Visualizando organelas de levedura com marcadores de proteína fluorescentes

Resumo

Aqui descrevemos o uso de um conjunto de marcadores de organela à base de proteínas fluorescentes em imagens de células vivas da levedura em brotamento, Saccharomyces cerevisiae.

Resumo

A levedura em brotamento, Saccharomyces cerevisiae, é um sistema modelo clássico no estudo da função e dinâmica das organelas. Em nossos trabalhos anteriores, construímos marcadores baseados em proteínas fluorescentes para as principais organelas e estruturas endomembranares, incluindo o núcleo, retículo endoplasmático (ER), aparelho de Golgi, endossomos, vacúolos, mitocôndrias, peroxissomos, gotículas lipídicas e autofagossomos. O protocolo aqui apresentado descreve os procedimentos para o uso desses marcadores em leveduras, incluindo preparação de DNA para transformação de leveduras, seleção e avaliação de transformantes, observação microscópica fluorescente e os resultados esperados. O texto é voltado para pesquisadores que estão entrando no campo do estudo de organelas de levedura de outras origens. Etapas essenciais são abordadas, bem como notas técnicas sobre considerações de hardware do microscópio e várias armadilhas comuns. Ele fornece um ponto de partida para as pessoas observarem entidades subcelulares de levedura por microscopia fluorescente de células vivas. Essas ferramentas e métodos podem ser usados para identificar a localização subcelular de proteínas e rastrear organelas de interesse em imagens de lapso de tempo.

Introdução

A compartimentalização subcelular em organelas ligadas à membrana é um princípio comum na organização das células eucarióticas. Cada organela cumpre funções específicas. Como em muitos outros aspectos da biologia eucariótica, a levedura em brotamento, Saccharomyces cerevisiae, tem sido um sistema modelo clássico na elucidação dos princípios básicos da organização e dinâmica das organelas. Exemplos incluem as descobertas seminais na via de secreção de proteínas, na via de importação de proteínas peroxissomais e na via de autofagia ^1,2,3.

Em condições típicas ricas em nutrientes, as células de levedura de crescimento rápido contêm retículo endoplasmático (RE), Golgi inicial, Golgi tardio / endossomos iniciais, endossomas tardios, vacúolos e mitocôndrias. Alguns peroxissomos, gotículas lipídicas e autofagossomos (ainda menos do que os dois primeiros, principalmente do tipo vesícula Cvt, que estão presentes em condições ricas em nutrientes⁴) também estão presentes, mas não tão proeminentes quanto seriam em condições específicas de cultura (meios ricos em lipídios, meios de fome, etc.). Em comparação com outros modelos eucarióticos comuns, as células de levedura são bastante pequenas; O diâmetro de uma célula de levedura típica é de cerca de 5 μm, em comparação com dezenas de micrômetros para a maioria das células animais e vegetais. Como resultado, no mesmo campo de imagem que normalmente contém uma única célula animal aderente, normalmente se vê dezenas de células de levedura em vários estágios do ciclo celular. Além da diferença de tamanho, a morfologia da organela da levedura também possui algumas características peculiares. No nível ultraestrutural, o ER de levedura é composto por folhas e túbulos, como em outros sistemas. Sob microscopia fluorescente, o ER de levedura se manifesta como dois anéis com algumas estruturas interconectadas entre eles. O anel interno é o RE nuclear, que é contínuo com o envelope nuclear, e o anel externo é o RE periférico, que é uma rede tubular situada abaixo da membrana plasmática⁵. Semelhante às células vegetais, mas diferente das células animais, uma organela híbrida, o endossomo tardio de Golgi / precoce, fica na interseção entre a via secretora e a via endocítica ^6,7. Morfologicamente, os aparelhos de Golgi de levedura estão dispersos no citoplasma. Os vacúolos são funcionalmente análogos aos lisossomos em células animais. Eles geralmente ocupam grandes porções do citoplasma e sofrem fissão e fusão frequentes. Além do uso de marcadores de colocalização fluorescentes, a membrana vacuolar pode ser distinguida do ER nuclear por pelo menos dois critérios: A membrana vacuolar é geralmente mais arredondada do que o ER nuclear, e a aparência côncava do vacúolo na CIVD também é mais pronunciada do que a do núcleo.

Rotineiramente, usamos um conjunto de marcadores baseados em proteínas fluorescentes para visualizar as organelas mencionadas em células vivas de levedura (Tabela 1). A fidelidade e funcionalidade desses marcadores de organelas foram verificadas experimentalmente ^7,8. Essas construções de marcadores destinam-se a introduzir de quimera de proteína fluorescente no genoma da levedura. Conforme descrito abaixo, em preparação para a transformação da levedura, fragmentos lineares de DNA são gerados por digestão enzimática ou amplificação por PCR ^7,8. Os fragmentos lineares de DNA são integrados ao genoma por meio de recombinação homóloga. Para os plasmídeos descritos neste protocolo, três tipos de design são empregados. No primeiro tipo, cobrindo a maioria dos plasmídeos, muitas vezes é possível obter transformantes carregando várias cópias da construção. Isso geralmente é indesejado porque introduz variações expressivas e possivelmente funcionais entre os transformantes. Os transformantes de cópia única precisam ser identificados por meio de imagens, conforme descrito neste protocolo, por immunoblotting ou por testes de PCR cuidadosamente projetados. No segundo tipo, abrangendo GFP-Sed5, GFP-Pep12 e GFP-Atg8, apenas a integração de cópia única é produzida em células de levedura haplóides. Tanto o primeiro tipo quanto o segundo tipo mantêm a cópia endógena do gene marcador intacta no genoma. Um terceiro tipo de projeto de plasmídeo, cobrindo Sec7-2GFP e Vph1-2GFP, destina-se a introduzir knock-ins C-terminal, levando as quimeras a serem a única cópia do gene marcador correspondente.

Aqui, descrevemos o procedimento para utilizar esses marcadores de organela, fornecemos imagens de microscopia exemplares e discutimos as precauções voltadas para pesquisadores novos em imagens de organelas de levedura.

Protocolo

1. Construção da cepa de levedura

1. Obter plasmídeos marcadores e uma estirpe de levedura adequada.
   NOTA: Os plasmídeos estão disponíveis na Addgene. Este protocolo utiliza TN124 (MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ::LEU2), BY4741(MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0) e DJ03 (BY4741 trp1Δ::MET15) como exemplos. Uma consideração importante para a escolha da cepa, além da natureza da questão científica, é a compatibilidade dos marcadores de seleção. Os plasmídeos marcadores de organelas descritos aqui usam URA3 e TRP1 como marcadores de seleção. Portanto, o genótipo da cepa receptora precisa ser ura3 e trp1. Caso contrário, é necessário modificar a cepa ou os plasmídeos.
2. Prepare o meio de fermento de acordo com as seguintes receitas.
   NOTA: SMD (dextrose mínima sintética; 2% de glicose, 0,67% de base de nitrogênio de levedura (YNB) sem aminoácidos, 30 mg/L de adenina, 30 mg/L de lisina, 30 mg/L de metionina, 20 mg/L de histidina, 20 mg/L de uracila, 50 mg/L de triptofano, 50 mg/L de leucina). SMD+CA (SMD com adição de 0,5% de casaminoácidos). YPD (dextrose peptonada de extrato de levedura; 1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 2% de glicose). SD-N (dextrose sintética sem nitrogênio; 0,17% YNB sem aminoácidos e sulfato de amônio, 2% de glicose). Consulte a seção Discussão para considerações sobre a escolha do meio.
3. Antes da etapa de transformação, gere fragmentos de DNA linearizados por digestão enzimática ou amplificação por PCR de um plasmídeo marcador de organela.
   NOTA: A Tabela 1 lista os locais de enzimas de restrição e primers de PCR para gerar fragmentos lineares dos plasmídeos marcadores de organelas.
4. Cultive células de levedura em meio YPD líquido e transforme a levedura com fragmento de DNA linear.
   NOTA: A transformação da levedura pode ser realizada usando o método convencional baseado em LiAc⁹ ou outros métodos de sua escolha. É aconselhável incluir controlos adequados para a transformação, em especial um controlo negativo sem plasmídeo ou ADN derivado do plasmídeo.
5. Incubar numa placa de seleção apropriada (por exemplo, para a seleção URA3 , utilizar meio SMD-Ura) a 30 °C durante 2-3 dias.
   NOTA: Demora cerca de 2 dias para que colônias únicas apareçam.
6. Para verificar a expressão da quimera fluorescente e o número de cópias de integração, escolher oito colónias da placa de selecção, voltar a listrar em placas de selecção frescas e incubar a 30 °C.

2. Microscopia de fluorescência: procedimentos gerais e imagem de ponto único no tempo

1. Cultivar células de levedura durante a noite em meio líquido SMD a 30 °C com agitação.
2. Na manhã seguinte, medir a densidade óptica da cultura de leveduras a 600 nm (a seguir designada por OD₆₀₀) num espectrofotómetro ou leitor de placas.
   NOTA: Com alguma prática na inoculação de leveduras, geralmente pode-se garantir que o OD₆₀₀ de todas as amostras seja inferior a 2 nesta fase. Se acabar mais alto, é aconselhável diluir mais na próxima etapa e dar mais tempo para que as células de levedura se recuperem.
3. Dilua a cultura de levedura para aproximadamente 0,2 OD₆₀₀ usando um meio fresco.
4. Continue cultivando até que OD₆₀₀ atinja aproximadamente 0,8-1,0.
   NOTA: O tempo de duplicação do fermento é de cerca de 1,5-2 h.
5. Coloque uma lamínula em cima do papel de seda em uma superfície plana, espalhe 5 μL de 1 mg/mL de concanavalina A na parte superior da lamínula e aguarde 5 min (Figura 1A)¹⁰.
   NOTA: Esta etapa de preparação pode ser feita com antecedência.
6. Transfira 100 μL de cultura de levedura para a parte superior da lamínula e aguarde 5 min.
7. Combine a lamínula com uma lâmina de vidro de suporte, com as células de levedura imprensadas no meio; Pressione com a força apropriada para prender o acessório.
   NOTA: É preciso alguma prática para encontrar a pressão certa, de modo que as células de levedura formem uma camada única imóvel, mas não sejam esmagadas (Figura 1B). O meio líquido será empurrado para fora e absorvido pelo papel de seda subjacente durante esta etapa.
8. Monte a lâmina de amostra no microscópio stage. Localize e concentre-se em um pedaço de células de levedura usando contraste de interferência diferencial (DIC) ou iluminação de contraste de fase (PC).
   NOTA: Não use fluorescência para localizar células; caso contrário, o sinal pode ser branqueado antes da coleta de dados.
9. Configure manualmente três conjuntos de parâmetros para coletar pilhas z de imagem: corte z, canais de imagem e parâmetros de exposição.
   NOTA: Consulte a Figura 1 suplementar para obter exemplos de GUI de configurações de parâmetros em um software comercial. A aparência exata difere entre as plataformas de software, mas as opções são mais ou menos as mesmas.
   1. Seccionamento em Z: Colete fatias a passos de 0,5 μm para 15 fatias (cobrindo 7 μm de profundidade, geralmente suficiente para células de levedura haplóides normais).
   2. Canais de imagem: Selecione DIC ou PC para contornos celulares e canais de fluorescência apropriados, conforme necessário.
   3. Intensidade da luz de excitação e tempo de exposição: Defina a intensidade da luz de excitação e o tempo de exposição conforme apropriado para a amostra.
      NOTA: Como ponto de partida, use 100% para intensidade de luz de excitação e 100 ms para tempo de exposição; diminuir a intensidade da luz se o fotobranqueamento se tornar óbvio com a progressão da coleta da pilha z ou se o sinal exceder a capacidade de gravação da câmera (ou seja, saturação do sinal); Aumente a intensidade da luz se a relação sinal-ruído for baixa.
10. Anote as configurações de imagem e use as mesmas configurações para todas as amostras a serem comparadas.
    NOTA: Não use a configuração "auto" para coleta de dados e visualização de imagens. É importante registrar as configurações em uma nota de laboratório para que exatamente os mesmos parâmetros possam ser reaplicados em futuras repetições experimentais. Alguns aplicativos de software de controle de microscópio têm a capacidade de salvar e reaplicar configurações; Mesmo assim, é aconselhável ter as configurações registradas de forma independente, pois os perfis de software podem ser excluídos ou modificados involuntariamente por colegas de trabalho.
11. Salve os dados no formato de pilha multicanal de 16 bits.
    NOTA: Não salve como imagens RGB de 8 bits (ou 24 bits, se contar todas as três cores). Consulte a seção de visualização de imagem (Seção 4) para obter as limitações do formato de 8 bits.
12. Mova para uma área completamente diferente para a próxima coleção de pilha de imagens.
    NOTA: As áreas adjacentes podem ter sofrido fotobranqueamento e fototoxicidade. Como resultado, a pilha de imagens coletada dessas áreas pode ser enganosa.

3. Imagem com lapso de tempo

NOTA: O procedimento de imagem com lapso de tempo difere daquele para imagens de ponto único em duas áreas: preparação da amostra e parâmetros de imagem.

1. Preparação da amostra
   1. Cubra uma placa com fundo de vidro de 35 mm com 1 mg/ml de concanavalina A e aguarde 5 minutos ou mais.
   2. Adicione 1,5 mL de cultura líquida de levedura ao prato e aguarde 5 minutos para permitir que as células de levedura se assentem na superfície do vidro.
   3. Usando uma pipeta, aspire o meio líquido da borda do prato e, em seguida, enxágue suavemente o remendo de sedimento de levedura com cerca de 1 mL de meio fresco para remover as células inseguras.
   4. Repita o enxágue 2-3 vezes. Aspire com uma pipeta e, em seguida, adicione suavemente 2 mL de meio de cultura fresco.
2. Parâmetros de imagem
   1. Seccionamento em Z: Colete fatias a 0,5 μm por 15 fatias.
   2. Canais de imagem: Selecione conforme necessário.
   3. Intensidade da luz de excitação e tempo de exposição: Use o mínimo necessário para discernir a estrutura subcelular sob investigação.
      NOTA: Para imagens de lapso de tempo, fotobranqueamento e fototoxicidade de iluminação repetida limitam o número total de pontos de tempo que podem ser coletados. Portanto, a intensidade de excitação e o tempo de exposição geralmente são definidos para valores baixos para que mais pontos de tempo possam ser visualizados.
   4. Intervalo de imagem: Defina os intervalos de tempo apropriados para o processo biológico que está sendo investigado.
      NOTA: Por exemplo, a formação de um autofagossomo em condições de fome leva cerca de 5 a 10 minutos; Um intervalo de 1 min ou menos é preferido para rastrear sua dinâmica. Sob condições ricas em nutrientes, o ciclo celular da levedura ocorre na escala horária; Um intervalo mais longo, como 10-20 min, pode ser utilizado.
3. Se houver hardware adequado disponível, mantenha a temperatura do prato em 30 °C.
   NOTA: A maioria dos processos biológicos em células de levedura também pode ser visualizada à temperatura ambiente (RT), exceto em um ritmo mais lento em geral.

4. Visualização de pilhas de imagens e avaliação do número de cópias de integração

1. Instale o software Fiji ou ImageJ para visualização e análise de imagens^11,12.
   NOTA: Fiji é uma coleção de ferramentas baseada em ImageJ, adequada para visualização e processamento de dados de imagens biológicas de uso geral. Para o processamento de imagens listado neste protocolo, o ImageJ sem plug-ins adicionais é suficiente.
2. Escolha os parâmetros apropriados para exibição e comparação de imagens.
   1. Em Fiji, abra algumas imagens z-stack.
   2. Arraste a posição z em cada pilha para a seção intermediária (ou outras posições, se a estrutura sob investigação for melhor visualizada lá).
   3. Vá para Imagem > Ajustar > Brilho/Contraste e clique em Redefinir.
   4. Na janela Brilho/Contraste (B&C), use as barras de rolagem para alterar dois parâmetros, valores Mínimo e Máximo , para discernir claramente a estrutura sob investigação.
      NOTA: Geralmente, o valor mínimo é definido para estar próximo do valor médio em áreas vazias e o máximo é definido para estar próximo do máximo na imagem. Esses valores podem ser inferidos a partir do histograma exibido (Figura 2A). Se a estação de trabalho de imagem estiver calibrada por cores, o valor mínimo pode ser definido um pouco mais alto para ocultar mais sinais de fundo.
   5. Na janela Brilho/Contraste (B&C), clique em Definir e marque a caixa de seleção Propagar para todas as outras imagens abertas na janela pop-up Definir intervalo de exibição.
      NOTA: Esta operação aplica as mesmas configurações de brilho/contraste (incluindo os valores mínimo e máximo) a todas as imagens abertas para que as imagens possam ser comparadas cruzadamente.
   6. Olhe através de imagens diferentes e percorra a pilha z em cada uma. Se as imagens ficarem boas com um fundo escuro adequado e pequenas saturações exageradas, anote as configurações Mínimo e Máximo .
3. Para imagens multicanal, escolha as configurações de exibição de imagem para cada canal:
   1. Vá para a ferramenta Imagem > Cor > Canais, selecione o modo Escala de cinza na janela pop-up Canais.
   2. Percorra cada canal, escolha o brilho/contraste adequado para esse canal e anote as configurações.
   3. Com o Brilho/Contraste ajustado, volte para a janela Canais e mude para o modo Composto para visualização simultânea de vários canais.
      NOTA: A pseudo cor de cada canal pode ser alterada manualmente em Canais de acordo com a preferência pessoal. As caixas de seleção são para mostrar/ocultar canais específicos.
4. Se necessário, use as caixas de seleção na janela Canais para mostrar ou ocultar canais específicos.
5. Se desejar, gere projeções de pilha acessando Pilhas de > de imagem > Z Project.
   NOTA: Vários modos de projeção estão disponíveis. A intensidade máxima é uma boa escolha para avaliação rápida. A natureza da pesquisa deve ser considerada para determinar se um modo de projeção específico ou fatias individuais devem ser usados para quantificação. A projeção também pode ser limitada a fatias z selecionadas para reduzir a interferência da luz fora de foco.
6. Tela para transformantes de integração de cópia única.
   1. Depois que as mesmas configurações de brilho/contraste forem aplicadas em todas as imagens abertas, compare as intensidades da imagem entre as amostras para inferir o número de integração do plasmídeo.
      NOTA: As imagens devem ser adquiridas seguindo o procedimento geral para imagens de ponto de tempo único, começando com a cultura noturna em meio líquido. As integrações de várias cópias (consulte as colônias 2 e 3 na Figura 2B para obter exemplos) parecem substancialmente mais brilhantes do que as de cópia única (colônia 1 na Figura 2B). Em contraste, os de cópia única são semelhantes entre si (Figura 2B).
   2. Examine imagens de oito transformantes para cada cepa, certificando-se de usar as mesmas configurações de brilho/contraste .
   3. Listre novamente e salve três ou mais transformantes de cópia única para estudo subsequente.
7. Exporte imagens para apresentação.
   1. Vá para Imagem > Duplicar para fazer uma cópia da imagem de interesse e dê a ela um nome de sua escolha.
   2. Vá para Imagem > Digite > 8 bits para converter a cópia duplicada de 16 bits para 8 bits e salvá-la conforme necessário.
      NOTA: Esteja ciente de que, uma vez que isso seja aplicado, se as configurações de Brilho/Contraste não forem anotadas anteriormente, não há uma maneira fácil de recuperar essas informações e, portanto, nenhuma maneira fácil de reaplicar a mesma configuração em visualizações de imagem subsequentes. Esta é também a razão pela qual a operação de duplicação anterior é recomendada.
   3. Para dividir uma pilha z em uma coleção de imagens individuais, vá para Pilhas de > de imagem > Pilha para imagens e salve conforme necessário.
      NOTA: As imagens também podem ser cortadas para uma área menor em Fiji.

Resultados

A morfologia e a dinâmica das organelas estão sujeitas a alterações à medida que as células de levedura respondem a sinais externos e internos. Aqui, fornecemos imagens representativas de organelas de levedura na fase intermediária (Figura 3A, B). Como mencionado anteriormente, várias organelas têm suas características morfológicas distintas, portanto, são fáceis de reconhecer sem comparação extensa com outros marcadores de or...

Discussão

O protocolo descrito aqui fornece um começo simples para pessoas que entram de outros campos de pesquisa para explorar organelas de levedura de imagem. Antes de passar para tópicos específicos, gostaríamos de enfatizar mais uma vez que é preciso evitar o uso excessivo de recursos automáticos em softwares de imagem. As imagens de microscopia não são apenas imagens bonitas, são dados científicos e, portanto, sua aquisição e interpretação devem ser tratadas de acordo. É espec...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sangon Biotech	A600013
Casaminoacid	Sangon Biotech	A603060
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack bean)	Sigma Aldrich	L7647
D-Glucose	Sangon Biotech	A501991
Fiji			https://fiji.sc/
Glass-bottom petri dish	NEST	706001	Φ35 mm
ImajeJ			https://imagej.net/
Inverted florescence microscope	Olympus		IX83 equipped with UPLXAPO 100X oil immersion objective, Lumencor Spectra X light source, and Hamamatsu Orca Flash4.0 LT camera.
L-Histidine	Sangon Biotech	A604351
L-Leucine	Sangon Biotech	A100811
L-Lysine	Sangon Biotech	A602759
L-Methionine	Sangon Biotech	A100801
L-Tryptophan	Sangon Biotech	A601911
Microscope cover glass	CITOTEST	10222222C	22 mm x 22 mm, 0.16–0.19 mm
Microscope slides	CITOTEST	1A5101	25 mm x 75 mm, 1–1.2 mm
Peptone	Sangon Biotech	A505247
Uracil	Sangon Biotech	A610564
Visiview	Visitron System GmbH		https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html
Yeast extract	Sangon Biotech	A100850
Yeast nitrogen base without amino acids	Sangon Biotech	A610507
YNB without amino acids and ammonium sulfate	Sangon Biotech	A600505