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Method Article
Aquí describimos el uso de un conjunto de marcadores de orgánulos basados en proteínas fluorescentes en imágenes de células vivas de la levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae.
La levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae, es un sistema modelo clásico en el estudio de la función y la dinámica de los orgánulos. En nuestros trabajos anteriores, hemos construido marcadores basados en proteínas fluorescentes para los principales orgánulos y estructuras de endomembranas, incluido el núcleo, el retículo endoplásmico (RE), el aparato de Golgi, los endosomas, las vacuolas, las mitocondrias, los peroxisomas, las gotas de lípidos y los autofagosomas. El protocolo presentado aquí describe los procedimientos para usar estos marcadores en levaduras, incluida la preparación del ADN para la transformación de levaduras, la selección y evaluación de transformantes, la observación microscópica fluorescente y los resultados esperados. El texto está dirigido a investigadores que están ingresando al campo del estudio de orgánulos de levadura desde otros orígenes. Se cubren los pasos esenciales, así como notas técnicas sobre las consideraciones de hardware del microscopio y varios errores comunes. Proporciona un punto de partida para que las personas observen las entidades subcelulares de la levadura mediante microscopía fluorescente de células vivas. Estas herramientas y métodos se pueden utilizar para identificar la localización subcelular de proteínas y rastrear orgánulos de interés en imágenes de lapso de tiempo.
La compartimentación subcelular en orgánulos unidos a la membrana es un principio común en la organización de las células eucariotas. Cada orgánulo cumple funciones específicas. Al igual que en muchos otros aspectos de la biología eucariota, la levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae, ha sido un sistema modelo clásico para dilucidar los principios básicos de la organización y dinámica de los orgánulos. Los ejemplos incluyen los descubrimientos seminales en la vía de secreción de proteínas, la vía de importación de proteínas peroxisomales y la vía de autofagia 1,2,3.
En condiciones típicas ricas en nutrientes, las células de levadura de crecimiento rápido contienen retículo endoplásmico (RE), Golgi temprano, endosomas de Golgi tardío/tempranos, endosomas tardíos, vacuolas y mitocondrias. Algunos peroxisomas, gotas de lípidos y autofagosomas (incluso menos que los dos primeros, principalmente del tipo vesícula Cvt, que están presentes en condiciones ricas en nutrientes4) también están presentes, pero no tan prominentes como lo serían en condiciones de cultivo específicas (medios ricos en lípidos, medios de inanición, etc.). En comparación con otros modelos eucariotas comunes, las células de levadura son bastante pequeñas; El diámetro de una célula de levadura típica es de alrededor de 5 μm, en comparación con las decenas de micrómetros de la mayoría de las células animales y vegetales. Como resultado, en el mismo campo de imagen que normalmente contiene una sola célula animal adherente, normalmente se ven decenas de células de levadura en varias etapas del ciclo celular. Además de la diferencia de tamaño, la morfología de los orgánulos de levadura también tiene algunas características peculiares. A nivel ultraestructural, la levadura ER está compuesta por láminas y túbulos, como en otros sistemas. Bajo microscopía fluorescente, la levadura ER se manifiesta como dos anillos con algunas estructuras interconectadas en el medio. El anillo interior es el RE nuclear, que es continuo con la envoltura nuclear, y el anillo exterior es el RE periférico, que es una red tubular que se encuentra debajo de la membrana plasmática5. Similar a las células vegetales pero diferente de las células animales, un orgánulo híbrido, el endosoma de Golgi tardío/temprano, se encuentra en la intersección entre la vía secretora y la vía endocítica 6,7. Morfológicamente, los aparatos de Golgi de levadura se dispersan en el citoplasma. Las vacuolas son funcionalmente análogas a los lisosomas de las células animales. A menudo ocupan grandes porciones del citoplasma y experimentan fisión y fusión frecuentes. Además del uso de marcadores fluorescentes de colocalización, la membrana vacuolar puede distinguirse del RE nuclear por al menos dos criterios: la membrana vacuolar es generalmente más redondeada que el RE nuclear, y la apariencia cóncava de la vacuola en el DIC también es más pronunciada que la del núcleo.
De forma rutinaria, utilizamos un conjunto de marcadores basados en proteínas fluorescentes para visualizar los orgánulos antes mencionados en células de levadura vivas (Tabla 1). La fidelidad y funcionalidad de estos marcadores de orgánulos ha sido verificada experimentalmente 7,8. Estas construcciones de marcadores están destinadas a introducir casetes de quimeras de proteínas fluorescentes en el genoma de la levadura. Como se describe a continuación, en preparación para la transformación de la levadura, se generan fragmentos lineales de ADN por digestión enzimática o amplificación por PCR 7,8. Los fragmentos lineales de ADN se integran en el genoma mediante recombinación homóloga. Para los plásmidos descritos en este protocolo, se emplean tres tipos de diseño. En el primer tipo, que cubre la mayoría de los plásmidos, a menudo es posible obtener transformantes que llevan múltiples copias de la construcción. Por lo general, esto no es deseado porque introduce variaciones expresivas y posiblemente funcionales entre los transformantes. Los transformantes de copia única deben identificarse mediante imágenes como se describe en este protocolo, mediante inmunotransferencia o mediante pruebas de PCR cuidadosamente diseñadas. En el segundo tipo, que cubre GFP-Sed5, GFP-Pep12 y GFP-Atg8, solo se produce la integración de una sola copia en las células de levadura haploides. Tanto el primer tipo como el segundo mantienen intacta la copia endógena del gen marcador en el genoma. Un tercer tipo de diseño de plásmido, que cubre Sec7-2GFP y Vph1-2GFP, está destinado a introducir knock-ins C-terminales, lo que lleva a que las quimeras sean la única copia del gen marcador correspondiente.
Aquí describimos el procedimiento para utilizar estos marcadores de orgánulos, proporcionamos imágenes de microscopía ejemplares y discutimos las precauciones orientadas a los investigadores nuevos en la obtención de imágenes de orgánulos de levadura.
1. Construcción de la cepa de levadura
2. Microscopía de fluorescencia: procedimientos generales e imágenes de punto de tiempo único
3. Imágenes de lapso de tiempo
NOTA: El procedimiento de obtención de imágenes de lapso de tiempo difiere del de las imágenes de un solo punto de tiempo en dos áreas: preparación de la muestra y parámetros de obtención de imágenes.
4. Visualización de pilas de imágenes y evaluación del número de copia de integración
La morfología y la dinámica de los orgánulos están sujetas a cambios a medida que las células de levadura responden a señales externas e internas. Aquí, proporcionamos imágenes representativas de orgánulos de levadura en la fase de registro medio (Figura 3A, B). Como se mencionó anteriormente, varios orgánulos tienen sus características morfológicas distintivas, por lo que son fáciles de reconocer sin una comparación extensa c...
El protocolo descrito aquí proporciona un comienzo simple para que las personas que ingresan desde otros campos de investigación exploren la obtención de imágenes de orgánulos de levadura. Antes de pasar a temas específicos, nos gustaría enfatizar una vez más que es necesario abstenerse del uso excesivo de funciones automáticas en el software de imágenes. Las imágenes de microscopía no son solo imágenes bonitas, son datos científicos y, por lo tanto, su adquisición e inter...
Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio Xie por su generosa ayuda en la preparación de los manuscritos. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención 91957104), la Comisión Municipal de Educación de Shanghái (subvención 2017-01-07-00-02-E00035) y la Comisión Municipal de Ciencia y Tecnología de Shanghái (subvención 22ZR1433800).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adenine | Sangon Biotech | A600013 | |
Casaminoacid | Sangon Biotech | A603060 | |
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma Aldrich | L7647 | |
D-Glucose | Sangon Biotech | A501991 | |
Fiji | https://fiji.sc/ | ||
Glass-bottom petri dish | NEST | 706001 | Φ35 mm |
ImajeJ | https://imagej.net/ | ||
Inverted florescence microscope | Olympus | IX83 equipped with UPLXAPO 100X oil immersion objective, Lumencor Spectra X light source, and Hamamatsu Orca Flash4.0 LT camera. | |
L-Histidine | Sangon Biotech | A604351 | |
L-Leucine | Sangon Biotech | A100811 | |
L-Lysine | Sangon Biotech | A602759 | |
L-Methionine | Sangon Biotech | A100801 | |
L-Tryptophan | Sangon Biotech | A601911 | |
Microscope cover glass | CITOTEST | 10222222C | 22 mm x 22 mm, 0.16–0.19 mm |
Microscope slides | CITOTEST | 1A5101 | 25 mm x 75 mm, 1–1.2 mm |
Peptone | Sangon Biotech | A505247 | |
Uracil | Sangon Biotech | A610564 | |
Visiview | Visitron System GmbH | https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html | |
Yeast extract | Sangon Biotech | A100850 | |
Yeast nitrogen base without amino acids | Sangon Biotech | A610507 | |
YNB without amino acids and ammonium sulfate | Sangon Biotech | A600505 |
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