Visualizzazione degli organelli di lievito con marcatori proteici fluorescenti

Riepilogo

Qui descriviamo l'uso di una serie di marcatori di organelli basati su proteine fluorescenti nell'imaging di cellule vive del lievito in gemmazione, Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Il lievito in gemmazione, Saccharomyces cerevisiae, è un classico sistema modello nello studio della funzione e della dinamica degli organelli. Nei nostri lavori precedenti, abbiamo costruito marcatori fluorescenti basati su proteine per i principali organelli e strutture endomembrana, tra cui il nucleo, il reticolo endoplasmatico (ER), l'apparato di Golgi, gli endosomi, i vacuoli, i mitocondri, i perossisomi, le goccioline lipidiche e gli autofagosomi. Il protocollo qui presentato descrive le procedure per l'utilizzo di questi marcatori nel lievito, tra cui la preparazione del DNA per la trasformazione del lievito, la selezione e la valutazione dei trasformanti, l'osservazione al microscopio fluorescente e i risultati attesi. Il testo è rivolto ai ricercatori che stanno entrando nel campo dello studio degli organelli di lievito da altri background. Vengono trattati i passaggi essenziali, nonché le note tecniche sulle considerazioni sull'hardware del microscopio e diverse insidie comuni. Fornisce un punto di partenza per osservare le entità subcellulari del lievito mediante microscopia fluorescente su cellule vive. Questi strumenti e metodi possono essere utilizzati per identificare la localizzazione subcellulare delle proteine e tracciare gli organelli di interesse nell'imaging time-lapse.

Introduzione

La compartimentazione subcellulare in organelli legati alla membrana è un principio comune nell'organizzazione delle cellule eucariotiche. Ogni organello svolge funzioni specifiche. Come in molti altri aspetti della biologia eucariotica, il lievito in gemmazione, Saccharomyces cerevisiae, è stato un classico sistema modello nel chiarire i principi di base dell'organizzazione e della dinamica degli organelli. Gli esempi includono le scoperte seminali nella via di secrezione proteica, nella via di importazione delle proteine perossisomiali e nella via dell'autofagia ^1,2,3.

Nelle tipiche condizioni ricche di sostanze nutritive, le cellule di lievito a crescita rapida contengono reticolo endoplasmatico (ER), Golgi precoce, Golgi tardivo/endosomi precoci, endosomi tardivi, vacuoli e mitocondri. Alcuni perossisomi, goccioline lipidiche e autofagosomi (anche meno dei primi due, principalmente del tipo vescicola Cvt, che sono presenti in condizioni ricche di nutrienti⁴) sono presenti, ma non così prominenti come lo sarebbero in specifiche condizioni di coltura (terreni ricchi di lipidi, terreni di fame, ecc.). Rispetto ad altri modelli eucariotici comuni, le cellule di lievito sono piuttosto piccole; Il diametro di una tipica cellula di lievito è di circa 5 μm, rispetto alle decine di micrometri della maggior parte delle cellule animali e vegetali. Di conseguenza, nello stesso campo di imaging che normalmente contiene una singola cellula animale aderente, si vedono normalmente decine di cellule di lievito in vari stadi del ciclo cellulare. Oltre alla differenza di dimensioni, la morfologia degli organelli di lievito ha anche alcune caratteristiche peculiari. A livello ultrastrutturale, l'ER del lievito è composto da fogli e tubuli, come in altri sistemi. Al microscopio a fluorescenza, l'ER del lievito si manifesta come due anelli con alcune strutture interconnesse in mezzo. L'anello interno è l'ER nucleare, che è continuo con l'involucro nucleare, e l'anello esterno è l'ER periferico, che è una rete tubolare che giace sotto la membrana plasmatica⁵. Simile alle cellule vegetali ma diverso dalle cellule animali, un organello ibrido, il tardo Golgi/endosoma precoce, si trova all'intersezione tra la via secretoria e la via endocitica ^6,7. Morfologicamente, gli apparati di Golgi del lievito sono dispersi nel citoplasma. I vacuoli sono funzionalmente analoghi ai lisosomi nelle cellule animali. Spesso occupano grandi porzioni del citoplasma e subiscono frequenti fissione e fusione. Oltre all'uso di marcatori di colocalizzazione fluorescenti, la membrana vacuolare può essere distinta dall'ER nucleare in base ad almeno due criteri: la membrana vacuolare è generalmente più arrotondata dell'ER nucleare e l'aspetto concavante del vacuolo nella DIC è anche più pronunciato di quello del nucleo.

Di routine, utilizziamo una serie di marcatori a base di proteine fluorescenti per visualizzare i suddetti organelli in cellule di lievito vive (Tabella 1). La fedeltà e la funzionalità di questi marcatori di organelli sono state verificate sperimentalmente ^7,8. Questi costrutti di marcatori hanno lo scopo di introdurre cassette di chimera proteiche fluorescenti nel genoma del lievito. Come descritto di seguito, in preparazione alla trasformazione del lievito, i frammenti lineari di DNA vengono generati mediante digestione enzimatica o amplificazione PCR ^7,8. I frammenti lineari di DNA vengono integrati nel genoma attraverso la ricombinazione omologa. Per i plasmidi descritti in questo protocollo, vengono impiegati tre tipi di progettazione. Nel primo tipo, che copre la maggior parte dei plasmidi, è spesso possibile ottenere trasformanti che trasportano più copie del costrutto. Questo di solito è indesiderato perché introduce variazioni espressive e possibilmente funzionali tra i trasformanti. I trasformanti a copia singola devono essere identificati attraverso l'imaging come descritto in questo protocollo, mediante immunoblotting o test PCR accuratamente progettati. Nel secondo tipo, che copre GFP-Sed5, GFP-Pep12 e GFP-Atg8, viene prodotta solo l'integrazione a copia singola nelle cellule di lievito aploidi. Sia il primo che il secondo tipo mantengono intatta la copia endogena del gene marcatore nel genoma. Un terzo tipo di plasmide, che copre Sec7-2GFP e Vph1-2GFP, ha lo scopo di introdurre knock-in C-terminali, portando le chimere ad essere l'unica copia del gene marcatore corrispondente.

Qui descriviamo la procedura per utilizzare questi marcatori di organelli, forniamo immagini di microscopia esemplari e discutiamo le precauzioni rivolte ai ricercatori che non conoscono l'imaging degli organelli di lievito.

Protocollo

1. Costruzione del ceppo di lievito

1. Procurati plasmidi marcatori e un ceppo di lievito adatto.
   NOTA: I plasmidi sono disponibili presso Addgene. Questo protocollo utilizza TN124 (MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ::LEU2), BY4741(MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0) e DJ03 (BY4741 trp1Δ::MET15) come esempi. Una considerazione importante per la scelta del ceppo, oltre alla natura della questione scientifica, è la compatibilità dei marcatori di selezione. I plasmidi marcatori degli organelli qui descritti utilizzano URA3 e TRP1 come marcatori di selezione. Pertanto, il genotipo del ceppo ricevente deve essere ura3 e trp1. In caso contrario, è necessario modificare il ceppo o i plasmidi.
2. Preparare il lievito secondo le seguenti ricette.
   NOTA: SMD (destrosio minimo sintetico; 2% glucosio, 0,67% base azotata di lievito (YNB) senza aminoacidi, 30 mg/L adenina, 30 mg/L lisina, 30 mg/L metionina, 20 mg/L istidina, 20 mg/L uracile, 50 mg/L triptofano, 50 mg/L leucina). SMD+CA (SMD con l'aggiunta dello 0,5% di casamminoacidi). YPD (Estratto di lievito peptone destrosio; 1% estratto di lievito, 2% peptone, 2% glucosio). SD-N (destrosio sintetico senza azoto; 0,17% YNB senza aminoacidi e solfato di ammonio, 2% glucosio). Si prega di fare riferimento alla sezione Discussione per considerazioni sulla scelta del mezzo.
3. Prima della fase di trasformazione, generare frammenti di DNA linearizzati mediante digestione enzimatica o amplificazione PCR di un plasmide marcatore di organelli.
   NOTA: La Tabella 1 elenca i siti degli enzimi di restrizione e i primer PCR per generare frammenti lineari dai plasmidi marcatori degli organelli.
4. Coltura di cellule di lievito in terreno liquido YPD e trasformazione del lievito con frammento di DNA lineare.
   NOTA: La trasformazione del lievito può essere eseguita utilizzando il metodo convenzionale basato su LiAc⁹ o altri metodi a scelta. Si consiglia di includere controlli appropriati per la trasformazione, in particolare un controllo negativo senza plasmide o DNA derivato da plasmidi.
5. Incubare su una piastra di selezione appropriata (ad esempio, per la selezione URA3 , utilizzare terreno SMD-Ura) a 30 °C per 2-3 giorni.
   NOTA: Ci vogliono circa 2 giorni perché si presentino singole colonie.
6. Per verificare l'espressione della chimera fluorescente e il numero di copie di integrazione, prelevare otto colonie dalla piastra di selezione, ri-strisciare su nuove piastre di selezione e incubare a 30 °C.

2. Microscopia a fluorescenza: procedure generali e imaging a singolo punto temporale

1. Coltura di cellule di lievito per una notte in terreno liquido SMD a 30 °C con agitazione.
2. La mattina successiva, misurare la densità ottica della coltura di lievito a 600 nm (di seguito denominata OD₆₀₀) in uno spettrofotometro o in un lettore di piastre.
   NOTA: Con un po' di pratica sull'inoculazione del lievito, di solito si può garantire che OD₆₀₀ di tutti i campioni sia inferiore a 2 in questa fase. Se finisce più in alto, è consigliabile diluire di più nella fase successiva e lasciare più tempo alle cellule di lievito per riprendersi.
3. Diluire la coltura di lievito a circa 0,2 OD₆₀₀ utilizzando un terreno fresco.
4. Continua la coltura fino a quando OD₆₀₀ raggiunge circa 0,8-1,0.
   NOTA: Il tempo di raddoppio del lievito è di circa 1,5-2 h.
5. Mettere un bicchiere di copertura sopra la carta velina su una superficie piana, stendere 5 μL di 1 mg/mL di concanavalina A sul lato superiore del vetro di copertura e attendere 5 minuti (Figura 1A)¹⁰.
   NOTA: Questa fase di preparazione può essere eseguita in anticipo.
6. Trasferire 100 μL di lievito di coltura sul lato superiore del vetro di copertura e attendere 5 minuti.
7. Combinare il vetro di copertura con un vetrino di supporto, con le cellule di lievito inserite in mezzo; Premere con forza appropriata per fissare l'accessorio.
   NOTA: Ci vuole un po' di pratica per trovare la giusta pressione, in modo che le cellule di lievito formino un singolo strato immobile ma non vengano schiacciate (Figura 1B). Durante questa fase, il mezzo liquido verrà espulso e assorbito dalla carta velina sottostante.
8. Montare il vetrino sul tavolino del microscopio. Individua e metti a fuoco una zona di cellule di lievito utilizzando l'illuminazione a contrasto di interferenza differenziale (DIC) o a contrasto di fase (PC).
   NOTA: Non utilizzare la fluorescenza per localizzare le cellule; In caso contrario, il segnale potrebbe essere sbiancato prima della raccolta dei dati.
9. Configura manualmente tre set di parametri per raccogliere gli z-stack di immagini: z-sectioning, canali di imaging e parametri di esposizione.
   NOTA: Vedere la Figura 1 supplementare per esempi GUI di impostazioni dei parametri in un software commerciale. L'aspetto esatto differisce tra le piattaforme software, ma le opzioni sono più o meno le stesse.
   1. Sezione Z: Raccogliere le fette a passo di 0,5 μm per 15 fette (coprendo una profondità di 7 μm, generalmente sufficiente per le normali cellule di lievito aploidi).
   2. Canali di imaging: selezionare DIC o PC per i contorni cellulari e i canali di fluorescenza appropriati in base alle esigenze.
   3. Intensità della luce di eccitazione e tempo di esposizione: Impostare l'intensità della luce di eccitazione e il tempo di esposizione in base al campione.
      NOTA: Come punto di partenza, utilizzare 100% per l'intensità della luce di eccitazione e 100 ms per il tempo di esposizione; diminuire l'intensità della luce se il fotobleaching diventa evidente con la progressione della raccolta Z-stack o se il segnale supera la capacità di registrazione della telecamera (ad esempio, la saturazione del segnale); Aumentare l'intensità della luce se il rapporto segnale/rumore è basso.
10. Annotare le impostazioni di imaging e utilizzare le stesse impostazioni per tutti i campioni da confrontare.
    NOTA: Non utilizzare l'impostazione "auto" per la raccolta dei dati e la visualizzazione delle immagini. È importante registrare le impostazioni in una nota di laboratorio in modo che gli stessi parametri possano essere riapplicati nelle future ripetizioni sperimentali. Alcune applicazioni software di controllo del microscopio hanno la capacità di salvare e riapplicare le impostazioni; Tuttavia, è consigliabile registrare le impostazioni in modo indipendente perché i profili software potrebbero essere eliminati o modificati involontariamente dai colleghi.
11. Salvare i dati in formato stack multicanale a 16 bit.
    NOTA: Non salvare le immagini RGB a 8 bit (o a 24 bit, se si contano tutti e tre i colori). Vedere la sezione sulla visualizzazione delle immagini (Sezione 4) per le limitazioni del formato a 8 bit.
12. Passa a un'area completamente diversa per la raccolta di immagini successiva.
    NOTA: Le aree adiacenti potrebbero aver subito fotosbiancamento e fototossicità. Di conseguenza, la pila di immagini raccolta da queste aree potrebbe essere fuorviante.

3. Imaging time-lapse

NOTA: La procedura di imaging time-lapse differisce da quella per l'imaging di un singolo punto temporale in due aree: preparazione del campione e parametri di imaging.

1. Preparazione del campione
   1. Rivestire una capsula con fondo di vetro da 35 mm con 1 mg/mL di concanavalina A e attendere 5 minuti o più.
   2. Aggiungere 1,5 ml di lievito liquido di coltura al piatto e attendere 5 minuti per consentire alle cellule di lievito di depositarsi sulla superficie del vetro.
   3. Usando una pipetta, aspirare il terreno liquido dal bordo del piatto, quindi sciacquare delicatamente la macchia di sedimento di lievito con circa 1 ml di terreno fresco per rimuovere le cellule attaccate in modo non sicuro.
   4. Ripetere il risciacquo 2-3 volte. Aspirare con una pipetta, quindi aggiungere delicatamente 2 ml di terreno di coltura fresco.
2. Parametri di imaging
   1. Sezione Z: Raccogliere le fette a passo di 0,5 μm per 15 fette.
   2. Canali di imaging: selezionare in base alle esigenze.
   3. Eccitazione, intensità della luce e tempo di esposizione: utilizzare il minimo necessario per discernere la struttura subcellulare in esame.
      NOTA: Per l'imaging time-lapse, il fotosbiancamento e la fototossicità da illuminazione ripetuta limitano il numero totale di punti temporali che possono essere raccolti. Pertanto, l'intensità di eccitazione e il tempo di esposizione sono generalmente impostati su valori bassi in modo da poter visualizzare più punti temporali.
   4. Intervallo di imaging: Impostare gli intervalli di temporizzazione appropriati per il processo biologico oggetto di indagine.
      NOTA: Ad esempio, la formazione di un autofagosoma in condizioni di fame richiede circa 5-10 minuti; Un intervallo di 1 minuto o meno è preferibile per tracciare le sue dinamiche. In condizioni ricche di sostanze nutritive, il ciclo cellulare del lievito avviene su scala oraria; È possibile utilizzare un intervallo più lungo, ad esempio 10-20 minuti.
3. Se è disponibile l'hardware adeguato, mantenere la temperatura della parabola a 30 °C.
   NOTA: La maggior parte dei processi biologici nelle cellule di lievito può essere visualizzata anche a temperatura ambiente (RT), ma in generale a un ritmo più lento.

4. Visualizzazione delle pile di immagini e valutazione del numero di copie di integrazione

1. Installa il software Fiji o ImageJ per la visualizzazione e l'analisi delle immagini^11,12.
   NOTA: Fiji è una raccolta di strumenti basata su ImageJ, adatta per la visualizzazione e l'elaborazione di dati di immagini biologiche generiche. Per l'elaborazione delle immagini elencate in questo protocollo, è sufficiente ImageJ senza plug-in aggiuntivi.
2. Scegli i parametri appropriati per la visualizzazione e il confronto delle immagini.
   1. Nelle Figi, apri un paio di immagini z-stack.
   2. Trascina la posizione z in ogni pila fino alla sezione centrale (o in altre posizioni se la struttura in esame è meglio visualizzata lì).
   3. Vai su Immagine > Regola > Luminosità/Contrasto e fai clic su Ripristina.
   4. Nella finestra Luminosità/Contrasto (B&C), utilizzare le barre di scorrimento per modificare due parametri, i valori minimo e massimo , per distinguere chiaramente la struttura in esame.
      NOTA: In genere, il valore Minimo è impostato in modo da essere vicino al valore medio nelle aree vuote e il valore Massimo è impostato in modo da essere vicino al massimo nell'immagine. Tali valori possono essere dedotti dall'istogramma visualizzato (Figura 2A). Se la workstation di imaging è calibrata per il colore, il valore minimo può essere impostato leggermente più alto per nascondere più segnali di sfondo.
   5. Nella finestra Luminosità/Contrasto (B&C), fare clic su Imposta e selezionare la casella di controllo Propaga a tutte le altre immagini aperte nella finestra popup Imposta intervallo di visualizzazione.
      NOTA: Questa operazione applica le stesse impostazioni di luminosità/contrasto (inclusi i valori minimo e massimo) a tutte le immagini aperte in modo che le immagini possano essere confrontate in modo incrociato.
   6. Guarda le diverse immagini e scorri lo z-stack in ciascuna. Se le immagini hanno un bell'aspetto con uno sfondo scuro adeguato e una saturazione leggermente esagerata, annota le impostazioni Minima e Massima .
3. Per le immagini multicanale, selezionare le impostazioni di visualizzazione dell'immagine per ciascun canale:
   1. Vai allo strumento Immagine > Colore > Canali, seleziona la modalità Scala di grigi nella finestra popup Canali.
   2. Passa attraverso ogni canale, scegli la luminosità/ contrasto corretti per quel canale e annota le impostazioni.
   3. Con la regolazione di Luminosità/Contrasto , tornare alla finestra Canali e passare alla modalità Composito per la visualizzazione simultanea di più canali.
      NOTA: Lo pseudo colore per ciascun canale può essere modificato manualmente in Canali in base alle preferenze personali. Le caselle di controllo servono per mostrare/nascondere determinati canali.
4. Se necessario, utilizzare le caselle di controllo nella finestra Canali per mostrare o nascondere determinati canali.
5. Se lo si desidera, è possibile generare proiezioni di pile andando su Image > Stacks > Z Project.
   NOTA: Sono disponibili diverse modalità di proiezione. L'intensità massima è una buona scelta per una valutazione rapida. La natura della ricerca dovrebbe essere considerata per determinare se una particolare modalità di proiezione o singole fette debbano essere utilizzate per la quantificazione. La proiezione può anche essere limitata a selezionare sezioni Z per ridurre l'interferenza della luce sfocata.
6. Schermo per trasformanti di integrazione a copia singola.
   1. Una volta applicate le stesse impostazioni di Luminosità/Contrasto a tutte le immagini aperte, confrontare le intensità dell'immagine tra i campioni per dedurre il numero di integrazione plasmidica.
      NOTA: Le immagini devono essere acquisite seguendo la procedura generale per l'imaging di un singolo punto temporale, iniziando con la coltura notturna in un mezzo liquido. Le integrazioni multi-copia (vedere la colonia 2 e 3 nella Figura 2B per esempi) appaiono sostanzialmente più luminose di quelle a copia singola (colonia 1 nella Figura 2B). Al contrario, quelli a copia singola sembrano simili tra loro (Figura 2B).
   2. Esamina le immagini di otto trasformanti per ogni ceppo, assicurandoti di utilizzare le stesse impostazioni di luminosità/contrasto .
   3. Rieseguire la streak e salvare tre o più trasformanti a copia singola per lo studio successivo.
7. Esporta le immagini per la presentazione.
   1. Vai su Immagine > Duplica per fare una copia dell'immagine di interesse e assegnarle un nome a scelta.
   2. Vai su Immagine > digitare > 8 bit per convertire la copia duplicata da 16 bit a 8 bit e salvarla secondo necessità.
      NOTA: Tenere presente che una volta applicata questa impostazione, se le impostazioni di Luminosità/Contrasto non sono state annotate in precedenza, non esiste un modo semplice per recuperare tali informazioni, e quindi non c'è un modo semplice per riapplicare la stessa impostazione nelle visualizzazioni di immagini successive. Questo è anche il motivo per cui è consigliata l'operazione di duplicazione precedente.
   3. Per dividere una pila z in una raccolta di singole immagini, vai su Pile di immagini > > Pile in Immagini e salva se necessario.
      NOTA: Le immagini possono anche essere ritagliate in un'area più piccola nelle Fiji.

Risultati

La morfologia e la dinamica degli organelli sono soggette a cambiamenti poiché le cellule di lievito rispondono ai segnali esterni e interni. Qui, forniamo immagini rappresentative degli organelli di lievito nella fase di log medio (Figura 3A, B). Come accennato in precedenza, diversi organelli hanno le loro caratteristiche morfologiche distinte, quindi sono facili da riconoscere senza un ampio confronto con altri marcatori di organelli. Qu...

Discussione

Il protocollo qui descritto fornisce un semplice inizio per le persone che entrano da altri campi di ricerca per esplorare l'imaging degli organelli di lievito. Prima di passare ad argomenti specifici, vorremmo sottolineare ancora una volta che è necessario astenersi dall'uso eccessivo di funzionalità automatiche nei software di imaging. Le immagini al microscopio non sono solo belle immagini, sono dati scientifici, e quindi la loro acquisizione e interpretazione dovrebbero essere trat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sangon Biotech	A600013
Casaminoacid	Sangon Biotech	A603060
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack bean)	Sigma Aldrich	L7647
D-Glucose	Sangon Biotech	A501991
Fiji			https://fiji.sc/
Glass-bottom petri dish	NEST	706001	Φ35 mm
ImajeJ			https://imagej.net/
Inverted florescence microscope	Olympus		IX83 equipped with UPLXAPO 100X oil immersion objective, Lumencor Spectra X light source, and Hamamatsu Orca Flash4.0 LT camera.
L-Histidine	Sangon Biotech	A604351
L-Leucine	Sangon Biotech	A100811
L-Lysine	Sangon Biotech	A602759
L-Methionine	Sangon Biotech	A100801
L-Tryptophan	Sangon Biotech	A601911
Microscope cover glass	CITOTEST	10222222C	22 mm x 22 mm, 0.16–0.19 mm
Microscope slides	CITOTEST	1A5101	25 mm x 75 mm, 1–1.2 mm
Peptone	Sangon Biotech	A505247
Uracil	Sangon Biotech	A610564
Visiview	Visitron System GmbH		https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html
Yeast extract	Sangon Biotech	A100850
Yeast nitrogen base without amino acids	Sangon Biotech	A610507
YNB without amino acids and ammonium sulfate	Sangon Biotech	A600505