Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Здесь мы описываем использование набора маркеров органелл на основе флуоресцентных белков для визуализации живых клеток почковающихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Почковающиеся дрожжи, Saccharomyces cerevisiae, являются классической модельной системой для изучения функции и динамики органелл. В наших предыдущих работах мы конструировали флуоресцентные белковые маркеры для основных органелл и эндомембранных структур, включая ядро, эндоплазматический ретикулум (ЭР), аппарат Гольджи, эндосомы, вакуоли, митохондрии, пероксисомы, липидные капли и аутофагосомы. Представленный здесь протокол описывает процедуры использования этих маркеров в дрожжах, включая подготовку ДНК для трансформации дрожжей, выбор и оценку трансформантов, флуоресцентное микроскопическое наблюдение и ожидаемые результаты. Текст ориентирован на исследователей, которые вступают в область изучения органелл дрожжей из других областей. В нем рассматриваются основные шаги, а также технические примечания об аппаратном обеспечении микроскопа и нескольких распространенных ошибках. Он дает людям отправную точку для наблюдения за дрожжевыми субклеточными образованиями с помощью флуоресцентной микроскопии живых клеток. Эти инструменты и методы могут быть использованы для определения субклеточной локализации белка и отслеживания органелл, представляющих интерес при покадровой визуализации.
Субклеточная компартментализация на мембраносвязанные органеллы является общим принципом в организации эукариотических клеток. Каждая органелла выполняет определенные функции. Как и во многих других аспектах эукариотической биологии, почковающиеся дрожжи, Saccharomyces cerevisiae, были классической модельной системой для разъяснения основных принципов организации и динамики органелл. Примеры включают в себя основополагающие открытия в пути секреции белка, пути импорта пероксисомального белка и пути аутофагии 1,2,3.
В типичных условиях, богатых питательными веществами, быстрорастущие дрожжевые клетки содержат эндоплазматический ретикулум (ER), раннюю Гольджи, позднюю Гольджи/ранние эндосомы, поздние эндосомы, вакуоли и митохондрии. Некоторые пероксисомы, липидные капли и аутофагосомы (даже меньше, чем первые две, в основном типа пузырьков Cvt, которые присутствуют в богатых питательными веществами условиях4) также присутствуют, но не так заметно, как это было бы в определенных условиях культивирования (богатые липидами среды, среды голодания и т. д.). По сравнению с другими распространенными эукариотическими моделями, дрожжевые клетки довольно малы; Диаметр типичной дрожжевой клетки составляет около 5 мкм, по сравнению с десятками микрометров для большинства животных и растительных клеток. В результате, в том же поле визуализации, которое обычно содержит одну адгезивную клетку животного, обычно можно увидеть десятки дрожжевых клеток на различных стадиях клеточного цикла. Помимо разницы в размерах, морфология органелл дрожжей также имеет некоторые специфические особенности. На ультраструктурном уровне дрожжевые ER состоят из листов и трубочек, как и в других системах. При флуоресцентной микроскопии ER дрожжей проявляется в виде двух колец с некоторыми взаимосвязанными структурами между ними. Внутреннее кольцо представляет собой ядерную ЭР, которая непрерывна с ядерной оболочкой, а внешнее кольцо представляет собой периферическую ЭР, которая представляет собой трубчатую сеть, лежащую под плазматической мембраной5. Подобно растительным клеткам, но отличается от клеток животных, гибридная органелла, поздняя эндосома Гольджи/ранняя эндосома, находится на пересечении секреторного пути и эндоцитарного пути 6,7. Морфологически дрожжевые аппараты Гольджи диспергируются в цитоплазме. Вакуоли функционально аналогичны лизосомам в клетках животных. Они часто занимают большие участки цитоплазмы и подвергаются частому делению и слиянию. Помимо использования флуоресцентных маркеров колокализации, вакуолярную мембрану можно отличить от ядерной ЭР, по крайней мере, по двум критериям: вакуолярная мембрана, как правило, более округлая, чем ядерная ЭР, и обивочный вид вакуоли при ДВС-синдроме также более выражен, чем у ядра.
Как правило, мы используем набор маркеров на основе флуоресцентных белков для визуализации вышеупомянутых органелл в живых дрожжевых клетках (табл. 1). Точность и функциональность этих маркеров органелл были экспериментально проверены 7,8. Эти маркерные конструкции предназначены для введения в геном дрожжей кассет с флуоресцентными белками-химерами. Как указано ниже, при подготовке к трансформации дрожжей линейные фрагменты ДНК генерируются либо путем ферментативного расщепления, либо путем амплификации ПЦР 7,8. Линейные фрагменты ДНК интегрируются в геном посредством гомологичной рекомбинации. Для плазмид, описанных в этом протоколе, используются три типа дизайна. В первом типе, охватывающем большую часть плазмид, часто можно получить трансформаторы, несущие несколько копий конструкции. Обычно это нежелательно, потому что это приводит к экспрессивным и, возможно, функциональным вариациям у трансформантов. Трансформанты с одной копией должны быть идентифицированы с помощью визуализации, как описано в этом протоколе, с помощью иммуноблоттинга или тщательно разработанных ПЦР-тестов. Во втором типе, охватывающем GFP-Sed5, GFP-Pep12 и GFP-Atg8, в гаплоидных дрожжевых клетках происходит только интеграция с одной копией. Как первый, так и второй тип сохраняют эндогенную копию маркерного гена нетронутой в геноме. Третий тип плазмидного дизайна, охватывающий Sec7-2GFP и Vph1-2GFP, предназначен для введения С-концевых ударов, что приводит к тому, что химеры являются единственной копией соответствующего маркерного гена.
В этой статье мы опишем процедуру использования этих маркеров органелл, предоставим образцовые микроскопические изображения и обсудим меры предосторожности, предназначенные для исследователей, не знакомых с визуализацией органелл дрожжей.
1. Конструкция штамма дрожжей
2. Флуоресцентная микроскопия: общие процедуры и визуализация в одной временной точке
3. Покадровая съемка
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура покадровой съемки отличается от процедуры покадровой съемки в одной временной точке в двух областях: подготовка образца и параметры визуализации.
4. Визуализация стеков изображений и оценка количества экземпляров интеграции
Морфология и динамика органелл подвержены изменениям, поскольку дрожжевые клетки реагируют на внешние и внутренние сигналы. Здесь мы приводим репрезентативные изображения дрожжевых органелл в средней логарифмической фазе (рис. 3A, B). Как упо?...
Описанный здесь протокол обеспечивает простое начало для людей, поступающих из других областей исследований, для изучения визуализации дрожжевых органелл. Прежде чем перейти к конкретным темам, мы хотели бы еще раз подчеркнуть, что необходимо воздерживаться от чрез?...
Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников лаборатории Се за их щедрую помощь в подготовке рукописи. Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (грант 91957104), Шанхайской муниципальной комиссии по образованию (грант 2017-01-07-00-02-E00035) и Шанхайской муниципальной комиссии по науке и технике (грант 22ZR1433800).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adenine | Sangon Biotech | A600013 | |
Casaminoacid | Sangon Biotech | A603060 | |
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma Aldrich | L7647 | |
D-Glucose | Sangon Biotech | A501991 | |
Fiji | https://fiji.sc/ | ||
Glass-bottom petri dish | NEST | 706001 | Φ35 mm |
ImajeJ | https://imagej.net/ | ||
Inverted florescence microscope | Olympus | IX83 equipped with UPLXAPO 100X oil immersion objective, Lumencor Spectra X light source, and Hamamatsu Orca Flash4.0 LT camera. | |
L-Histidine | Sangon Biotech | A604351 | |
L-Leucine | Sangon Biotech | A100811 | |
L-Lysine | Sangon Biotech | A602759 | |
L-Methionine | Sangon Biotech | A100801 | |
L-Tryptophan | Sangon Biotech | A601911 | |
Microscope cover glass | CITOTEST | 10222222C | 22 mm x 22 mm, 0.16–0.19 mm |
Microscope slides | CITOTEST | 1A5101 | 25 mm x 75 mm, 1–1.2 mm |
Peptone | Sangon Biotech | A505247 | |
Uracil | Sangon Biotech | A610564 | |
Visiview | Visitron System GmbH | https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html | |
Yeast extract | Sangon Biotech | A100850 | |
Yeast nitrogen base without amino acids | Sangon Biotech | A610507 | |
YNB without amino acids and ammonium sulfate | Sangon Biotech | A600505 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены