1402-4700
6-well Collagen PlatesAdvanced Biomatrix5073
accuSpin Micro 17RFisher Scientific13-100-675
All-in-one Fluorescent MicroscopeKeyenceBZ-X810
Analog Vortex MixerVWR97043-562
ART Wide BORE filtered tips 1,000 µLThermoFisher Scientific2079GPK
Automated Cell CounterBio-Rad LaboratoriesTC20
Blue Wax Dissection TrayBraintree Scientific Inc.DTW19" x 6.5" x 1/2"+F21
Cell scraper/lifterArgos TechnologiesUX-04396-53Non-pyrogenic, sterile
Conical tubes (15 mL)Fisher Scientific339650
Conical tubes (50 mL)Fisher Scientific14-432-22
Cotton applicatorsFisher Scientific22-363-170
Curved scissorsCooper Surgical62131
Disposable Petri DishesFalcon351029100mm,sterile
Disposable Petri DishesVWR25373-10035mm, sterile
Epoch Microplate SpectrophotometerBioTek Instruments250082
Falcon Cell strainer (70 µm)Fisher Scientific08-771-2
ForcepsCooper Surgical61864Euro-Med Adson Tissue Forceps
IV catheters BD38261224 G x 0.75 in
IV infusion setBaxter2C6401
MyFuge 12 Mini CentrifugeBenchmark Scientific1220P38
NeedlesFisher Scientific05-561-2025 G
Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes
Peristaltic PumpMasterflex HV-77120-4210 to 60 rpm; 90 to 260 VAC
Precision pump tubingMasterflexHV-96410-1425 ft, silicone
Primaria Culture PlatesCorning Life Sciences353846Nitrogen-containing tissue culture plates
Serological Pipets (25 mL)Fisher Scientific12-567-604
SyringesBD3294641 mL, sterile
T100 Thermal CyclerBio-Rad Laboratories1861096
Water bathALT27577Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3IDT1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mLFisher ScientificNC9959336
CleanCap Cas9 mRNATrilink BiotechnologiesL-7606-100
CleanCap EGFP mRNATrilink BiotechnologiesL-7201-100
Corning Matrigel MatrixCorning Life Sciences356234
DMEMThermoFisher Scientific11885076Low glucose, pyruvate
Ethanol 70%VWR71001-652
Fetal bovine serumThermoscientific26140-079
Hepatocyte Maintenance Medium (MM)LonzaMM250
Hepatocyte Plating Medium (PM)LonzaMP100
Mouse Albumin ELISA KitFisher ScientificNC0010653
Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector KitLonzaVPL-1004
OneTaq HotStart DNA PolymeraseNew England BiolabsM0481L
PBS 10x pH 7.4 Thermoscientific70011-044No calcium or magnesium chloride
Percoll (PVP solution)Santa Cruz Biotechnologysc-500790A
Periodic acidSigma-AldrichP7875-25G
Permount Mounting MediumVWR100496-550
QuickExtract DNA Extraction SolutionLucigen CorporationQE05090
Schiff’s fuchsin-sulfite reagentSigma-AldrichS5133
Trypsin-EDTA (0.25%)ThermoFisher Scientific25200056Phenol red
Vybrant MTT Cell Viability AssayThermoFisher ScientificV13154
Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) Stable at 4 °C for 2 months
EBSSFisher Scientific14155063Complete to 200 mL
EGTA (0.5 M)Bioworld40520008-1200 µL
HEPES (pH 7.3, 1 M)ThermoFisher ScientificAAJ16924AE2 mL 
Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) Stable at 4 °C for 2 months
CaCl2·2H20 (1.8 mM)SigmaC7902-500G360 µL of 1 M stock 
EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)Fisher Scientific14-155-063Complete to 200 mL
HEPES (1 M)ThermoFisher ScientificAAJ16924AE2 mL 
MgSO4·7H20 (0.8 mM)Sigma30391-25G160 µL of 1 M stock
Perfusion Solution 3 Prepared fresh prior to use
Solution 250 mL
LiberaseRoche54011270010.094 Wunsch units/mL
Mouse Anesthetic Cocktail 
Acepromzine0.25 mg/mL final concentration
Ketamine7.5 mg/mL final concentration
Xylazine1.5 mg/mL final concentration
SoftwareURL
Benchlinghttps://www.benchling.com/
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Tracking of Indels by Decompositionhttps://tide.nki.nl/

Referanslar

  1. Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
  2. Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).
  3. Arnon, R., et al. Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience. Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).
  4. Maiorana, A., et al. Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia. Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).
  5. . OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx (2019)
  6. Fabris, L., Strazzabosco, M. Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities. Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).
  7. Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).
  8. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  9. Lima, A., Maddalo, D. SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research. Frontiers in Oncology. 11, 1117 (2021).
  10. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  11. Ye, L., et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).
  12. Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
  13. Hoban, M. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells. Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).
  14. Rathbone, T., et al. Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes. The CRISPR Journal. , (2022).
  15. . Benchling [Biology Software] Available from: https://benchling.com (2022)
  16. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
  17. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
  18. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).
  19. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  20. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
  21. Kim, Y., et al. Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure. Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).
  22. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  23. Lattanzi, A., et al. Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements. Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).
  24. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
  25. Grompe, M., Tanguay, R. M. . Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. , 215-230 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır