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Method Article
在这里,我们描述了一组基于荧光蛋白的细胞器标记物在出芽酵母酿酒酵母的活细胞成像中的应用。
出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae 是研究细胞器功能和动力学的经典模型系统。在我们以前的工作中,我们为主要细胞器和内膜结构构建了基于荧光蛋白的标记物,包括细胞核、内质网 (ER)、高尔基体、内体、液泡、线粒体、过氧化物酶体、脂滴和自噬体。此处介绍的方案描述了在酵母中使用这些标记物的程序,包括用于酵母转化的 DNA 制备、转化体的选择和评估、荧光显微镜观察和预期结果。该文本面向从其他背景进入酵母细胞器研究领域的研究人员。涵盖了基本步骤,以及有关显微镜硬件注意事项和几个常见陷阱的技术说明。它为人们通过活细胞荧光显微镜观察酵母亚细胞实体提供了一个起点。这些工具和方法可用于识别蛋白质亚细胞定位并跟踪延时成像中感兴趣的细胞器。
亚细胞区室化成膜结合的细胞器是真核细胞组织的常见原则。每个细胞器都执行特定的功能。与真核生物学的许多其他方面一样,出芽酵母酿酒酵母一直是阐明细胞器组织和动力学基本原理的经典模型系统。示例包括蛋白质分泌途径、过氧化物酶体蛋白质输入途径和自噬途径的开创性发现 1,2,3。
在典型的营养丰富的条件下,快速生长的酵母细胞包含内质网 (ER)、早期高尔基体、晚期高尔基体/早期内体、晚期内体、液泡和线粒体。一些过氧化物酶体、脂滴和自噬体(甚至比前两个少,主要是 Cvt 囊泡型,存在于营养丰富的条件下4),但不像在特定培养条件下(富含脂质的培养基、饥饿培养基等)那样突出。与其他常见的真核生物模型相比,酵母细胞非常小;典型酵母细胞的直径约为 5 μm,而大多数动物和植物细胞的直径为数十微米。因此,在通常包含单个贴壁动物细胞的同一成像区域中,通常会看到数十个处于不同细胞周期阶段的酵母细胞。除了大小差异外,酵母细胞器形态还具有一些奇特的特征。在超微结构水平上,酵母 ER 由片状和小管组成,就像其他系统一样。在荧光显微镜下,酵母内质网表现为两个环,中间有一些相互连接的结构。内环是核内质网,它与核膜连续,外环是外周内质网,它是位于质膜下方的管状网络5。与植物细胞类似,但与动物细胞不同,杂交细胞器,晚期高尔基体/早期内体,位于分泌途径和内吞途径之间的交汇处 6,7。在形态学上,酵母高尔基体分散在细胞质中。液泡在功能上类似于动物细胞中的溶酶体。它们通常占据细胞质的大部分,并经历频繁的裂变和融合。除了使用荧光共定位标记物外,液泡膜至少可以通过两个标准与核内质网区分开来:液泡膜通常比核内质网更圆,并且 DIC 中液泡的凹陷外观也比细胞核更明显。
通常,我们使用一组基于荧光蛋白的标记物来可视化活酵母细胞中的上述细胞器(表 1)。这些细胞器标记物的保真度和功能已得到实验验证 7,8。这些标记物构建体旨在将荧光蛋白嵌合体盒引入酵母基因组中。如下所述,在准备酵母转化时,通过酶消化或 PCR 扩增产生线性 DNA 片段 7,8。线性 DNA 片段通过同源重组整合到基因组中。对于本协议中描述的质粒,采用三种类型的设计。在第一种类型中,覆盖了大多数质粒,通常可以获得携带多个构建体拷贝的转化体。这通常是不希望的,因为它在转化体之间引入了表达和可能的功能变化。单拷贝转化子需要通过本方案中描述的成像、免疫印迹或精心设计的 PCR 测试来鉴定。在第二种类型中,涵盖 GFP-Sed5、GFP-Pep12 和 GFP-Atg8,在单倍体酵母细胞中仅产生单拷贝整合。第一种类型和第二种类型都保持了标记基因的内源拷贝在基因组中的完整。第三种类型的质粒设计,涵盖 Sec7-2GFP 和 Vph1-2GFP,旨在引入 C 端敲入,导致嵌合体成为相应标记基因的唯一拷贝。
在这里,我们描述了利用这些细胞器标志物的程序,提供了示例性显微镜图像,并讨论了针对酵母细胞器成像新手研究人员的预防措施。
1. 酵母菌株构建
2. 荧光显微镜:一般程序和单时间点成像
3. 延时成像
注:延时成像的过程与单时间点成像的过程在两个方面不同:样品制备和成像参数。
4. 图像堆栈的可视化和整合拷贝数的评估
细胞器形态和动力学会随着酵母细胞对外部和内部信号的反应而变化。在这里,我们提供了对数中期酵母细胞器的代表性图像(图 3A、B)。如前所述,几种细胞器具有其独特的形态特征,因此无需与其他细胞器标志物进行广泛比较即可轻松识别。这些包括 ER、线粒体和液泡。请注意,在一些实验室菌株中,包括我们在这里展示的菌株,...
此处描述的协议为从其他研究领域进入的人探索酵母细胞器成像提供了一个简单的起点。在继续讨论具体主题之前,我们想再次强调,需要避免在成像软件中过度使用自动功能。显微镜图像不仅仅是漂亮的图片,它们是科学数据,因此应相应地处理它们的采集和解释。认真选择图像集合参数并熟悉 16 位图像与 8 位图像的概念尤为重要。
该协议列出了...
作者要感谢 Xie 实验室的成员在手稿准备方面的慷慨帮助。这项工作得到了中国国家自然科学基金(91957104 号)、上海市教育委员会(2017-01-07-00-02-E00035)和上海市科学技术委员会(22ZR1433800)的支持。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adenine | Sangon Biotech | A600013 | |
Casaminoacid | Sangon Biotech | A603060 | |
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma Aldrich | L7647 | |
D-Glucose | Sangon Biotech | A501991 | |
Fiji | https://fiji.sc/ | ||
Glass-bottom petri dish | NEST | 706001 | Φ35 mm |
ImajeJ | https://imagej.net/ | ||
Inverted florescence microscope | Olympus | IX83 equipped with UPLXAPO 100X oil immersion objective, Lumencor Spectra X light source, and Hamamatsu Orca Flash4.0 LT camera. | |
L-Histidine | Sangon Biotech | A604351 | |
L-Leucine | Sangon Biotech | A100811 | |
L-Lysine | Sangon Biotech | A602759 | |
L-Methionine | Sangon Biotech | A100801 | |
L-Tryptophan | Sangon Biotech | A601911 | |
Microscope cover glass | CITOTEST | 10222222C | 22 mm x 22 mm, 0.16–0.19 mm |
Microscope slides | CITOTEST | 1A5101 | 25 mm x 75 mm, 1–1.2 mm |
Peptone | Sangon Biotech | A505247 | |
Uracil | Sangon Biotech | A610564 | |
Visiview | Visitron System GmbH | https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html | |
Yeast extract | Sangon Biotech | A100850 | |
Yeast nitrogen base without amino acids | Sangon Biotech | A610507 | |
YNB without amino acids and ammonium sulfate | Sangon Biotech | A600505 |
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