Visualisation des organites de levure avec des marqueurs protéiques fluorescents

Résumé

Nous décrivons ici l’utilisation d’un ensemble de marqueurs d’organites à base de protéines fluorescentes dans l’imagerie de cellules vivantes de la levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae.

Résumé

La levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae, est un système modèle classique dans l’étude de la fonction et de la dynamique des organites. Dans nos travaux précédents, nous avons construit des marqueurs fluorescents à base de protéines pour les principaux organites et structures endomembranaires, y compris le noyau, le réticulum endoplasmique (RE), l’appareil de Golgi, les endosomes, les vacuoles, les mitochondries, les peroxysomes, les gouttelettes lipidiques et les autophagosomes. Le protocole présenté ici décrit les procédures d’utilisation de ces marqueurs chez la levure, y compris la préparation de l’ADN pour la transformation de la levure, la sélection et l’évaluation des transformants, l’observation microscopique fluorescente et les résultats attendus. Le texte s’adresse aux chercheurs qui entrent dans le domaine de l’étude des organites de levure à partir d’autres horizons. Les étapes essentielles sont abordées, ainsi que des notes techniques sur les considérations matérielles du microscope et plusieurs pièges courants. Il fournit un point de départ pour que les gens observent les entités subcellulaires de la levure par microscopie fluorescente à cellules vivantes. Ces outils et méthodes peuvent être utilisés pour identifier la localisation subcellulaire des protéines et suivre les organites d’intérêt en imagerie time-lapse.

Introduction

La compartimentation subcellulaire en organites membranaires est un principe commun dans l’organisation des cellules eucaryotes. Chaque organite remplit des fonctions spécifiques. Comme dans de nombreux autres aspects de la biologie eucaryote, la levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae, a été un système modèle classique pour élucider les principes de base de l’organisation et de la dynamique des organites. Parmi les exemples, citons les découvertes fondamentales dans la voie de sécrétion de protéines, la voie d’importation de protéines peroxysomales et la voie de l’autophagie ^1,2,3.

Dans des conditions typiques riches en nutriments, les cellules de levure à croissance rapide contiennent le réticulum endoplasmique (RE), le Golgi précoce, le Golgi tardif/endosomes précoces, les endosomes tardifs, les vacuoles et les mitochondries. Certains peroxysomes, gouttelettes lipidiques et autophagosomes (encore moins nombreux que les deux premiers, principalement de type vésicule Cvt, qui sont présents dans des conditions riches en nutriments⁴) sont également présents, mais pas aussi proéminents qu’ils le seraient dans des conditions de culture spécifiques (milieux riches en lipides, milieux de famine, etc.). Comparées à d’autres modèles eucaryotes courants, les cellules de levure sont assez petites ; Le diamètre d’une cellule de levure typique est d’environ 5 μm, contre des dizaines de micromètres pour la plupart des cellules animales et végétales. En conséquence, dans le même champ d’imagerie qui contient normalement une seule cellule animale adhérente, on voit normalement des dizaines de cellules de levure à différents stades du cycle cellulaire. Outre la différence de taille, la morphologie des organites de levure présente également des caractéristiques particulières. Au niveau ultrastructurel, la levure RE est composée de feuilles et de tubules, comme dans d’autres systèmes. Sous microscopie fluorescente, le RE de la levure se manifeste sous la forme de deux anneaux avec des structures interconnectées entre les deux. L’anneau intérieur est le RE nucléaire, qui est en continuité avec l’enveloppe nucléaire, et l’anneau extérieur est le RE périphérique, qui est un réseau tubulaire situé sous la membrane plasmique⁵. Semblable aux cellules végétales mais différent des cellules animales, un organite hybride, l’endosome de Golgi tardif/précoce, se trouve à l’intersection entre la voie sécrétoire et la voie endocytaire ^6,7. Morphologiquement, les appareils de Golgi de la levure sont dispersés dans le cytoplasme. Les vacuoles sont fonctionnellement analogues aux lysosomes dans les cellules animales. Ils occupent souvent de grandes parties du cytoplasme et subissent une fission et une fusion fréquentes. Outre l’utilisation de marqueurs de colocalisation fluorescents, la membrane vacuolaire peut être distinguée du RE nucléaire par au moins deux critères : la membrane vacuolaire est généralement plus arrondie que le RE nucléaire, et l’aspect concaverneux de la vacuole dans la CIVD est également plus prononcé que celui du noyau.

Régulièrement, nous utilisons un ensemble de marqueurs fluorescents à base de protéines pour visualiser les organites susmentionnés dans des cellules de levure vivantes (Tableau 1). La fidélité et la fonctionnalité de ces marqueurs d’organites ont été vérifiées expérimentalement ^7,8. Ces constructions de marqueurs sont destinées à introduire des cassettes de chimères protéiques fluorescentes dans le génome de la levure. Comme indiqué ci-dessous, en préparation de la transformation de la levure, des fragments d’ADN linéaires sont générés soit par digestion enzymatique, soit par amplification PCR ^7,8. Les fragments d’ADN linéaires sont intégrés dans le génome par recombinaison homologue. Pour les plasmides décrits dans ce protocole, trois types de conception sont utilisés. Dans le premier type, couvrant la majorité des plasmides, il est souvent possible d’obtenir des transformants portant plusieurs copies de la construction. Ceci est généralement indésirable car cela introduit des variations expressionnelles et éventuellement fonctionnelles entre les transformants. Les transformants à copie unique doivent être identifiés par l’imagerie décrite dans ce protocole, par immunobuvardage ou par des tests PCR soigneusement conçus. Dans le second type, couvrant GFP-Sed5, GFP-Pep12 et GFP-Atg8, seule l’intégration en copie unique est produite dans les cellules de levure haploïde. Le premier type et le second type conservent tous deux la copie endogène du gène marqueur intacte dans le génome. Un troisième type de conception de plasmide, couvrant Sec7-2GFP et Vph1-2GFP, est destiné à introduire des knock-ins C-terminaux, conduisant les chimères à être la seule copie du gène marqueur correspondant.

Nous décrivons ici la procédure d’utilisation de ces marqueurs d’organites, fournissons des images de microscopie exemplaires et discutons des précautions destinées aux chercheurs novices en imagerie d’organites de levure.

Protocole

1. Construction de la souche de levure

1. Obtenez des plasmides marqueurs et une souche de levure appropriée.
   REMARQUE : Les plasmides sont disponibles auprès d’Addgene. Ce protocole utilise TN124 (MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ ::LEU2), BY4741(MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0) et DJ03 (BY4741 trp1Δ ::MET15) comme exemples. Une considération importante pour le choix de la souche, outre la nature de la question scientifique, est la compatibilité des marqueurs de sélection. Les plasmides marqueurs d’organites décrits ici utilisent URA3 et TRP1 comme marqueurs de sélection. Par conséquent, le génotype de la souche réceptrice doit être ura3 et trp1. Sinon, il faut modifier la souche ou les plasmides.
2. Préparez les milieux de levure selon les recettes suivantes.
   REMARQUE : CMS (dextrose minimal synthétique ; 2 % de glucose, 0,67 % d’azote de levure (YNB) sans acides aminés, 30 mg/L d’adénine, 30 mg/L de lysine, 30 mg/L de méthionine, 20 mg/L d’histidine, 20 mg/L d’uracile, 50 mg/L de tryptophane, 50 mg/L de leucine). SMD+CA (SMD avec l’ajout de 0,5 % d’acides casaminés). YPD (Extrait de levure peptone dextrose ; 1 % d’extrait de levure, 2 % de peptone, 2 % de glucose). SD-N (dextrose synthétique sans azote ; 0,17 % YNB sans acides aminés et sulfate d’ammonium, 2 % de glucose). Veuillez vous référer à la section Discussion pour des considérations sur le choix du support.
3. Avant l’étape de transformation, générer des fragments d’ADN linéarisés par digestion enzymatique ou amplification PCR d’un plasmide marqueur d’organite.
   REMARQUE : Le tableau 1 répertorie les sites de l’enzyme de restriction et les amorces de PCR pour générer des fragments linéaires à partir des plasmides marqueurs d’organites.
4. Cultivez des cellules de levure dans un milieu liquide YPD et transformez la levure avec un fragment d’ADN linéaire.
   REMARQUE : La transformation de la levure peut être effectuée à l’aide de la méthode conventionnelle à base de LiAc⁹ ou d’autres méthodes de choix. Il est conseillé d’inclure des témoins appropriés pour la transformation, en particulier un témoin négatif sans plasmide ou ADN dérivé du plasmide.
5. Incuber sur une plaque de sélection appropriée (par exemple, pour la sélection URA3 , utilisez un milieu SMD-URA) à 30 °C pendant 2-3 jours.
   REMARQUE : Il faut environ 2 jours pour que des colonies uniques apparaissent.
6. Pour vérifier l’expression de la chimère fluorescente et le nombre de copies d’intégration, prélever huit colonies sur la plaque de sélection, refaire des traînées sur des plaques de sélection fraîches et incuber à 30 °C.

2. Microscopie à fluorescence : procédures générales et imagerie à point unique dans le temps

1. Cultiver des cellules de levure pendant la nuit dans un milieu liquide SMD à 30 °C en agitant.
2. Le lendemain matin, mesurez la densité optique d’une culture de levure à 600 nm (ci-après dénommée OD₆₀₀) à l’aide d’un spectrophotomètre ou d’un lecteur de plaques.
   REMARQUE : Avec un peu de pratique sur l’inoculation de levure, on peut généralement s’assurer que la DO₆₀₀ de tous les échantillons est inférieure à 2 à ce stade. S’il finit par être plus élevé, il est conseillé de diluer davantage à l’étape suivante et de laisser plus de temps aux cellules de levure pour récupérer.
3. Diluer la culture de levure à environ 0,2 OD₆₀₀ à l’aide d’un milieu frais.
4. Poursuivre l’élevage jusqu’à ce que la DO₆₀₀ atteigne environ 0,8-1,0.
   REMARQUE : Le temps de doublage de la levure est d’environ 1,5 à 2 h.
5. Placez un verre de protection sur du papier de soie sur une surface plane, étalez 5 μL de concanavaline A de 1 mg/mL sur la face supérieure du verre de couverture et attendez 5 min (Figure 1A)¹⁰.
   REMARQUE : Cette étape de préparation peut être effectuée à l’avance.
6. Transvasez 100 μL de culture de levure sur la face supérieure du verre de couverture et attendez 5 min.
7. Combinez le verre de couverture avec une lame de verre de support, avec les cellules de levure prises en sandwich entre les deux ; Appuyez avec la force appropriée pour fixer l’accessoire.
   REMARQUE : Il faut un peu de pratique pour trouver la bonne pression, de sorte que les cellules de levure forment une seule couche immobile mais ne sont pas écrasées (Figure 1B). Le milieu liquide sera expulsé et absorbé par le papier de soie sous-jacent au cours de cette étape.
8. Montez la lame d’échantillon sur la platine du microscope. Localisez et concentrez-vous sur un patch de cellules de levure à l’aide d’un éclairage à contraste interférentiel différentiel (DIC) ou à contraste de phase (PC).
   REMARQUE : N’utilisez pas la fluorescence pour localiser les cellules ; Sinon, le signal peut être blanchi avant la collecte des données.
9. Configurez manuellement trois ensembles de paramètres pour collecter les piles z de l’image : coupe en z, canaux d’imagerie et paramètres d’exposition.
   REMARQUE : reportez-vous à la figure supplémentaire 1 pour des exemples d’interface graphique de réglage des paramètres dans un logiciel commercial. L’apparence exacte diffère d’une plate-forme logicielle à l’autre, mais les options sont plus ou moins les mêmes.
   1. Section en Z : Prélever des tranches à pas de 0,5 μm pour 15 tranches (couvrant 7 μm de profondeur, généralement suffisant pour les cellules de levure haploïde normales).
   2. Canaux d’imagerie : Sélectionnez DIC ou PC pour les contours cellulaires et les canaux de fluorescence appropriés si nécessaire.
   3. Intensité de la lumière d’excitation et temps d’exposition : Réglez l’intensité de la lumière d’excitation et le temps d’exposition en fonction de l’échantillon.
      REMARQUE : Comme point de départ, utilisez 100 % pour l’intensité lumineuse d’excitation et 100 ms pour le temps d’exposition ; diminuer l’intensité lumineuse si le photoblanchiment devient évident avec la progression de la collecte de la pile Z ou si le signal dépasse la capacité d’enregistrement de la caméra (c.-à-d. saturation du signal) ; Augmentez l’intensité lumineuse si le rapport signal/bruit est faible.
10. Notez les paramètres d’imagerie et utilisez les mêmes paramètres pour tous les échantillons à comparer.
    REMARQUE : N’utilisez pas le paramètre « auto » pour la collecte de données et la visualisation d’images. Il est important d’enregistrer les paramètres dans une note de laboratoire afin que les mêmes paramètres puissent être réappliqués lors de futures répétitions expérimentales. Certaines applications logicielles de contrôle de microscope ont la capacité d’enregistrer et de réappliquer les paramètres ; Néanmoins, il est conseillé d’enregistrer les paramètres de manière indépendante, car les profils logiciels peuvent être supprimés ou modifiés involontairement par des collègues.
11. Enregistrez les données au format de pile multicanal 16 bits.
    REMARQUE : N’enregistrez pas d’images RVB 8 bits (ou 24 bits, si vous comptez les trois couleurs). Voir la section sur la visualisation d’images (Section 4) pour connaître les limites du format 8 bits.
12. Déplacez-vous vers une zone complètement différente pour la prochaine collection de piles d’images.
    REMARQUE : Les zones adjacentes peuvent avoir subi un photoblanchiment et une phototoxicité. Par conséquent, la pile d’images recueillies dans ces zones peut être trompeuse.

3. Imagerie en accéléré

REMARQUE : La procédure d’imagerie time-lapse diffère de celle de l’imagerie à point temporel unique dans deux domaines : la préparation des échantillons et les paramètres d’imagerie.

1. Préparation des échantillons
   1. Enduire un plat à fond de verre de 35 mm de concanavalin A de 1 mg/mL et attendre 5 min ou plus.
   2. Ajoutez 1,5 ml de culture liquide de levure dans le plat et attendez 5 minutes pour permettre aux cellules de levure de se déposer sur la surface du verre.
   3. À l’aide d’une pipette, aspirez le milieu liquide du bord du plat, puis rincez doucement le morceau de sédiment de levure avec environ 1 ml de milieu frais pour éliminer les cellules mal fixées.
   4. Répétez le rinçage 2-3 fois. Aspirez à l’aide d’une pipette, puis ajoutez délicatement 2 ml de milieu de culture frais.
2. Paramètres d’imagerie
   1. Section en Z : Collecter les tranches à 0,5 μm en pas pour 15 tranches.
   2. Canaux d’imagerie : sélectionnez les canaux nécessaires.
   3. Intensité lumineuse d’excitation et temps d’exposition : Utiliser le minimum nécessaire pour discerner la structure subcellulaire étudiée.
      REMARQUE : Pour l’imagerie en accéléré, le photoblanchiment et la phototoxicité à l’éclairage répété limitent le nombre total de points temporels pouvant être collectés. Par conséquent, l’intensité d’excitation et le temps d’exposition sont généralement réglés sur des valeurs faibles afin que davantage de points temporels puissent être imagés.
   4. Intervalle d’imagerie : Définissez les intervalles de temps appropriés pour le processus biologique étudié.
      REMARQUE : Par exemple, la formation d’un autophagosome dans des conditions de famine prend environ 5 à 10 min ; Un intervalle de 1 minute ou moins est préférable pour suivre sa dynamique. Dans des conditions riches en nutriments, le cycle cellulaire de la levure se produit sur l’échelle de l’heure ; Un intervalle plus long, par exemple 10-20 min, peut être utilisé.
3. Si le matériel approprié est disponible, maintenez la température de la parabole à 30 °C.
   REMARQUE : La plupart des processus biologiques dans les cellules de levure peuvent également être imagés à température ambiante (RT), sauf à un rythme plus lent en général.

4. Visualisation des piles d’images et évaluation du nombre de copies d’intégration

1. Installez le logiciel Fiji ou ImageJ pour la visualisation et l’analyse d’images^11,12.
   REMARQUE : Fiji est une collection d’outils basée sur ImageJ, adaptée à la visualisation et au traitement de données d’images biologiques à usage général. Pour le traitement d’images répertorié dans ce protocole, ImageJ sans plugins supplémentaires est suffisant.
2. Choisissez les paramètres appropriés pour l’affichage et la comparaison des images.
   1. Aux Fidji, ouvrez quelques images z-stack.
   2. Faites glisser la position z de chaque pile vers la section médiane (ou d’autres positions si la structure à l’étude y est mieux visualisée).
   3. Allez dans l’image > Ajuster > luminosité/contraste et cliquez sur Réinitialiser.
   4. Dans la fenêtre Luminosité/Contraste (B&C), utilisez les barres de défilement pour modifier deux paramètres, les valeurs Minimum et Maximum , afin de discerner clairement la structure étudiée.
      REMARQUE : En règle générale, la valeur minimale est définie pour être proche de la valeur moyenne dans les zones vides, et la valeur maximale est définie pour être proche du maximum dans l’image. Ces valeurs peuvent être déduites de l’histogramme affiché (Figure 2A). Si la station de travail d’imagerie est calibrée en couleur, la valeur minimale peut être réglée légèrement plus haut pour masquer davantage de signaux d’arrière-plan.
   5. Dans la fenêtre Luminosité/Contraste (B&C), cliquez sur Définir et sélectionnez la case à cocher Se propager à toutes les autres images ouvertes dans la fenêtre contextuelle Définir la plage d’affichage.
      REMARQUE : Cette opération applique les mêmes paramètres de luminosité/contraste (y compris les valeurs minimale et maximale) à toutes les images ouvertes afin que les images puissent être comparées de manière croisée.
   6. Regardez différentes images et faites défiler la pile z de chacune d’elles. Si les images sont belles avec un fond sombre approprié et des saturations peu exagérées, notez les paramètres Minimum et Maximum .
3. Pour les images multicouches, choisissez les paramètres d’affichage de l’image pour chaque couche :
   1. Allez dans l’outil Image > Couleur > Canaux, sélectionnez le mode Niveaux de gris dans la fenêtre contextuelle Canaux.
   2. Parcourez chaque canal, choisissez la luminosité/le contraste approprié pour ce canal et notez les paramètres.
   3. Une fois la luminosité/le contraste réglé, revenez à la fenêtre Canaux et passez en mode Composite pour la visualisation simultanée de plusieurs canaux.
      REMARQUE : La pseudo-couleur de chaque canal peut être modifiée manuellement dans les canaux selon vos préférences personnelles. Les cases à cocher permettent d’afficher/masquer des chaînes particulières.
4. Si nécessaire, utilisez les cases à cocher de la fenêtre Canaux pour afficher ou masquer des canaux particuliers.
5. Si vous le souhaitez, générez des projections de pile en accédant à Image > Stacks > Z Project.
   REMARQUE : Plusieurs modes de projection sont disponibles. L’intensité maximale est un bon choix pour une évaluation rapide. La nature de la recherche doit être prise en compte pour déterminer si un mode de projection particulier ou des tranches individuelles doivent être utilisés pour la quantification. La projection peut également être limitée à certaines tranches z pour réduire l’interférence de la lumière floue.
6. Écran pour les transformateurs d’intégration à copie unique.
   1. Une fois que les mêmes paramètres de luminosité/contraste sont appliqués à toutes les images ouvertes, comparez les intensités d’image entre les échantillons pour déduire le nombre d’intégration plasmidique.
      REMARQUE : Les images doivent être acquises en suivant la procédure générale pour l’imagerie à point unique dans le temps, en commençant par la culture pendant la nuit dans un milieu liquide. Les intégrations multicopies (voir les colonies 2 et 3 de la figure 2B pour des exemples) semblent nettement plus lumineuses que les intégrations à copie unique (colonie 1 de la figure 2B). En revanche, les exemplaires uniques se ressemblent (Figure 2B).
   2. Examinez les images de huit transformants pour chaque variété, en vous assurant d’utiliser les mêmes paramètres de luminosité/contraste .
   3. Répétez la série et enregistrez trois transformants uniques ou plus pour une étude ultérieure.
7. Exportez des images pour la présentation.
   1. Allez dans Image > Dupliquer pour faire une copie de l’image qui vous intéresse et lui donner le nom de votre choix.
   2. Allez à l’image > Tapez > 8 bits pour convertir la copie dupliquée de 16 bits à 8 bits et l’enregistrer si nécessaire.
      REMARQUE : N’oubliez pas qu’une fois cette option appliquée, si les paramètres de luminosité/contraste n’ont pas été notés précédemment, il n’existe pas de moyen simple de récupérer ces informations, et donc pas de moyen facile de réappliquer le même paramètre dans les visualisations d’images ultérieures. C’est d’ailleurs la raison pour laquelle l’opération de duplication précédente est recommandée.
   3. Pour diviser une pile z en une collection d’images individuelles, accédez à Piles de > d’images > Empiler aux images et enregistrez-les si nécessaire.
      REMARQUE : Les images peuvent également être recadrées sur une zone plus petite aux Fidji.

Résultats

La morphologie et la dynamique des organites sont sujettes à des changements car les cellules de levure répondent à des signaux externes et internes. Ici, nous fournissons des images représentatives d’organites de levure dans la phase mi-logarithmique (Figure 3A,B). Comme mentionné précédemment, plusieurs organites ont leurs caractéristiques morphologiques distinctes, ils sont donc faciles à reconnaître sans comparaison approfond...

Discussion

Le protocole décrit ici fournit un début simple pour les personnes venant d’autres domaines de recherche pour explorer l’imagerie des organites de levure. Avant de passer à des sujets spécifiques, nous aimerions souligner une fois de plus qu’il faut s’abstenir d’une utilisation excessive des fonctions automatiques dans les logiciels d’imagerie. Les images de microscopie ne sont pas seulement de jolies images, ce sont des données scientifiques, et leur acquisition et leur...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sangon Biotech	A600013
Casaminoacid	Sangon Biotech	A603060
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack bean)	Sigma Aldrich	L7647
D-Glucose	Sangon Biotech	A501991
Fiji			https://fiji.sc/
Glass-bottom petri dish	NEST	706001	Φ35 mm
ImajeJ			https://imagej.net/
Inverted florescence microscope	Olympus		IX83 equipped with UPLXAPO 100X oil immersion objective, Lumencor Spectra X light source, and Hamamatsu Orca Flash4.0 LT camera.
L-Histidine	Sangon Biotech	A604351
L-Leucine	Sangon Biotech	A100811
L-Lysine	Sangon Biotech	A602759
L-Methionine	Sangon Biotech	A100801
L-Tryptophan	Sangon Biotech	A601911
Microscope cover glass	CITOTEST	10222222C	22 mm x 22 mm, 0.16–0.19 mm
Microscope slides	CITOTEST	1A5101	25 mm x 75 mm, 1–1.2 mm
Peptone	Sangon Biotech	A505247
Uracil	Sangon Biotech	A610564
Visiview	Visitron System GmbH		https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html
Yeast extract	Sangon Biotech	A100850
Yeast nitrogen base without amino acids	Sangon Biotech	A610507
YNB without amino acids and ammonium sulfate	Sangon Biotech	A600505