Cas9 Ribonükleoproteinlerin ve mRNA'nın Yeni İzole Edilmiş Primer Fare Hepatositlerine Elektroporasyon Aracılı Verilmesi

Özet

Bu protokol, primer fare hepatositlerini karaciğerden izole etme ve karaciğerin kalıtsal bir metabolik hastalığı ile ilişkili terapötik bir hedef geni bozmak için CRISPR-Cas9'u ribonükleoproteinler ve mRNA olarak elektroporasyon tekniklerini açıklar. Tarif edilen yöntemler, elektroporasyondan sonra yüksek canlılık ve yüksek düzeyde gen modifikasyonu ile sonuçlanır.

Özet

Bu protokol, primer fare hepatositlerini izole etmek için hızlı ve etkili bir yöntemi ve ardından CRISPR-Cas9'un ribonükleoproteinler (RNP'ler) ve mRNA olarak elektroporasyon aracılı olarak verilmesini açıklar. Primer fare hepatositleri, karaciğer başına 50 × 10⁶ hücreye kadar yüksek verim ve% >85 hücre canlılığı ile sonuçlanan üç aşamalı retrograd perfüzyon yöntemi kullanılarak izole edildi. Bu protokol, hepatositlerin kaplanması, boyanması ve kültürlenmesi için ayrıntılı talimatlar sağlar. Sonuçlar, elektroporasyonun, yeşil floresan protein (GFP)-pozitif hücrelerin yüzdesi ve fare hepatositlerinde% >35'lik mütevazı hücre canlılığı ile ölçüldüğü gibi% 89'luk yüksek bir transfeksiyon verimliliği sağladığını göstermektedir.

Bu yaklaşımın yararlılığını göstermek için, hidroksifenilpiruvat dioksijenaz genini hedef alan CRISPR-Cas9, karaciğerin kalıtsal bir metabolik hastalığı (IMD) ile ilgili terapötik bir geni bozmak için prensip kanıtı gen düzenlemesi olarak birincil fare hepatositlerine elektroporate edildi. RNP'ler için% 78'lik daha yüksek bir hedef üzerinde düzenleme, mRNA ile% 47 düzenleme verimliliğine kıyasla gözlenmiştir. Hepatositlerin işlevselliği, CRISPR-Cas9'un RNP'ler ve mRNA olarak verilmesinin, primer fare hepatositlerinde karşılaştırılabilir hücre canlılığı ile sonuçlandığını gösteren bir albümin testi kullanılarak in vitro olarak değerlendirildi. Bu protokol için umut verici bir uygulama, karaciğeri etkileyen insan genetik hastalıkları için fare modellerinin üretilmesidir.

Giriş

Karaciğerin IMD'leri, toksik metabolitlerin birikmesine yol açan metabolizmada rol oynayan çok önemli bir hepatik enzimin eksikliği ile karakterize genetik bozukluklardır. Tedavi olmadan, karaciğerin IMD'leri organ yetmezliği veya erken ölümle sonuçlanır ^1,2. Karaciğer IMD'leri olan hastalar için tek küratif seçenek, donör organların düşük mevcudiyeti ve prosedürü takiben immünsüpresif tedaviden kaynaklanan komplikasyonlar nedeniyle sınırlı olan ortopik karaciğer transplantasyonudur ^3,4. Organ Tedarik ve Transplantasyon Ağı tarafından toplanan son veri....

Protokol

Hayvan deneylerinin tümü, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi yönergelerine ve Clemson Üniversitesi'ndeki onaylanmış protokollere uygun olarak gerçekleştirildi. Cerrahi prosedürler anestezi uygulanan vahşi tip C57BL/6J farelerde 8-10 haftalıkken yapıldı.

1. Hayvan cerrahisi

1. Çözeltilerin ve aletlerin hazırlanması
   NOT: Perfüzyon solüsyonları ve anestezi kokteyli tarifleri Malzeme Tablosunda gösterilmiştir.
   1. Perfüzyon Çözeltisi 1 (HEPES, EGTA ve EBSS), Perfüzyon Çözeltisi 2'yi (HEPES, EGTA, EBSS, CaCl 2 ve MgSO₄) ve Perfüzyon Çözeltisi 3'ü (Çözüm₂ ve Liberaz) h....

Sonuçlar

Kaplanabilir primer hepatositlerin karaciğerden izolasyonu
Karaciğer perfüzyonu ve hepatosit izolasyonunun genel süreci Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu deneyde vahşi tip, 8-10 haftalık C57BL6/6J fareler kullanıldı. Prosedürün% 85 ila% 95 arasında bir canlılığa sahip fare başına 20-50 × 10⁶ hücre vermesi beklenmektedir. Canlılık% <70 ise, ölü hücreleri çıkarmak için perkollasyon tedavisi izlenmelidir. Yeni izole edilmiş hepatositler k.......

Tartışmalar

Hepatosit izolasyonu protokolünde belirtilen adımlar zordur ve yeterlilik için pratik gerektirir. Karaciğerden başarılı hepatosit izolasyonu için birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, inferior vena kavanın uygun şekilde kanülasyonu tam karaciğer perfüzyonu için gereklidir. Perfüzyon sonrası karaciğerde beyazlatma olmaması kateterin yer değiştirmesini gösterir (Tablo 1). İnferior vena kava (retrograd perfüzyon) portal venden (antegrad perfüzyon) daha basit ve daha erişilebil.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural	USA Scientific	1402-4700
6-well Collagen Plates	Advanced Biomatrix	5073
accuSpin Micro 17R	Fisher Scientific	13-100-675
All-in-one Fluorescent Microscope	Keyence	BZ-X810
Analog Vortex Mixer	VWR	97043-562
ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL	ThermoFisher Scientific	2079GPK
Automated Cell Counter	Bio-Rad Laboratories	TC20
Blue Wax Dissection Tray	Braintree Scientific Inc.	DTW1	9" x 6.5" x 1/2"+F21
Cell scraper/lifter	Argos Technologies	UX-04396-53	Non-pyrogenic, sterile
Conical tubes (15 mL)	Fisher Scientific	339650
Conical tubes (50 mL)	Fisher Scientific	14-432-22
Cotton applicators	Fisher Scientific	22-363-170
Curved scissors	Cooper Surgical	62131
Disposable Petri Dishes	Falcon	351029	100mm,sterile
Disposable Petri Dishes	VWR	25373-100	35mm, sterile
Epoch Microplate Spectrophotometer	BioTek Instruments	250082
Falcon Cell strainer (70 µm)	Fisher Scientific	08-771-2
Forceps	Cooper Surgical	61864	Euro-Med Adson Tissue Forceps
IV catheters	BD	382612	24 G x 0.75 in
IV infusion set	Baxter	2C6401
MyFuge 12 Mini Centrifuge	Benchmark Scientific	1220P38
Needles	Fisher Scientific	05-561-20	25 G
Nucleofector 2b Device	Lonza	AAB-1001	Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes
Peristaltic Pump	Masterflex	HV-77120-42	10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC
Precision pump tubing	Masterflex	HV-96410-14	25 ft, silicone
Primaria Culture Plates	Corning Life Sciences	353846	Nitrogen-containing tissue culture plates
Serological Pipets (25 mL)	Fisher Scientific	12-567-604
Syringes	BD	329464	1 mL, sterile
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories	1861096
Water bath	ALT	27577	Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3	IDT	1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL	Fisher Scientific	NC9959336
CleanCap Cas9 mRNA	Trilink Biotechnologies	L-7606-100
CleanCap EGFP mRNA	Trilink Biotechnologies	L-7201-100
Corning Matrigel Matrix	Corning Life Sciences	356234
DMEM	ThermoFisher Scientific	11885076	Low glucose, pyruvate
Ethanol 70%	VWR	71001-652
Fetal bovine serum	Thermoscientific	26140-079
Hepatocyte Maintenance Medium (MM)	Lonza	MM250
Hepatocyte Plating Medium (PM)	Lonza	MP100
Mouse Albumin ELISA Kit	Fisher Scientific	NC0010653
Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit	Lonza	VPL-1004
OneTaq HotStart DNA Polymerase	New England Biolabs	M0481L
PBS 10x pH 7.4	Thermoscientific	70011-044	No calcium or magnesium chloride
Percoll (PVP solution)	Santa Cruz Biotechnology	sc-500790A
Periodic acid	Sigma-Aldrich	P7875-25G
Permount Mounting Medium	VWR	100496-550
QuickExtract DNA Extraction Solution	Lucigen Corporation	QE05090
Schiff’s fuchsin-sulfite reagent	Sigma-Aldrich	S5133
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056	Phenol red
Vybrant MTT Cell Viability Assay	ThermoFisher Scientific	V13154
Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized)			Stable at 4 °C for 2 months
EBSS	Fisher Scientific	14155063	Complete to 200 mL
EGTA (0.5 M)	Bioworld	40520008-1	200 µL
HEPES (pH 7.3, 1 M)	ThermoFisher Scientific	AAJ16924AE	2 mL
Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized)			Stable at 4 °C for 2 months
CaCl2·2H20 (1.8 mM)	Sigma	C7902-500G	360 µL of 1 M stock
EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)	Fisher Scientific	14-155-063	Complete to 200 mL
HEPES (1 M)	ThermoFisher Scientific	AAJ16924AE	2 mL
MgSO4·7H20 (0.8 mM)	Sigma	30391-25G	160 µL of 1 M stock
Perfusion Solution 3			Prepared fresh prior to use
Solution 2			50 mL
Liberase	Roche	5401127001	0.094 Wunsch units/mL
Mouse Anesthetic Cocktail
Acepromzine			0.25 mg/mL final concentration
Ketamine			7.5 mg/mL final concentration
Xylazine			1.5 mg/mL final concentration
Software	URL
Benchling	https://www.benchling.com/
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Tracking of Indels by Decomposition	https://tide.nki.nl/