Visualización de orgánulos de levadura con marcadores de proteínas fluorescentes

Resumen

Aquí describimos el uso de un conjunto de marcadores de orgánulos basados en proteínas fluorescentes en imágenes de células vivas de la levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae.

Resumen

La levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae, es un sistema modelo clásico en el estudio de la función y la dinámica de los orgánulos. En nuestros trabajos anteriores, hemos construido marcadores basados en proteínas fluorescentes para los principales orgánulos y estructuras de endomembranas, incluido el núcleo, el retículo endoplásmico (RE), el aparato de Golgi, los endosomas, las vacuolas, las mitocondrias, los peroxisomas, las gotas de lípidos y los autofagosomas. El protocolo presentado aquí describe los procedimientos para usar estos marcadores en levaduras, incluida la preparación del ADN para la transformación de levaduras, la selección y evaluación de transformantes, la observación microscópica fluorescente y los resultados esperados. El texto está dirigido a investigadores que están ingresando al campo del estudio de orgánulos de levadura desde otros orígenes. Se cubren los pasos esenciales, así como notas técnicas sobre las consideraciones de hardware del microscopio y varios errores comunes. Proporciona un punto de partida para que las personas observen las entidades subcelulares de la levadura mediante microscopía fluorescente de células vivas. Estas herramientas y métodos se pueden utilizar para identificar la localización subcelular de proteínas y rastrear orgánulos de interés en imágenes de lapso de tiempo.

Introducción

La compartimentación subcelular en orgánulos unidos a la membrana es un principio común en la organización de las células eucariotas. Cada orgánulo cumple funciones específicas. Al igual que en muchos otros aspectos de la biología eucariota, la levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae, ha sido un sistema modelo clásico para dilucidar los principios básicos de la organización y dinámica de los orgánulos. Los ejemplos incluyen los descubrimientos seminales en la vía de secreción de proteínas, la vía de importación de proteínas peroxisomales y la vía de autofagia ^1,2,3.

En condiciones típicas ricas en nutrientes, las células de levadura de crecimiento rápido contienen retículo endoplásmico (RE), Golgi temprano, endosomas de Golgi tardío/tempranos, endosomas tardíos, vacuolas y mitocondrias. Algunos peroxisomas, gotas de lípidos y autofagosomas (incluso menos que los dos primeros, principalmente del tipo vesícula Cvt, que están presentes en condiciones ricas en nutrientes⁴) también están presentes, pero no tan prominentes como lo serían en condiciones de cultivo específicas (medios ricos en lípidos, medios de inanición, etc.). En comparación con otros modelos eucariotas comunes, las células de levadura son bastante pequeñas; El diámetro de una célula de levadura típica es de alrededor de 5 μm, en comparación con las decenas de micrómetros de la mayoría de las células animales y vegetales. Como resultado, en el mismo campo de imagen que normalmente contiene una sola célula animal adherente, normalmente se ven decenas de células de levadura en varias etapas del ciclo celular. Además de la diferencia de tamaño, la morfología de los orgánulos de levadura también tiene algunas características peculiares. A nivel ultraestructural, la levadura ER está compuesta por láminas y túbulos, como en otros sistemas. Bajo microscopía fluorescente, la levadura ER se manifiesta como dos anillos con algunas estructuras interconectadas en el medio. El anillo interior es el RE nuclear, que es continuo con la envoltura nuclear, y el anillo exterior es el RE periférico, que es una red tubular que se encuentra debajo de la membrana plasmática⁵. Similar a las células vegetales pero diferente de las células animales, un orgánulo híbrido, el endosoma de Golgi tardío/temprano, se encuentra en la intersección entre la vía secretora y la vía endocítica ^6,7. Morfológicamente, los aparatos de Golgi de levadura se dispersan en el citoplasma. Las vacuolas son funcionalmente análogas a los lisosomas de las células animales. A menudo ocupan grandes porciones del citoplasma y experimentan fisión y fusión frecuentes. Además del uso de marcadores fluorescentes de colocalización, la membrana vacuolar puede distinguirse del RE nuclear por al menos dos criterios: la membrana vacuolar es generalmente más redondeada que el RE nuclear, y la apariencia cóncava de la vacuola en el DIC también es más pronunciada que la del núcleo.

De forma rutinaria, utilizamos un conjunto de marcadores basados en proteínas fluorescentes para visualizar los orgánulos antes mencionados en células de levadura vivas (Tabla 1). La fidelidad y funcionalidad de estos marcadores de orgánulos ha sido verificada experimentalmente ^7,8. Estas construcciones de marcadores están destinadas a introducir casetes de quimeras de proteínas fluorescentes en el genoma de la levadura. Como se describe a continuación, en preparación para la transformación de la levadura, se generan fragmentos lineales de ADN por digestión enzimática o amplificación por PCR ^7,8. Los fragmentos lineales de ADN se integran en el genoma mediante recombinación homóloga. Para los plásmidos descritos en este protocolo, se emplean tres tipos de diseño. En el primer tipo, que cubre la mayoría de los plásmidos, a menudo es posible obtener transformantes que llevan múltiples copias de la construcción. Por lo general, esto no es deseado porque introduce variaciones expresivas y posiblemente funcionales entre los transformantes. Los transformantes de copia única deben identificarse mediante imágenes como se describe en este protocolo, mediante inmunotransferencia o mediante pruebas de PCR cuidadosamente diseñadas. En el segundo tipo, que cubre GFP-Sed5, GFP-Pep12 y GFP-Atg8, solo se produce la integración de una sola copia en las células de levadura haploides. Tanto el primer tipo como el segundo mantienen intacta la copia endógena del gen marcador en el genoma. Un tercer tipo de diseño de plásmido, que cubre Sec7-2GFP y Vph1-2GFP, está destinado a introducir knock-ins C-terminales, lo que lleva a que las quimeras sean la única copia del gen marcador correspondiente.

Aquí describimos el procedimiento para utilizar estos marcadores de orgánulos, proporcionamos imágenes de microscopía ejemplares y discutimos las precauciones orientadas a los investigadores nuevos en la obtención de imágenes de orgánulos de levadura.

Protocolo

1. Construcción de la cepa de levadura

1. Obtener plásmidos marcadores y una cepa de levadura adecuada.
   NOTA: Los plásmidos están disponibles en Addgene. Este protocolo utiliza TN124 (MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ::LEU2), BY4741(MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0) y DJ03 (BY4741 trp1Δ::MET15) como ejemplos. Una consideración importante para la elección de la cepa, aparte de la naturaleza de la pregunta científica, es la compatibilidad de los marcadores de selección. Los plásmidos marcadores de orgánulos descritos aquí utilizan URA3 y TRP1 como marcadores de selección. Por lo tanto, el genotipo de la cepa receptora debe ser ura3 y trp1. De lo contrario, es necesario modificar la cepa o los plásmidos.
2. Prepare los medios de levadura de acuerdo con las siguientes recetas.
   NOTA: SMD (dextrosa mínima sintética; 2% de glucosa, 0,67% de levadura nitrogenada base (YNB) sin aminoácidos, 30 mg/L de adenina, 30 mg/L de lisina, 30 mg/L de metionina, 20 mg/L de histidina, 20 mg/L de uracilo, 50 mg/L de triptófano, 50 mg/L de leucina). SMD+CA (SMD con la adición de 0,5% de ácidos casamino). YPD (Extracto de levadura peptona dextrosa; 1% extracto de levadura, 2% peptona, 2% glucosa). SD-N (dextrosa sintética sin nitrógeno; 0,17% YNB sin aminoácidos y sulfato de amonio, 2% glucosa). Consulte la sección de discusión para conocer las consideraciones sobre la elección del medio.
3. Antes de la etapa de transformación, genere fragmentos de ADN linealizados por digestión enzimática o amplificación por PCR de un plásmido marcador de orgánulos.
   NOTA: En la Tabla 1 se enumeran los sitios de las enzimas de restricción y los cebadores de PCR para generar fragmentos lineales a partir de los plásmidos marcadores de orgánulos.
4. Cultivo de células de levadura en medio líquido YPD y transformación de levadura con fragmentos lineales de ADN.
   NOTA: La transformación de la levadura se puede realizar utilizando el método convencional basado en LiAc⁹ u otros métodos de elección. Es aconsejable incluir controles apropiados para la transformación, en particular, un testigo negativo sin plásmido o ADN derivado de plásmido.
5. Incubar en una placa de selección adecuada (p. ej., para la selección de URA3 , utilizar medio SMD-Ura) a 30 °C durante 2-3 días.
   NOTA: Se necesitan aproximadamente 2 días para que aparezcan las colonias individuales.
6. Para verificar la expresión de quimeras fluorescentes y el número de copias de integración, se seleccionaron ocho colonias de la placa de selección, se volvieron a rayar en placas de selección frescas e incubar a 30 °C.

2. Microscopía de fluorescencia: procedimientos generales e imágenes de punto de tiempo único

1. Cultivo de células de levadura durante la noche en medio líquido SMD a 30 °C con agitación.
2. A la mañana siguiente, mida la densidad óptica del cultivo de levadura a 600 nm (en lo sucesivo denominado OD₆₀₀) en un espectrofotómetro o lector de placas.
   NOTA: Con un poco de práctica en la inoculación de levadura, generalmente se puede asegurar que OD₆₀₀ de todas las muestras es inferior a 2 en esta etapa. Si termina más alto, es recomendable diluir más en el siguiente paso y dejar más tiempo para que las células de levadura se recuperen.
3. Diluya el cultivo de levadura hasta aproximadamente 0,2 OD₆₀₀ utilizando un medio fresco.
4. Continúe cultivando hasta que OD₆₀₀ alcance aproximadamente 0.8-1.0.
   NOTA: El tiempo de duplicación de la levadura es de aproximadamente 1,5-2 h.
5. Coloque un cubreobjetos sobre papel de seda sobre una superficie plana, extienda 5 μL de 1 mg/mL de concanavalina A en la parte superior del cubreobjetos y espere 5 min (Figura 1A)¹⁰.
   NOTA: Este paso de preparación se puede realizar con anticipación.
6. Transfiera 100 μL de cultivo de levadura a la parte superior del cubreobjetos y espere 5 minutos.
7. Combine la cubierta de vidrio con un portaobjetos de vidrio de soporte, con las células de levadura intercaladas en el medio; Presione con la fuerza adecuada para asegurar el accesorio.
   NOTA: Se necesita algo de práctica para encontrar la presión correcta, de modo que las células de levadura formen una sola capa inmóvil pero no se trituren (Figura 1B). El medio líquido será empujado hacia afuera y absorbido por el papel de seda subyacente durante este paso.
8. Monte el portamuestras en la platina del microscopio. Localice y enfoque un parche de células de levadura mediante iluminación de contraste de interferencia diferencial (DIC) o contraste de fase (PC).
   NOTA: No utilice fluorescencia para localizar células; De lo contrario, la señal puede blanquearse antes de la recopilación de datos.
9. Configure manualmente tres conjuntos de parámetros para recopilar pilas z de imágenes: sección z, canales de imagen y parámetros de exposición.
   NOTA: Consulte la Figura complementaria 1 para ver ejemplos de GUI de configuración de parámetros en un software comercial. El aspecto exacto difiere según las plataformas de software, pero las opciones son más o menos las mismas.
   1. Sección Z: Recoja las rodajas a pasos de 0,5 μm para 15 rebanadas (cubriendo una profundidad de 7 μm, generalmente suficiente para las células de levadura haploides normales).
   2. Canales de imagen: Seleccione DIC o PC para los contornos celulares y los canales de fluorescencia apropiados según sea necesario.
   3. Intensidad de la luz de excitación y tiempo de exposición: Ajuste la intensidad de la luz de excitación y el tiempo de exposición según corresponda para la muestra.
      NOTA: Como punto de partida, utilice el 100% para la intensidad de la luz de excitación y 100 ms para el tiempo de exposición; disminuir la intensidad de la luz si el fotoblanqueo se hace evidente con la progresión de la recolección de z-stack o si la señal excede la capacidad de grabación de la cámara (es decir, la saturación de la señal); Aumente la intensidad de la luz si la relación señal-ruido es baja.
10. Anote la configuración de la imagen y utilice la misma configuración para todas las muestras que se van a comparar.
    NOTA: No utilice la configuración "automática" para la recopilación de datos y la visualización de imágenes. Es importante registrar los ajustes en una nota de laboratorio para que se puedan volver a aplicar exactamente los mismos parámetros en futuras repeticiones experimentales. Algunas aplicaciones de software de control de microscopio tienen la capacidad de guardar y volver a aplicar configuraciones; Aun así, es aconsejable registrar la configuración de forma independiente porque los perfiles de software pueden ser eliminados o modificados involuntariamente por los compañeros de trabajo.
11. Guarde los datos en formato de pila multicanal de 16 bits.
    NOTA: No guarde como imágenes RGB de 8 bits (o de 24 bits, si se cuentan los tres colores). Consulte la sección de visualización de imágenes (Sección 4) para conocer las limitaciones del formato de 8 bits.
12. Muévase a un área completamente diferente para la siguiente colección de pila de imágenes.
    NOTA: Las áreas adyacentes pueden haber experimentado fotoblanqueo y fototoxicidad. Como resultado, la pila de imágenes recopilada de estas áreas puede ser engañosa.

3. Imágenes de lapso de tiempo

NOTA: El procedimiento de obtención de imágenes de lapso de tiempo difiere del de las imágenes de un solo punto de tiempo en dos áreas: preparación de la muestra y parámetros de obtención de imágenes.

1. Preparación de la muestra
   1. Cubra un plato con fondo de vidrio de 35 mm con 1 mg/ml de concanavalina A y espere 5 minutos o más.
   2. Agregue 1,5 ml de cultivo líquido de levadura al plato y espere 5 minutos para permitir que las células de levadura se asienten en la superficie del vidrio.
   3. Con una pipeta, aspire el medio líquido desde el borde de la placa, luego enjuague suavemente el parche de sedimento de levadura con aproximadamente 1 ml de medio fresco para eliminar las células adheridas de forma segura.
   4. Repita el enjuague 2-3 veces. Aspire con una pipeta, luego agregue suavemente 2 mL de medio de cultivo fresco.
2. Parámetros de imagen
   1. Sección en Z: Recoja los cortes a pasos de 0,5 μm para 15 cortes.
   2. Canales de imagen: Seleccione según sea necesario.
   3. Intensidad lumínica de excitación y tiempo de exposición: Utilizar el mínimo necesario para discernir la estructura subcelular que se está investigando.
      NOTA: Para las imágenes de lapso de tiempo, el fotoblanqueo y la fototoxicidad de la iluminación repetida limitan el número total de puntos de tiempo que se pueden recopilar. Por lo tanto, la intensidad de excitación y el tiempo de exposición generalmente se establecen en valores bajos para que se puedan obtener imágenes de más puntos de tiempo.
   4. Intervalo de imagen: Establezca los intervalos de tiempo apropiados para el proceso biológico que se está investigando.
      NOTA: Por ejemplo, la formación de un autofagosoma en condiciones de inanición tarda unos 5-10 min; Se prefiere un intervalo de 1 minuto o menos para realizar un seguimiento de su dinámica. En condiciones ricas en nutrientes, el ciclo celular de la levadura ocurre en la escala de horas; Se puede utilizar un intervalo más largo, como 10-20 minutos.
3. Si se dispone de los herrajes adecuados, mantenga la temperatura del plato a 30 °C.
   NOTA: La mayoría de los procesos biológicos en las células de levadura también se pueden obtener imágenes a temperatura ambiente (RT), excepto a un ritmo más lento en general.

4. Visualización de pilas de imágenes y evaluación del número de copia de integración

1. Instale el software Fiji o ImageJ para la visualización y el análisis de imágenes ^11,12.
   NOTA: Fiji es una colección de herramientas basada en ImageJ, adecuada para la visualización y el procesamiento de datos de imágenes biológicas de propósito general. Para el procesamiento de imágenes enumerado en este protocolo, ImageJ sin complementos adicionales es suficiente.
2. Elija los parámetros adecuados para la visualización y comparación de imágenes.
   1. En Fiyi, abre un par de imágenes de pila z.
   2. Arrastre la posición z de cada pila a la sección central (u otras posiciones si la estructura que se está investigando se visualiza mejor allí).
   3. Vaya a Imagen > Ajustar > Brillo/Contraste y haga clic en Restablecer.
   4. En la ventana Brillo/Contraste (B&C), utilice las barras de desplazamiento para cambiar dos parámetros, los valores Mínimo y Máximo , para discernir claramente la estructura que se está investigando.
      NOTA: Por lo general, el valor mínimo se establece para que esté cerca del valor promedio en las áreas vacías y el valor máximo se establece para que esté cerca del máximo en la imagen. Esos valores se pueden inferir del histograma mostrado (Figura 2A). Si la estación de trabajo de imágenes está calibrada por colores, el valor mínimo se puede establecer ligeramente más alto para ocultar más señales de fondo.
   5. En la ventana de Brillo/Contraste (B&C), haga clic en Establecer y seleccione la casilla de verificación Propagar a todas las demás imágenes abiertas en la ventana emergente Establecer rango de visualización.
      NOTA: Esta operación aplica los mismos ajustes de brillo/contraste (incluidos los valores mínimo y máximo) a todas las imágenes abiertas para que las imágenes se puedan comparar.
   6. Mire a través de diferentes imágenes y desplácese por la pila z en cada una. Si las imágenes se ven bien con un fondo oscuro adecuado y pequeñas saturaciones exageradas, anote los ajustes Mínimo y Máximo .
3. En el caso de las imágenes multicanal, seleccione la configuración de visualización de imágenes para cada canal:
   1. Vaya a la herramienta Imagen > Color > Canales, seleccione el modo Escala de grises en la ventana emergente Canales.
   2. Revisa cada canal, elige el brillo/contraste adecuado para ese canal y anota los ajustes.
   3. Con el Brillo/Contraste ajustado, vuelva a la ventana Canales y cambie al modo Compuesto para la visualización simultánea de varios canales.
      NOTA: El pseudo color de cada canal se puede cambiar manualmente en Canales para adaptarlo a las preferencias personales. Las casillas de verificación son para mostrar/ocultar canales particulares.
4. Si es necesario, utilice las casillas de verificación de la ventana Canales para mostrar u ocultar canales concretos.
5. Si lo desea, genere proyecciones de pila yendo a Imagen > Pilas > Proyecto Z.
   NOTA: Hay varios modos de proyección disponibles. La intensidad máxima es una buena opción para una evaluación rápida. Se debe tener en cuenta la naturaleza de la investigación para determinar si se debe utilizar un modo de proyección particular o cortes individuales para la cuantificación. La proyección también se puede limitar a seleccionar cortes en Z para reducir la interferencia de la luz desenfocada.
6. Pantalla para transformadores de integración de copia única.
   1. Una vez que se aplican los mismos ajustes de Brillo/Contraste en todas las imágenes abiertas, compare las intensidades de la imagen en todas las muestras para inferir el número de integración del plásmido.
      NOTA: Las imágenes deben adquirirse siguiendo el procedimiento general para la obtención de imágenes de un solo punto de tiempo, comenzando con el cultivo durante la noche en un medio líquido. Las integraciones de copia múltiple (consulte la colonia 2 y 3 en la Figura 2B para ver ejemplos) se ven sustancialmente más brillantes que las de copia única (colonia 1 en la Figura 2B). Por el contrario, los de una sola copia se parecen entre sí (Figura 2B).
   2. Examine las imágenes de ocho transformantes para cada cepa, asegurándose de utilizar los mismos ajustes de brillo/contraste .
   3. Vuelva a rayar y guarde tres o más transformantes de una sola copia para su estudio posterior.
7. Exporte imágenes para su presentación.
   1. Vaya a Duplicar imagen > para hacer una copia de la imagen de interés y asígnele el nombre que elija.
   2. Vaya a Imagen > Escriba > 8 bits para convertir la copia duplicada de 16 bits a 8 bits y guárdela según sea necesario.
      NOTA: Tenga en cuenta que una vez que se aplica esto, si los ajustes de Brillo/Contraste no se han anotado previamente, no hay una forma fácil de recuperar esa información y, por lo tanto, no hay una forma fácil de volver a aplicar el mismo ajuste en visualizaciones de imágenes posteriores. Esta es también la razón por la que se recomienda la operación de duplicación anterior.
   3. Para dividir una pila z en una colección de imágenes individuales, vaya a Pilas de > de imágenes > Apilar a imágenes y guárdelas según sea necesario.
      NOTA: Las imágenes también se pueden recortar a un área más pequeña en Fiji.

Resultados

La morfología y la dinámica de los orgánulos están sujetas a cambios a medida que las células de levadura responden a señales externas e internas. Aquí, proporcionamos imágenes representativas de orgánulos de levadura en la fase de registro medio (Figura 3A, B). Como se mencionó anteriormente, varios orgánulos tienen sus características morfológicas distintivas, por lo que son fáciles de reconocer sin una comparación extensa c...

Discusión

El protocolo descrito aquí proporciona un comienzo simple para que las personas que ingresan desde otros campos de investigación exploren la obtención de imágenes de orgánulos de levadura. Antes de pasar a temas específicos, nos gustaría enfatizar una vez más que es necesario abstenerse del uso excesivo de funciones automáticas en el software de imágenes. Las imágenes de microscopía no son solo imágenes bonitas, son datos científicos y, por lo tanto, su adquisición e inter...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sangon Biotech	A600013
Casaminoacid	Sangon Biotech	A603060
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack bean)	Sigma Aldrich	L7647
D-Glucose	Sangon Biotech	A501991
Fiji			https://fiji.sc/
Glass-bottom petri dish	NEST	706001	Φ35 mm
ImajeJ			https://imagej.net/
Inverted florescence microscope	Olympus		IX83 equipped with UPLXAPO 100X oil immersion objective, Lumencor Spectra X light source, and Hamamatsu Orca Flash4.0 LT camera.
L-Histidine	Sangon Biotech	A604351
L-Leucine	Sangon Biotech	A100811
L-Lysine	Sangon Biotech	A602759
L-Methionine	Sangon Biotech	A100801
L-Tryptophan	Sangon Biotech	A601911
Microscope cover glass	CITOTEST	10222222C	22 mm x 22 mm, 0.16–0.19 mm
Microscope slides	CITOTEST	1A5101	25 mm x 75 mm, 1–1.2 mm
Peptone	Sangon Biotech	A505247
Uracil	Sangon Biotech	A610564
Visiview	Visitron System GmbH		https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html
Yeast extract	Sangon Biotech	A100850
Yeast nitrogen base without amino acids	Sangon Biotech	A610507
YNB without amino acids and ammonium sulfate	Sangon Biotech	A600505