Визуализация дрожжевых органелл с помощью флуоресцентных белковых маркеров

Резюме

Здесь мы описываем использование набора маркеров органелл на основе флуоресцентных белков для визуализации живых клеток почковающихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Аннотация

Почковающиеся дрожжи, Saccharomyces cerevisiae, являются классической модельной системой для изучения функции и динамики органелл. В наших предыдущих работах мы конструировали флуоресцентные белковые маркеры для основных органелл и эндомембранных структур, включая ядро, эндоплазматический ретикулум (ЭР), аппарат Гольджи, эндосомы, вакуоли, митохондрии, пероксисомы, липидные капли и аутофагосомы. Представленный здесь протокол описывает процедуры использования этих маркеров в дрожжах, включая подготовку ДНК для трансформации дрожжей, выбор и оценку трансформантов, флуоресцентное микроскопическое наблюдение и ожидаемые результаты. Текст ориентирован на исследователей, которые вступают в область изучения органелл дрожжей из других областей. В нем рассматриваются основные шаги, а также технические примечания об аппаратном обеспечении микроскопа и нескольких распространенных ошибках. Он дает людям отправную точку для наблюдения за дрожжевыми субклеточными образованиями с помощью флуоресцентной микроскопии живых клеток. Эти инструменты и методы могут быть использованы для определения субклеточной локализации белка и отслеживания органелл, представляющих интерес при покадровой визуализации.

Введение

Субклеточная компартментализация на мембраносвязанные органеллы является общим принципом в организации эукариотических клеток. Каждая органелла выполняет определенные функции. Как и во многих других аспектах эукариотической биологии, почковающиеся дрожжи, Saccharomyces cerevisiae, были классической модельной системой для разъяснения основных принципов организации и динамики органелл. Примеры включают в себя основополагающие открытия в пути секреции белка, пути импорта пероксисомального белка и пути аутофагии ^1,2,3.

В типичных условиях, богатых питательными веществами, быстрорастущие дрожжевые клетки содержат эндоплазматический ретикулум (ER), раннюю Гольджи, позднюю Гольджи/ранние эндосомы, поздние эндосомы, вакуоли и митохондрии. Некоторые пероксисомы, липидные капли и аутофагосомы (даже меньше, чем первые две, в основном типа пузырьков Cvt, которые присутствуют в богатых питательными веществами условиях⁴) также присутствуют, но не так заметно, как это было бы в определенных условиях культивирования (богатые липидами среды, среды голодания и т. д.). По сравнению с другими распространенными эукариотическими моделями, дрожжевые клетки довольно малы; Диаметр типичной дрожжевой клетки составляет около 5 мкм, по сравнению с десятками микрометров для большинства животных и растительных клеток. В результате, в том же поле визуализации, которое обычно содержит одну адгезивную клетку животного, обычно можно увидеть десятки дрожжевых клеток на различных стадиях клеточного цикла. Помимо разницы в размерах, морфология органелл дрожжей также имеет некоторые специфические особенности. На ультраструктурном уровне дрожжевые ER состоят из листов и трубочек, как и в других системах. При флуоресцентной микроскопии ER дрожжей проявляется в виде двух колец с некоторыми взаимосвязанными структурами между ними. Внутреннее кольцо представляет собой ядерную ЭР, которая непрерывна с ядерной оболочкой, а внешнее кольцо представляет собой периферическую ЭР, которая представляет собой трубчатую сеть, лежащую под плазматической мембраной⁵. Подобно растительным клеткам, но отличается от клеток животных, гибридная органелла, поздняя эндосома Гольджи/ранняя эндосома, находится на пересечении секреторного пути и эндоцитарного пути ^6,7. Морфологически дрожжевые аппараты Гольджи диспергируются в цитоплазме. Вакуоли функционально аналогичны лизосомам в клетках животных. Они часто занимают большие участки цитоплазмы и подвергаются частому делению и слиянию. Помимо использования флуоресцентных маркеров колокализации, вакуолярную мембрану можно отличить от ядерной ЭР, по крайней мере, по двум критериям: вакуолярная мембрана, как правило, более округлая, чем ядерная ЭР, и обивочный вид вакуоли при ДВС-синдроме также более выражен, чем у ядра.

Как правило, мы используем набор маркеров на основе флуоресцентных белков для визуализации вышеупомянутых органелл в живых дрожжевых клетках (табл. 1). Точность и функциональность этих маркеров органелл были экспериментально проверены ^7,8. Эти маркерные конструкции предназначены для введения в геном дрожжей кассет с флуоресцентными белками-химерами. Как указано ниже, при подготовке к трансформации дрожжей линейные фрагменты ДНК генерируются либо путем ферментативного расщепления, либо путем амплификации ПЦР ^7,8. Линейные фрагменты ДНК интегрируются в геном посредством гомологичной рекомбинации. Для плазмид, описанных в этом протоколе, используются три типа дизайна. В первом типе, охватывающем большую часть плазмид, часто можно получить трансформаторы, несущие несколько копий конструкции. Обычно это нежелательно, потому что это приводит к экспрессивным и, возможно, функциональным вариациям у трансформантов. Трансформанты с одной копией должны быть идентифицированы с помощью визуализации, как описано в этом протоколе, с помощью иммуноблоттинга или тщательно разработанных ПЦР-тестов. Во втором типе, охватывающем GFP-Sed5, GFP-Pep12 и GFP-Atg8, в гаплоидных дрожжевых клетках происходит только интеграция с одной копией. Как первый, так и второй тип сохраняют эндогенную копию маркерного гена нетронутой в геноме. Третий тип плазмидного дизайна, охватывающий Sec7-2GFP и Vph1-2GFP, предназначен для введения С-концевых ударов, что приводит к тому, что химеры являются единственной копией соответствующего маркерного гена.

В этой статье мы опишем процедуру использования этих маркеров органелл, предоставим образцовые микроскопические изображения и обсудим меры предосторожности, предназначенные для исследователей, не знакомых с визуализацией органелл дрожжей.

протокол

1. Конструкция штамма дрожжей

1. Получите маркерные плазмиды и подходящий штамм дрожжей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмиды можно приобрести в компании Addgene. В качестве примеров в этом протоколе используются TN124 (MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ::LEU2), BY4741 (MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0) и DJ03 (BY4741 trp1Δ::MET15). Одним из важных соображений при выборе штамма, помимо характера научного вопроса, является совместимость селекционных маркеров. Описанные здесь плазмиды маркеров органелл используют URA3 и TRP1 в качестве маркеров отбора. Следовательно, генотип штамма-реципиента должен быть ura3 и trp1. В противном случае необходимо модифицировать штамм или плазмиды.
2. Готовят дрожжевые среды по следующим рецептам.
   ПРИМЕЧАНИЕ: СМД (синтетический минимум декстрозы; 2% глюкозы, 0,67% дрожжевого азотного основания (YNB) без аминокислот, 30 мг/л аденина, 30 мг/л лизина, 30 мг/л метионина, 20 мг/л гистидина, 20 мг/л урацила, 50 мг/л триптофана, 50 мг/л лейцина). SMD+CA (SMD с добавлением 0,5% казаминокислот). YPD (Дрожжевой экстракт пептона декстроза; 1% экстракт дрожжей, 2% пептон, 2% глюкоза). SD-N (синтетическая декстроза без азота; 0,17% YNB без аминокислот и сульфата аммония, 2% глюкозы). Пожалуйста, обратитесь к разделу «Обсуждение» для рассмотрения вопроса о выборе носителя.
3. Перед этапом трансформации необходимо получить линеаризованные фрагменты ДНК путем ферментативного расщепления или ПЦР-амплификации плазмиды маркера органелл.
   Примечание: В таблице 1 перечислены сайты фермента рестрикции и праймеры ПЦР для получения линейных фрагментов из плазмид маркеров органелл.
4. Культивирование дрожжевых клеток в жидкой среде YPD и трансформация дрожжей с линейным фрагментом ДНК.
   Примечание: Дрожжевая трансформация может быть выполнена с использованием традиционного метода на основе LiAc⁹ или других методов по выбору. Целесообразно включать соответствующие элементы контроля для трансформации, в частности, отрицательный контроль без плазмиды или плазмидной ДНК.
5. Инкубируйте на подходящей селекционной тарелке (например, для отбора URA3 используйте среду SMD-URA) при температуре 30 °C в течение 2-3 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для появления одиночных колоний требуется около 2 дней.
6. Чтобы проверить экспрессию флуоресцентной химеры и количество экземпляров интеграции, выберите восемь колоний из селекционной пластины, повторно нанесите полосы на свежие селекционные пластины и инкубируйте при 30 °C.

2. Флуоресцентная микроскопия: общие процедуры и визуализация в одной временной точке

1. Культивировать дрожжевые клетки в течение ночи в жидкой среде SMD при 30 °С с встряхиванием.
2. На следующее утро измерьте оптическую плотность культуры дрожжей при длине волны 600 нм (далее OD₆₀₀) с помощью спектрофотометра или планшетного ридера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Имея некоторую практику в области инокуляции дрожжей, обычно можно убедиться, что OD₆₀₀ всех образцов ниже 2 на этом этапе. Если он оказывается выше, рекомендуется разбавить больше на следующем этапе и дать больше времени для восстановления дрожжевых клеток.
3. Разбавьте культуру дрожжей примерно до 0,2 OD₆₀₀ с использованием свежей среды.
4. Продолжайте культивирование до тех пор, пока внешний диаметр₆₀₀ не достигнет примерно 0,8-1,0.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время удвоения дрожжей составляет около 1,5-2 часов.
5. Положите покровное стекло поверх папиросной бумаги на плоскую поверхность, нанесите 5 мкл 1 мг/мл конканавалина А на верхнюю сторону покровного стекла и подождите 5 минут (Рисунок 1А)¹⁰.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот подготовительный этап можно выполнить заранее.
6. Перелейте 100 μл дрожжевой культуры на верхнюю сторону покровного стекла и подождите 5 минут.
7. Соедините покровное стекло с поддерживающим стеклянным предметным стеколом, между которыми находятся дрожжевые клетки; Нажмите с соответствующим усилием, чтобы зафиксировать крепление.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется некоторая практика, чтобы найти правильное давление, чтобы дрожжевые клетки образовывали неподвижный одиночный слой, но не раздавливались (Рисунок 1B). На этом этапе жидкая среда будет выталкиваться и поглощаться нижележащей папиросной бумагой.
8. Установите предметное стекло на предметный столик микроскопа. Найдите участок дрожжевых клеток и сфокусируйтесь на нем с помощью дифференциально-интерференционно-контрастного (DIC) или фазово-контрастного (PC) освещения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте флуоресценцию для определения местоположения клеток; В противном случае сигнал может потускнеть до начала сбора данных.
9. Вручную настройте три набора параметров для сбора z-стеков изображений: z-секция, каналы изображения и параметры экспозиции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На дополнительном рисунке 1 приведены примеры настроек параметров графического интерфейса пользователя в одном коммерческом программном обеспечении. Точный внешний вид отличается на разных программных платформах, но варианты более или менее одинаковы.
   1. Z-секция: Соберите срезы с шагом 0,5 мкм в течение 15 срезов (глубина 7 мкм, как правило, достаточна для нормальных гаплоидных дрожжевых клеток).
   2. Каналы визуализации: Выберите DIC или PC для контуров клеток и соответствующие флуоресцентные каналы по мере необходимости.
   3. Интенсивность возбуждающего света и время воздействия: Установите интенсивность возбуждающего света и время воздействия в соответствии с образцом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве отправной точки используйте 100% для интенсивности возбуждающего света и 100 мс для времени воздействия; уменьшить интенсивность света, если фотообесцвечивание становится очевидным по мере накопления z-стека или если сигнал превышает пропускную способность камеры (т.е. насыщенность сигнала); Увеличьте интенсивность света, если отношение сигнал/шум низкое.
10. Запишите настройки изображения и используйте одни и те же настройки для всех сравниваемых образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте настройку «авто» для сбора данных и визуализации изображений. Важно записать настройки в лабораторную заметку, чтобы точно такие же параметры можно было повторно применить в будущих экспериментальных повторах. Некоторые программные приложения для управления микроскопом имеют возможность сохранять и повторно применять настройки; Тем не менее, рекомендуется записывать настройки независимо, потому что профили программного обеспечения могут быть непреднамеренно удалены или изменены коллегами.
11. Сохраняйте данные в 16-битном формате многоканального стека.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не сохраняйте изображения в формате 8 бит RGB (или 24 бит, если считать все три цвета). Ограничения 8-битного формата см. в разделе визуализации изображений (раздел 4).
12. Перейдите в совершенно другую область для следующей коллекции стека изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соседние участки могут подвергаться фотообесцвечиванию и фототоксичности. В результате стек изображений, собранный из этих областей, может вводить в заблуждение.

3. Покадровая съемка

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура покадровой съемки отличается от процедуры покадровой съемки в одной временной точке в двух областях: подготовка образца и параметры визуализации.

1. Подготовка образцов
   1. Смажьте чашку со стеклянным дном диаметром 35 мм конканавалином 1 мг/мл и подождите 5 минут или более.
   2. Добавьте в чашку 1,5 мл жидкой культуры дрожжей и подождите 5 минут, чтобы дрожжевые клетки осядли на поверхности стекла.
   3. С помощью пипетки отсадите жидкую среду от края посуды, затем аккуратно промойте участок дрожжевого осадка примерно 1 мл свежей среды, чтобы удалить ненадежно прикрепленные клетки.
   4. Повторите полоскание 2-3 раза. Отсадите с помощью пипетки, затем аккуратно добавьте 2 мл свежей питательной среды.
2. Параметры визуализации
   1. Z-секция: Соберите ломтики с шагом 0,5 мкм на 15 срезов.
   2. Каналы визуализации: выберите по мере необходимости.
   3. Интенсивность возбуждения света и время воздействия: Используйте минимум, необходимый для различения исследуемой субклеточной структуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для покадровой съемки фотообесцвечивание и фототоксичность от повторного освещения ограничивают общее количество временных точек, которые могут быть собраны. Таким образом, интенсивность возбуждения и время экспозиции обычно устанавливаются на низкие значения, чтобы можно было получить изображение большего количества временных точек.
   4. Интервал визуализации: Установите временные интервалы, соответствующие исследуемому биологическому процессу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, образование аутофагосомы в условиях голодания занимает около 5-10 минут; Для отслеживания его динамики предпочтителен интервал в 1 минуту и менее. В условиях, богатых питательными веществами, клеточный цикл дрожжей происходит по часовой шкале; Можно использовать более длительный интервал, например, 10-20 минут.
3. Если есть подходящее оборудование, поддерживайте температуру тарелки на уровне 30 °C.
   Примечание: Большинство биологических процессов в дрожжевых клетках также могут быть визуализированы при комнатной температуре (RT), за исключением более медленных темпов в целом.

4. Визуализация стеков изображений и оценка количества экземпляров интеграции

1. Установите программное обеспечение Fiji или ImageJ для визуализации и анализа изображений^11,12.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фиджи - это набор инструментов на основе ImageJ, подходящий для визуализации и обработки данных биологических изображений общего назначения. Для обработки изображений, перечисленных в этом протоколе, достаточно ImageJ без дополнительных плагинов.
2. Выберите подходящие параметры для отображения и сравнения изображений.
   1. На Фиджи откройте пару изображений z-stack.
   2. Перетащите z-позицию в каждой стопке в среднюю часть (или в другие позиции, если исследуемая структура лучше визуализируется там).
   3. Перейдите в раздел «Изображение» > «Настроить яркость/контрастность» > и нажмите « Сброс».
   4. В окне Яркость/Контрастность (B&C) используйте полосы прокрутки для изменения двух параметров, Минимального и Максимального , чтобы четко различить исследуемую структуру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, Минимальное значение устанавливается близким к среднему значению в пустых областях, а Максимальное устанавливается близким к максимальному значению на изображении. Эти значения можно вывести из отображаемой гистограммы (рисунок 2A). Если рабочая станция обработки изображений откалибрована по цвету, минимальное значение можно установить немного выше, чтобы скрыть больше фоновых сигналов.
   5. В окне «Яркость/контрастность» нажмите « Установить » и установите флажок « Распространить на все остальные открытые изображения » во всплывающем окне «Установить диапазон отображения».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта операция применяет одни и те же настройки яркости/контрастности (включая минимальные и максимальные значения) ко всем открытым изображениям, чтобы изображения можно было сравнивать.
   6. Просматривайте разные изображения и прокручивайте z-стек в каждом из них. Если изображения хорошо смотрятся с правильным темным фоном и немного раздутой насыщенностью, запишите Минимальные и Максимальные настройки.
3. Для многоканальных изображений выберите настройки отображения изображений для каждого канала:
   1. Перейдите в Изображение > Инструмент «Цвет > каналы», выберите режим «Оттенки серого » во всплывающем окне «Каналы».
   2. Пройдитесь по каждому каналу, выберите подходящую яркость/контрастность для этого канала и запишите настройки.
   3. Настроив параметры Яркость/Контрастность , вернитесь в окно Каналы и переключитесь на Композитный режим для одновременной визуализации нескольких каналов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Псевдоцвет для каждого канала может быть вручную изменен в разделе Каналы в соответствии с личными предпочтениями. Галочки предназначены для отображения/скрытия определенных каналов.
4. При необходимости используйте флажки в окне Каналы , чтобы показать или скрыть определенные каналы.
5. При необходимости сгенерируйте стековые проекции, перейдя в раздел Изображение > Стеки > Проект Z.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Доступно несколько режимов проекции. Максимальная интенсивность — хороший выбор для быстрой оценки. Характер исследования следует учитывать, чтобы определить, следует ли использовать конкретный режим проекции или отдельные срезы для количественной оценки. Проекция также может быть ограничена выбранными z-срезами, чтобы уменьшить интерференцию расфокусированного света.
6. Экран для преобразователей с однократной копией и интеграцией.
   1. После того как одинаковые настройки яркости/контрастности будут применены ко всем открытым изображениям, сравните интенсивность изображения в образцах, чтобы получить число интеграции плазмиды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения должны быть получены в соответствии с общей процедурой получения изображений в одной временной точке, начиная с ночного культивирования в жидкой среде. Интеграции с несколькими копиями (см. примеры колоний 2 и 3 на рисунке 2B ) выглядят значительно ярче, чем интеграции с одной копией (колония 1 на рисунке 2B). В отличие от них, одиночные экземпляры выглядят похожими друг на друга (рис. 2B).
   2. Изучите изображения с восьми трансформантов для каждого штамма, убедившись, что используются одни и те же настройки яркости/контрастности .
   3. Повторное прогон и сохранение трех или более преобразователей в одной копии для последующего изучения.
7. Экспортируйте изображения для презентации.
   1. Перейдите в раздел Изображение > Дублировать , чтобы сделать копию интересующего изображения, и дайте ему имя по выбору.
   2. Перейдите в раздел Изображение > введите > 8-битный , чтобы преобразовать дубликат копии с 16-битного на 8-битный и сохранить его по мере необходимости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что после применения этого параметра, если настройки яркости/контрастности не были записаны ранее, не будет простого способа получить эту информацию, и, следовательно, не будет простого способа повторно применить ту же настройку в последующих визуализациях изображений. По этой же причине рекомендуется выполнить предыдущую операцию дублирования.
   3. Чтобы разделить стек z на коллекцию отдельных изображений, перейдите в раздел Изображения > Стеки > Стек в изображения и сохраните их по мере необходимости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения также могут быть обрезаны до меньшей площади на Фиджи.

Результаты

Морфология и динамика органелл подвержены изменениям, поскольку дрожжевые клетки реагируют на внешние и внутренние сигналы. Здесь мы приводим репрезентативные изображения дрожжевых органелл в средней логарифмической фазе (рис. 3A, B). Как упо?...

Обсуждение

Описанный здесь протокол обеспечивает простое начало для людей, поступающих из других областей исследований, для изучения визуализации дрожжевых органелл. Прежде чем перейти к конкретным темам, мы хотели бы еще раз подчеркнуть, что необходимо воздерживаться от чрез?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sangon Biotech	A600013
Casaminoacid	Sangon Biotech	A603060
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack bean)	Sigma Aldrich	L7647
D-Glucose	Sangon Biotech	A501991
Fiji			https://fiji.sc/
Glass-bottom petri dish	NEST	706001	Φ35 mm
ImajeJ			https://imagej.net/
Inverted florescence microscope	Olympus		IX83 equipped with UPLXAPO 100X oil immersion objective, Lumencor Spectra X light source, and Hamamatsu Orca Flash4.0 LT camera.
L-Histidine	Sangon Biotech	A604351
L-Leucine	Sangon Biotech	A100811
L-Lysine	Sangon Biotech	A602759
L-Methionine	Sangon Biotech	A100801
L-Tryptophan	Sangon Biotech	A601911
Microscope cover glass	CITOTEST	10222222C	22 mm x 22 mm, 0.16–0.19 mm
Microscope slides	CITOTEST	1A5101	25 mm x 75 mm, 1–1.2 mm
Peptone	Sangon Biotech	A505247
Uracil	Sangon Biotech	A610564
Visiview	Visitron System GmbH		https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html
Yeast extract	Sangon Biotech	A100850
Yeast nitrogen base without amino acids	Sangon Biotech	A610507
YNB without amino acids and ammonium sulfate	Sangon Biotech	A600505