使用荧光蛋白标记物可视化酵母细胞器

摘要

在这里，我们描述了一组基于荧光蛋白的细胞器标记物在出芽酵母酿酒酵母的活细胞成像中的应用。

摘要

出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae 是研究细胞器功能和动力学的经典模型系统。在我们以前的工作中，我们为主要细胞器和内膜结构构建了基于荧光蛋白的标记物，包括细胞核、内质网 （ER）、高尔基体、内体、液泡、线粒体、过氧化物酶体、脂滴和自噬体。此处介绍的方案描述了在酵母中使用这些标记物的程序，包括用于酵母转化的 DNA 制备、转化体的选择和评估、荧光显微镜观察和预期结果。该文本面向从其他背景进入酵母细胞器研究领域的研究人员。涵盖了基本步骤，以及有关显微镜硬件注意事项和几个常见陷阱的技术说明。它为人们通过活细胞荧光显微镜观察酵母亚细胞实体提供了一个起点。这些工具和方法可用于识别蛋白质亚细胞定位并跟踪延时成像中感兴趣的细胞器。

引言

亚细胞区室化成膜结合的细胞器是真核细胞组织的常见原则。每个细胞器都执行特定的功能。与真核生物学的许多其他方面一样，出芽酵母酿酒酵母一直是阐明细胞器组织和动力学基本原理的经典模型系统。示例包括蛋白质分泌途径、过氧化物酶体蛋白质输入途径和自噬途径的开创性发现 ^1,2,3。

在典型的营养丰富的条件下，快速生长的酵母细胞包含内质网 （ER）、早期高尔基体、晚期高尔基体/早期内体、晚期内体、液泡和线粒体。一些过氧化物酶体、脂滴和自噬体（甚至比前两个少，主要是 Cvt 囊泡型，存在于营养丰富的条件下⁴），但不像在特定培养条件下（富含脂质的培养基、饥饿培养基等）那样突出。与其他常见的真核生物模型相比，酵母细胞非常小;典型酵母细胞的直径约为 5 μm，而大多数动物和植物细胞的直径为数十微米。因此，在通常包含单个贴壁动物细胞的同一成像区域中，通常会看到数十个处于不同细胞周期阶段的酵母细胞。除了大小差异外，酵母细胞器形态还具有一些奇特的特征。在超微结构水平上，酵母 ER 由片状和小管组成，就像其他系统一样。在荧光显微镜下，酵母内质网表现为两个环，中间有一些相互连接的结构。内环是核内质网，它与核膜连续，外环是外周内质网，它是位于质膜下方的管状网络⁵。与植物细胞类似，但与动物细胞不同，杂交细胞器，晚期高尔基体/早期内体，位于分泌途径和内吞途径之间的交汇处 ^6,7。在形态学上，酵母高尔基体分散在细胞质中。液泡在功能上类似于动物细胞中的溶酶体。它们通常占据细胞质的大部分，并经历频繁的裂变和融合。除了使用荧光共定位标记物外，液泡膜至少可以通过两个标准与核内质网区分开来：液泡膜通常比核内质网更圆，并且 DIC 中液泡的凹陷外观也比细胞核更明显。

通常，我们使用一组基于荧光蛋白的标记物来可视化活酵母细胞中的上述细胞器（表 1）。这些细胞器标记物的保真度和功能已得到实验验证 ^7,8。这些标记物构建体旨在将荧光蛋白嵌合体盒引入酵母基因组中。如下所述，在准备酵母转化时，通过酶消化或 PCR 扩增产生线性 DNA 片段 ^7,8。线性 DNA 片段通过同源重组整合到基因组中。对于本协议中描述的质粒，采用三种类型的设计。在第一种类型中，覆盖了大多数质粒，通常可以获得携带多个构建体拷贝的转化体。这通常是不希望的，因为它在转化体之间引入了表达和可能的功能变化。单拷贝转化子需要通过本方案中描述的成像、免疫印迹或精心设计的 PCR 测试来鉴定。在第二种类型中，涵盖 GFP-Sed5、GFP-Pep12 和 GFP-Atg8，在单倍体酵母细胞中仅产生单拷贝整合。第一种类型和第二种类型都保持了标记基因的内源拷贝在基因组中的完整。第三种类型的质粒设计，涵盖 Sec7-2GFP 和 Vph1-2GFP，旨在引入 C 端敲入，导致嵌合体成为相应标记基因的唯一拷贝。

在这里，我们描述了利用这些细胞器标志物的程序，提供了示例性显微镜图像，并讨论了针对酵母细胞器成像新手研究人员的预防措施。

研究方案

1. 酵母菌株构建

1. 获得标记质粒和合适的酵母菌株。
   注：质粒可从 Addgene 获得。该方案以 TN124 （MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ：：LEU2）、BY4741（MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0） 和 DJ03 （BY4741 trp1Δ：：MET15） 为例。除了科学问题的性质之外，菌株选择的一个重要考虑因素是选择标记的兼容性。此处描述的细胞器标记质粒使用 URA3 和 TRP1 作为选择标记。因此，受体菌株的基因型需要为 ura3 和 trp1。否则，需要修改菌株或质粒。
2. 根据以下配方制备酵母培养基。
   注：SMD（合成最小葡萄糖;2% 葡萄糖，不含氨基酸的 0.67% 酵母氮碱 （YNB）、30 mg/L 腺嘌呤、30 mg/L 赖氨酸、30 mg/L 蛋氨酸、20 mg/L 组氨酸、20 mg/L 尿嘧啶、50 mg/L 色氨酸、50 mg/L 亮氨酸）。SMD+CA（添加 0.5% 酪蛋白氨基酸的 SMD）。YPD（酵母提取物蛋白胨葡萄糖;1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖）。SD-N（不含氮的合成葡萄糖;不含氨基酸和硫酸铵的 0.17% YNB，2% 葡萄糖）。请参阅讨论部分，了解有关选择培养基的注意事项。
3. 在转化步骤之前，通过细胞器标记质粒的酶消化或 PCR 扩增生成线性化 DNA 片段。
   注： 表 1 列出了从细胞器标记质粒生成线性片段的限制性内切酶位点和 PCR 引物。
4. 在液体 YPD 培养基中培养酵母细胞，并使用线性 DNA 片段转化酵母。
   注：可以使用常规的基于 LiAc 的方法⁹ 或其他选择的方法进行酵母转化。建议包括适当的转化对照，特别是没有质粒或质粒衍生 DNA 的阴性对照。
5. 在适当的选择板上于 30 °C 孵育 2-3 天（例如，对于 URA3 选择，使用 SMD-Ura 培养基）。
   注意：单个菌落大约需要 2 天才能出现。
6. 为了验证荧光嵌合体表达和整合拷贝数，从选择板中挑选八个菌落，在新的选择板上重新划线，并在 30 °C 下孵育。

2. 荧光显微镜：一般程序和单时间点成像

1. 将酵母细胞在 30 °C 的 SMD 液体培养基中振荡培养过夜。
2. 第二天早上，在分光光度计或读板器中测量酵母培养物在 600 nm 处的光密度（以下简称 OD₆₀₀）。
   注意：通过接种酵母的一些练习，通常可以确保在此阶段所有样品的 OD₆₀₀ 低于 2。如果最终浓度更高，建议在下一步中进一步稀释，并留出更多时间让酵母细胞恢复。
3. 使用新鲜培养基将酵母培养物稀释至约 0.2 OD₆₀₀ 。
4. 继续培养直到 OD₆₀₀ 达到约 0.8-1.0。
   注意：酵母的倍增时间约为 1.5-2 小时。
5. 将盖玻片放在平面上的薄纸上，将 5 μL 的 1 mg/mL 伴刀豆球蛋白 A 涂抹在盖玻片的顶部，等待 5 分钟（图 1A）¹⁰。
   注意：此准备步骤可以提前完成。
6. 将 100 μL 酵母培养物转移到盖玻片的顶部，等待 5 分钟。
7. 将盖玻片与支撑玻片结合，酵母细胞夹在中间;用适当的力按压以固定附件。
   注意：需要一些练习才能找到合适的压力，以便酵母细胞形成固定的单层但不被压碎（图 1B）。在此步骤中，液体介质将被下面的薄纸推出并吸收。
8. 将样品载玻片安装在显微镜载物台上。使用微分干涉对比 （DIC） 或相差 （PC） 照明定位并聚焦酵母细胞斑块。
   注：请勿使用荧光定位细胞;否则，信号可能会在数据收集之前被漂白。
9. 手动配置三组参数来收集图像 z 堆栈：z 切片、成像通道和曝光参数。
   注意：有关一个商业软件中参数设置的 GUI 示例，请参见 补充图 1 。确切的外观因软件平台而异，但选项或多或少相同。
   1. Z 切片：以 0.5 μm 步长收集 15 个切片的切片（覆盖 7 μm 深度，通常足以用于正常单倍体酵母细胞）。
   2. 成像通道：选择 DIC 或 PC 用于细胞轮廓，并根据需要选择合适的荧光通道。
   3. 激发光强度和曝光时间：根据样品设置激发光强度和曝光时间。
      注意：作为起点，使用 100% 的激发光强度和 100 ms 的曝光时间;如果随着 Z 堆栈收集的进展而光漂白变得明显，或者如果信号超过相机记录容量（即信号饱和），则降低光强度;如果信噪比较低，则增加光照强度。
10. 记下成像设置，并对所有要比较的样品使用相同的设置。
    注意：请勿对数据收集和图像可视化使用“自动”设置。将设置记录在实验记录中非常重要，这样就可以在以后的实验重复中重新应用完全相同的参数。一些显微镜控制软件应用程序能够保存和重新应用设置;即便如此，还是建议单独记录设置，因为软件配置文件可能会被同事无意中删除或修改。
11. 以 16 位多通道堆栈格式保存数据。
    注意：请勿另存为 8 位 RGB 图片（如果计算所有三种颜色，则另存为 24 位）。请参阅 图像可视化 部分（第 4 节），了解 8 位格式的限制。
12. 移动到下一个图像堆栈集合的完全不同的区域。
    注意：相邻区域可能已经经历过光漂白和光毒性。因此，从这些区域收集的图像堆栈可能会产生误导。

3. 延时成像

注：延时成像的过程与单时间点成像的过程在两个方面不同：样品制备和成像参数。

1. 样品制备
   1. 用 1 mg/mL 伴刀豆球蛋白 A 包被 35 mm 玻璃底培养皿，并等待 5 分钟或更长时间。
   2. 向培养皿中加入 1.5 mL 酵母液培养物，等待 5 分钟，让酵母细胞沉淀到玻璃表面。
   3. 使用移液管从培养皿边缘吸出液体培养基，然后用约 1 mL 新鲜培养基轻轻冲洗酵母沉淀物斑块，以去除不牢固附着的细胞。
   4. 重复冲洗 2-3 次。用移液管吸出，然后轻轻加入 2 mL 新鲜培养基。
2. 成像参数
   1. Z 切片：以 0.5 μm 步长收集 15 个切片的切片。
   2. 成像通道：根据需要选择。
   3. 激发光强度和曝光时间：使用最少的必要值来识别正在研究的亚细胞结构。
      注意：对于延时成像，重复照明的光漂白和光毒性限制了可以收集的时间点总数。因此，激发强度和曝光时间通常设置为较低的值，以便可以对更多时间点进行成像。
   4. 成像间隔：设置适合正在研究的生物过程的时间间隔。
      注意：例如，在饥饿条件下形成自噬体大约需要 5-10 分钟;最好使用 1 分钟或更短的间隔来跟踪其动态。在营养丰富的条件下，酵母细胞周期发生在小时尺度上;可以使用更长的间隔，例如 10-20 分钟。
3. 如果有合适的硬件，请将培养皿温度保持在 30 °C。
   注：酵母细胞中的大多数生物过程也可以在室温 （RT） 下成像，但通常速度较慢。

4. 图像堆栈的可视化和整合拷贝数的评估

1. 安装 Fiji 或 ImageJ 软件进行图像可视化和分析^11,12.
   注意：斐济是基于 ImageJ 的工具集合，适用于通用生物图像数据可视化和处理。对于此协议中列出的图像处理，没有额外插件的 ImageJ 就足够了。
2. 为图像显示和比较选择合适的参数。
   1. 在斐济，打开几个 z 堆栈图像。
   2. 将每个堆栈中的 z 位置拖动到中间部分（如果正在研究的结构在那里更直观，则拖动其他位置）。
   3. 转到 图像 > 调整 > 亮度/对比度 然后点击 重设.
   4. 在 亮度/对比度 （B&C） 窗口中，使用滚动条更改两个参数， 即最小值 和 最大值 ，以清楚地识别正在研究的结构。
      注意：通常 ，最小值设置为 接近空白区域中的平均值， 而最大值设置为 接近图像中的最大值。这些值可以从显示的直方图中推断出来（图 2A）。如果成像工作站经过色彩校准，则可以将最小值设置得稍微高一些，以隐藏更多的背景信号。
   5. 在亮度/对比度 （B&C） 窗口中，单击设置，然后在弹出窗口设置显示范围中选中传播到所有其他打开的图像复选框。
      注意：此作会将相同的亮度/对比度设置（包括最小值和最大值）应用于所有打开的图像，以便可以交叉比较图像。
   6. 查看不同的图像并滚动浏览每个图像中的 z 堆栈。如果图像在适当的深色背景和轻微的过曝饱和度下看起来不错，请记下 最小值 和 最大值 设置。
3. 对于多通道图像，为每个通道选择图像显示设置：
   1. 前往 图像 > 颜色 > 通道工具，选择 灰度 弹出窗口中的模式 通道.
   2. 浏览每个通道，为该通道选择合适的 亮度/对比度 ，然后记下设置。
   3. 调整亮度 /对比度 后，返回通道窗口并更改为 合成 模式，以便同时可视化多个通道。
      注意：可以在 Channels 中手动更改每个通道的伪彩色，以满足个人喜好。复选框用于显示/隐藏特定通道。
4. 如果需要，请使用 Channels 窗口中的复选框来显示或隐藏特定通道。
5. 如果需要，通过转到 Image > Stacks > Z Project（堆栈 Z 项目）生成堆栈投影。
   注意：有多种投影模式可用。最大强度是快速评估的不错选择。应考虑研究的性质，以确定是否应使用特定的投影模式或单个切片进行量化。投影也可以限制为选定的 z 切片，以减少离焦光的干扰。
6. 筛选单拷贝整合转化子。
   1. 在所有打开的图像中应用相同的 亮度/对比度 设置后，比较样品之间的图像强度以推断质粒积分数。
      注：应按照单时间点成像的一般程序获取图像，从在液体培养基中培养过夜开始。多拷贝集成（参见 图2B 中的菌落2和3示例）看起来比单拷贝的（ 图2B中的菌落1）亮得多。相比之下，单拷贝看起来彼此相似（图 2B）。
   2. 检查每个菌株的 8 个转化体的图像，确保使用相同的 Brightness/Contrast 设置。
   3. 重新划线并保存三个或更多单拷贝转化体以供后续研究。
7. 导出图像以进行演示。
   1. 转到 Image > Duplicate 以复制感兴趣的图像，并为其指定一个 name of choice。
   2. 前往 图像 > 键入 > 8 位 将副本从 16 位转换为 8 位并根据需要保存。
      注意：请注意，一旦应用了此设置，如果之前没有记下 亮度/对比度 设置，则没有简单的方法可以检索该信息，因此也无法在后续的图像可视化中重新应用相同的设置。这也是推荐进行上述复制作的原因。
   3. 要将 z 堆栈拆分为单个图像的集合，请转到 图像>堆栈 > 堆栈到图像 并根据需要保存。
      注意：在斐济，图像也可以裁剪到较小的区域。

结果

细胞器形态和动力学会随着酵母细胞对外部和内部信号的反应而变化。在这里，我们提供了对数中期酵母细胞器的代表性图像（图 3A、B）。如前所述，几种细胞器具有其独特的形态特征，因此无需与其他细胞器标志物进行广泛比较即可轻松识别。这些包括 ER、线粒体和液泡。请注意，在一些实验室菌株中，包括我们在这里展示的菌株，...

讨论

此处描述的协议为从其他研究领域进入的人探索酵母细胞器成像提供了一个简单的起点。在继续讨论具体主题之前，我们想再次强调，需要避免在成像软件中过度使用自动功能。显微镜图像不仅仅是漂亮的图片，它们是科学数据，因此应相应地处理它们的采集和解释。认真选择图像集合参数并熟悉 16 位图像与 8 位图像的概念尤为重要。

该协议列出了...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sangon Biotech	A600013
Casaminoacid	Sangon Biotech	A603060
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack bean)	Sigma Aldrich	L7647
D-Glucose	Sangon Biotech	A501991
Fiji			https://fiji.sc/
Glass-bottom petri dish	NEST	706001	Φ35 mm
ImajeJ			https://imagej.net/
Inverted florescence microscope	Olympus		IX83 equipped with UPLXAPO 100X oil immersion objective, Lumencor Spectra X light source, and Hamamatsu Orca Flash4.0 LT camera.
L-Histidine	Sangon Biotech	A604351
L-Leucine	Sangon Biotech	A100811
L-Lysine	Sangon Biotech	A602759
L-Methionine	Sangon Biotech	A100801
L-Tryptophan	Sangon Biotech	A601911
Microscope cover glass	CITOTEST	10222222C	22 mm x 22 mm, 0.16–0.19 mm
Microscope slides	CITOTEST	1A5101	25 mm x 75 mm, 1–1.2 mm
Peptone	Sangon Biotech	A505247
Uracil	Sangon Biotech	A610564
Visiview	Visitron System GmbH		https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html
Yeast extract	Sangon Biotech	A100850
Yeast nitrogen base without amino acids	Sangon Biotech	A610507
YNB without amino acids and ammonium sulfate	Sangon Biotech	A600505