Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

요약

여기에서는 발아 효모인 Saccharomyces cerevisiae의 살아있는 세포 이미징에서 형광 단백질 기반 소기관 마커 세트를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

싹트는 효모인 Saccharomyces cerevisiae는 세포 기관의 기능과 역학을 연구하는 고전적인 모델 시스템입니다. 이전 연구에서는 핵, 소포체(ER), 골지체, 엔도솜, 액포, 미토콘드리아, 과산화소체, 지질 방울 및 자가포식소체를 포함한 주요 소기관 및 내막 구조에 대한 형광 단백질 기반 마커를 구축했습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 효모 형질전환을 위한 DNA 준비, 형질전환체의 선택 및 평가, 형광 현미경 관찰 및 예상 결과를 포함하여 효모에서 이러한 마커를 사용하는 절차를 설명합니다. 이 텍스트는 다른 배경에서 효모 세포 기관 연구 분야에 진입하는 연구자를 대상으로 합니다. 필수 단계뿐만 아니라 현미경 하드웨어 고려 사항 및 몇 가지 일반적인 위험에 대한 기술 노트도 다룹니다. 이는 사람들이 살아있는 세포 형광 현미경으로 효모 세포 내 독립체를 관찰할 수 있는 출발점을 제공합니다. 이러한 도구와 방법은 단백질 세포 내 국소화를 식별하고 타임 랩스 이미징에서 관심 소기관을 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

세포내(subcellular compartmentalization)를 막(membrane-bound)으로 묶인 소기관(organelle)으로 구획화하는 것은 진핵세포(eukaryotic cell)의 조직에서 일반적인 원리입니다. 각 소기관은 특정 기능을 수행합니다. 진핵생물 생물학의 다른 많은 측면과 마찬가지로, 싹을 틔우는 효모인 Saccharomyces cerevisiae는 세포 기관 조직과 역학의 기본 원리를 설명하는 데 있어 고전적인 모델 시스템이었습니다. 예를 들어 단백질 분비 경로, 과옥시솜 단백질 수입 경로 및 자가포식 경로 ^1,2,3에서 발견된 정액 등이 있습니다.

전형적인 영양이 풍부한 조건에서 빠르게 성장하는 효모 세포에는 소포체(ER), 초기 골기, 후기 골기/초기 엔도솜, 후기 엔도솜, 액포 및 미토콘드리아가 포함됩니다. 일부 과산화소체, 지질 방울 및 자가포식소체(처음 두 개보다 훨씬 적으며, 주로 영양이 풍부한 조건에서 존재하는 Cvt 소포 유형⁴)도 존재하지만 특정 배양 조건(지질이 풍부한 배지, 기아 배지 등)에서 두드러지지는 않습니다. 다른 일반적인 진핵 생물 모델과 비교할 때 효모 세포는 매우 작습니다. 일반적인 효모 세포의 직경은 약 5μm로, 대부분의 동식물 세포의 경우 수십 마이크로미터에 비해 높습니다. 결과적으로, 일반적으로 단일 부착 동물 세포를 포함하는 동일한 이미징 필드에서 일반적으로 다양한 세포 주기 단계에서 수십 개의 효모 세포를 볼 수 있습니다. 크기 차이 외에도 효모 세포 기관 형태에는 몇 가지 독특한 특징이 있습니다. 초구조 수준에서 효모 ER은 다른 시스템과 마찬가지로 시트와 세뇨관으로 구성됩니다. 형광 현미경 검사에서 효모 ER은 사이에 몇 가지 상호 연결 구조가 있는 두 개의 고리로 나타납니다. 내부 고리는 핵 외피와 연속적인 핵 ER이고 외부 고리는 원형질막⁵ 아래에 있는 관형 네트워크인 주변 ER입니다. 식물 세포와 유사하지만 동물 세포와는 다른 하이브리드 소기관인 후기 골기(late Golgi)/초기 엔도솜(early endosome)은 분비 경로(secretory pathway)와 내세포 경로(endocytic pathway) 사이의 교차점에 위치합니다 ^6,7. 형태학적으로, 효모 골지체는 세포질에 분산되어 있습니다. 액포는 동물 세포의 리소좀과 기능적으로 유사합니다. 그들은 종종 세포질의 많은 부분을 차지하고 빈번한 핵분열과 융합을 겪습니다. 형광 공동 국소화 마커의 사용 외에도, 액포막은 적어도 두 가지 기준에 의해 핵 ER과 구별될 수 있습니다: 액포막은 일반적으로 핵 ER보다 더 둥글고, DIC에서 액포의 오목한 모양도 핵보다 더 뚜렷합니다.

일상적으로, 우리는 살아있는 효모 세포에서 앞서 언급한 소기관을 시각화하기 위해 일련의 형광 단백질 기반 마커를 사용합니다(표 1). 이러한 소기관 마커의 충실도와 기능은 실험적으로 검증되었습니다 ^7,8. 이러한 마커 구조체는 형광 단백질 키메라 카세트를 효모 게놈에 도입하기 위한 것입니다. 아래에 요약된 바와 같이, 효모 형질전환을 준비하기 위해 선형 DNA 단편은 효소 분해 또는 PCR 증폭에 의해 생성됩니다 ^7,8. 선형 DNA 단편은 상동 재조합을 통해 게놈에 통합됩니다. 이 프로토콜에 설명된 플라스미드의 경우, 세 가지 유형의 설계가 사용됩니다. 플라스미드의 대부분을 커버하는 첫 번째 유형에서, 구조체의 여러 사본을 운반하는 형질전환체를 얻는 것이 종종 가능하다. 이것은 일반적으로 바람직하지 않은데, 그 이유는 형질전환체에 걸쳐 발현적이고 기능적 변이를 도입할 가능성이 있기 때문이다. 단일 복제 형질전환체는 이 프로토콜에 설명된 대로 이미징, 면역 블로팅 또는 신중하게 설계된 PCR 테스트를 통해 식별해야 합니다. GFP-Sed5, GFP-Pep12 및 GFP-Atg8을 포함하는 두 번째 유형에서는 반수체 효모 세포에서 단일 복제 통합만 생성됩니다. 첫 번째 유형과 두 번째 유형 모두 게놈에서 마커 유전자의 내인성 사본을 그대로 유지합니다. Sec7-2GFP 및 Vph1-2GFP를 포함하는 세 번째 유형의 플라스미드 설계는 C-말단 knock-in을 도입하여 키메라가 해당 마커 유전자의 유일한 사본이 되도록 하기 위한 것입니다.

여기에서는 이러한 소기관 마커를 활용하는 절차를 설명하고, 모범적인 현미경 이미지를 제공하며, 효모 소기관 이미징을 처음 접하는 연구자를 위한 예방 조치에 대해 논의합니다.

프로토콜

1. 효모 균주 구조

1. 마커 플라스미드와 적절한 효모 균주를 얻습니다.
   참고: 플라스미드는 Addgene에서 구입할 수 있습니다. 이 프로토콜은 TN124(MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ::LEU2), BY4741(MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0) 및 DJ03(BY4741 trp1Δ::MET15)을 예로 사용합니다. 과학적 질문의 성격 외에 균주 선택에 대한 한 가지 중요한 고려 사항은 선택 마커의 호환성입니다. 여기에 설명된 소기관 마커 플라스미드는 URA3 및 TRP1 을 선택 마커로 사용합니다. 따라서 수용 균주의 유전자형은 ura3 및 trp1이어야 합니다. 그렇지 않으면 균주 또는 플라스미드를 수정해야 합니다.
2. 다음 조리법에 따라 효모 매체를 준비하십시오.
   참고: SMD(합성 최소 덱스트로오스, 아미노산 없는 포도당 2%, 효모 질소 염기(YNB) 0.67%, 아데닌 30mg/L, 라이신 30mg/L, 메티오닌 30mg/L, 히스티딘 20mg/L, 우라실 20mg/L, 트립토판 50mg/L, 류신 50mg/L). SMD+CA(0.5% 카사미노산이 첨가된 SMD). YPD (효모 추출물 펩톤 덱 스트로스, 1 % 효모 추출물, 2 % 펩톤, 2 % 포도당). SD-N(질소가 없는 합성 포도당, 아미노산 및 황산암모늄이 없는 0.17% YNB, 포도당 2%). 매체 선택에 대한 고려 사항은 토론 섹션을 참조하십시오.
3. transformation 단계 전에 소기관 마커 플라스미드의 효소 분해 또는 PCR 증폭을 통해 선형화된 DNA 단편을 생성합니다.
   참고: 표 1 에는 소기관 마커 플라스미드에서 선형 단편을 생성하기 위한 제한 효소 부위 및 PCR 프라이머가 나열되어 있습니다.
4. 액체 YPD 배지에서 효모 세포를 배양하고 선형 DNA 단편으로 효모를 변형시킵니다.
   참고: 효모 형질전환은 종래의 LiAc-기반 방법⁹ 또는 다른 선택방법을 사용하여 수행할 수 있습니다. 형질전환에 대한 적절한 대조군, 특히 플라스미드 또는 플라스미드 유래 DNA가 없는 음성 대조군을 포함하는 것이 좋습니다.
5. 적절한 선택 플레이트(예: URA3 선택의 경우 SMD-Ura 배지 사용)에서 30°C에서 2-3일 동안 배양합니다.
   참고: 단일 군체가 나타나는 데 약 2일이 걸립니다.
6. 형광 키메라 발현과 통합 복제 수를 확인하려면 선택 플레이트에서 8개의 콜로니를 선택하고 새로운 선택 플레이트에서 줄무늬를 다시 만든 다음 30°C에서 배양합니다.

2. 형광 현미경 검사법: 일반적인 절차 및 단 하나 시점 화상 진찰

1. 진탕과 함께 30 °C의 SMD 액체 배지에서 밤새 효모 세포를 배양합니다.
2. 다음날 아침, 분광 광도계 또는 플레이트 리더에서 600nm(이하 OD₆₀₀이라고 함)에서 효모 배양의 광학 밀도를 측정합니다.
   참고: 효모 접종에 대한 약간의 연습을 통해 일반적으로 이 단계에서 모든 샘플의 OD₆₀₀ 이 2보다 낮은지 확인할 수 있습니다. 더 높게 끝나면 다음 단계에서 더 많이 희석하고 효모 세포가 회복할 시간을 더 많이 허용하는 것이 좋습니다.
3. 새로운 배지를 사용하여 효모 배양액을 약 0.2 OD₆₀₀ 으로 희석합니다.
4. OD₆₀₀ 이 약 0.8-1.0에 도달할 때까지 배양을 계속합니다.
   참고: 효모의 배가 시간은 약 1.5-2시간입니다.
5. 평평한 표면의 티슈 페이퍼 위에 커버 유리를 놓고 커버 유리 상단에 5μL의 1mg/mL 콘카나발린 A를 펴 바르고 5분 동안 기다립니다(그림 1A)¹⁰.
   참고: 이 준비 단계는 미리 수행할 수 있습니다.
6. 100μL의 효모 배양액을 커버 유리의 윗면으로 옮기고 5분 동안 기다립니다.
7. 커버 유리를 지지 유리 슬라이드와 결합하고 그 사이에 효모 세포를 끼웁니다. 적절한 힘으로 눌러 부착물을 고정합니다.
   참고: 효모 세포가 움직이지 않는 단일 층을 형성하지만 부서지지 않도록 적절한 압력을 찾으려면 약간의 연습이 필요합니다(그림 1B). 액체 매체는 이 단계에서 밀려나고 밑에 있는 티슈 페이퍼에 흡수됩니다.
8. 현미경 스테이지에 샘플 슬라이드를 장착합니다. 미분 간섭 대비(DIC) 또는 위상차(PC) 조명을 사용하여 효모 세포 패치를 찾고 초점을 맞춥니다.
   참고: 세포를 찾기 위해 형광을 사용하지 마십시오. 그렇지 않으면 데이터 수집 전에 신호가 표백될 수 있습니다.
9. 이미지 z-스택을 수집하기 위해 세 가지 매개변수 세트(z-sectioning, 이미징 채널 및 노출 매개변수)를 수동으로 구성합니다.
   알림: GUI에 대한 추가 그림 1 을 참조하십시오.amp하나의 상용 소프트웨어에서 매개변수 설정의 파일. 정확한 모양은 소프트웨어 플랫폼에 따라 다르지만 옵션은 거의 동일합니다.
   1. Z-절편: 15개 조각에 대해 0.5μm 스테핑으로 절편을 수집합니다(7μm 깊이 포함, 일반적으로 일반 반수체 효모 세포에 충분함).
   2. 이미징 채널: 세포 윤곽을 위한 DIC 또는 PC를 선택하고 필요에 따라 적절한 형광 채널을 선택합니다.
   3. 여기광 강도 및 노출 시간: 여기광 강도 및 노출 시간을 샘플에 맞게 설정합니다.
      참고: 시작점으로 여기광 강도에는 100%를 사용하고 노출 시간에는 100ms를 사용합니다. Z-stack 수집이 진행됨에 따라 광표백이 분명해지거나 신호가 카메라 녹화 용량(즉, 신호 채도)을 초과하는 경우(즉, 신호 채도) 광도를 줄입니다. 신호 대 잡음비가 낮으면 광도를 높입니다.
10. 이미징 설정을 기록하고 비교할 모든 샘플에 대해 동일한 설정을 사용합니다.
    참고: 데이터 수집 및 이미지 시각화에 "자동" 설정을 사용하지 마십시오. 향후 실험 반복에서 정확히 동일한 파라미터를 다시 적용할 수 있도록 실험실 노트에 설정을 기록하는 것이 중요합니다. 일부 현미경 제어 소프트웨어 응용 프로그램에는 설정을 저장하고 다시 적용할 수 있는 기능이 있습니다. 그럼에도 불구하고 소프트웨어 프로필이 동료에 의해 의도치 않게 삭제되거나 수정될 수 있으므로 설정을 독립적으로 기록하는 것이 좋습니다.
11. 데이터를 16비트 다채널 스택 형식으로 저장합니다.
    참고: 8비트 RGB 사진(또는 세 가지 색상을 모두 계산하는 경우 24비트)으로 저장하지 마십시오. 8비트 형식의 제한 사항에 대해서는 이미지 시각화 섹션(섹션 4)을 참조하십시오.
12. 다음 이미지 스택 컬렉션을 위해 완전히 다른 영역으로 이동합니다.
    참고: 인접 지역은 광백화 및 광독성을 경험했을 수 있습니다. 따라서 이러한 영역에서 수집된 이미지 스택은 오해의 소지가 있을 수 있습니다.

3. 타임랩스 이미징

참고: 타임 랩스 이미징 절차는 샘플 준비 및 이미징 매개변수의 두 영역에서 단일 시점 이미징 절차와 다릅니다.

1. 시료 전처리
   1. 35mm 유리 바닥 접시에 1mg/mL 콘카나발린 A를 코팅하고 5분 이상 기다립니다.
   2. 접시에 효모 액체 배양액 1.5mL를 추가하고 효모 세포가 유리 표면에 가라앉을 때까지 5분 동안 기다립니다.
   3. 피펫을 사용하여 접시 가장자리에서 액체 배지를 흡입한 다음 약 1mL의 새 배지로 효모 침전물 패치를 부드럽게 헹구어 불안정하게 부착된 세포를 제거합니다.
   4. 헹굼을 2-3회 반복합니다. 피펫으로 흡입한 다음 신선한 배양 배지 2mL를 부드럽게 추가합니다.
2. 이미징 매개변수
   1. Z-절편: 15개 슬라이스에 대해 0.5μm 스테핑으로 슬라이스를 수집합니다.
   2. 이미징 채널: 필요에 따라 선택합니다.
   3. 여기광 강도 및 노출 시간: 조사 중인 세포 내 구조를 식별하는 데 필요한 최소한을 사용합니다.
      참고: 타임랩스 이미징의 경우 반복 조명으로 인한 광표백 및 광독성으로 인해 수집할 수 있는 총 시점 수가 제한됩니다. 따라서 여기 강도 및 노출 시간은 일반적으로 더 많은 시점을 이미징할 수 있도록 낮은 값으로 설정됩니다.
   4. 이미징 간격: 조사 중인 생물학적 프로세스에 적합한 타이밍 간격을 설정합니다.
      참고: 예를 들어, 기아 상태에서 자가포식솜을 형성하는 데는 약 5-10분이 걸립니다. 역학을 추적하기 위해 1분 이하의 간격을 사용하는 것이 좋습니다. 영양이 풍부한 조건에서 효모 세포 주기는 시간 척도에서 발생합니다. 10-20분과 같은 더 긴 간격을 사용할 수 있습니다.
3. 적절한 하드웨어를 사용할 수 있는 경우 접시 온도를 30°C로 유지하십시오.
   참고: 효모 세포에서 대부분의 생물학적 과정은 일반적으로 느린 속도를 제외하고는 실온(RT)에서도 이미징할 수 있습니다.

4. 이미지 스택의 시각화 및 통합 사본 수 평가

1. 이미지 시각화 및 분석을 위해 Fiji 또는 ImageJ 소프트웨어를 설치하십시오 ^11,12.
   참고: Fiji는 범용 생체 이미지 데이터 시각화 및 처리에 적합한 ImageJ 기반의 도구 모음입니다. 이 프로토콜에 나열된 이미지 처리의 경우 추가 플러그인이 없는 ImageJ로 충분합니다.
2. 이미지 표시 및 비교를 위해 적절한 매개변수를 선택합니다.
   1. 피지에서 몇 개의 z-stack 이미지를 엽니다.
   2. 각 스택의 z 위치를 중간 섹션(또는 조사 중인 구조가 더 잘 시각화되는 경우 다른 위치)으로 드래그합니다.
   3. 이미지 > Adjust > Brightness/Contrast(밝기/대비)로 이동하여 Reset(재설정)을 클릭합니다.
   4. 밝기/대비(B&C) 창에서 스크롤 막대를 사용하여 최소값과 최대값이라는 두 매개 변수를 변경하여 조사 중인 구조를 명확하게 식별할 수 있습니다.
      참고: 일반적으로 최소값 은 빈 영역에서 평균값에 가깝게 설정되고 최대값 은 이미지의 최대값에 가깝게 설정됩니다. 이러한 값은 표시된 히스토그램에서 추론할 수 있습니다(그림 2A). 이미징 워크스테이션이 색상이 보정된 경우 더 많은 배경 신호를 숨기기 위해 최소값을 약간 더 높게 설정할 수 있습니다.
   5. Brightness/Contrast (B&C) 창에서 Set을 클릭하고 팝업 창 Set Display Range에서 Propagate to other open images 확인란을 선택합니다.
      참고: 이 작업은 열려 있는 모든 이미지에 동일한 밝기/대비 설정(최소값 및 최대값 포함)을 적용하여 이미지를 상호 비교할 수 있도록 합니다.
   6. 서로 다른 이미지를 살펴보고 각 이미지의 z 스택을 스크롤합니다. 적절한 어두운 배경과 약간 과장된 채도로 이미지가 잘 보이면 최소 및 최대 설정을 기록해 둡니다.
3. 다중 채널 이미지의 경우 각 채널에 대한 이미지 표시 설정을 선택합니다.
   1. Image > Color > Channels Tool로 이동하여 채널 팝업 창에서 그레이스케일 모드를 선택합니다.
   2. 각 채널을 살펴보고 해당 채널에 적합한 밝기/대비 를 선택하고 설정을 기록합니다.
   3. 밝기/대비를 조정한 후 채널 창으로 돌아가서 여러 채널을 동시에 시각화할 수 있도록 컴포지트 모드로 변경합니다.
      참고: 각 채널의 의사 색상은 개인 취향에 맞게 채널에서 수동으로 변경할 수 있습니다. 확인란은 특정 채널을 표시하거나 숨기기 위한 것입니다.
4. 필요한 경우 채널 창의 확인란을 사용하여 특정 채널을 표시하거나 숨길 수 있습니다.
5. 원하는 경우 Image > Stacks > Z Project로 이동하여 스택 투영을 생성합니다.
   참고: 여러 프로젝션 모드를 사용할 수 있습니다. 최대 강도는 빠른 평가를 위한 좋은 선택입니다. 정량화를 위해 특정 투영 모드 또는 개별 슬라이스를 사용해야 하는지 여부를 결정하기 위해 연구의 성격을 고려해야 합니다. 초점이 맞지 않는 빛의 간섭을 줄이기 위해 z 슬라이스를 선택하도록 프로젝션을 제한할 수도 있습니다.
6. 단일 사본 통합 변환자에 대한 화면.
   1. 열려 있는 모든 이미지에 동일한 Brightness/Contrast 설정이 적용되면 샘플 전체의 이미지 강도를 비교하여 플라스미드 적분 수를 추론합니다.
      참고: 이미지는 액체 매체에서 하룻밤 동안 배양하는 것으로 시작하여 단일 시점 이미징에 대한 일반적인 절차를 따라 획득해야 합니다. 다중 복사 통합(예: 그림 2B 의 콜로니 2 및 3 참조)은 단일 복사본( 그림 2B의 콜로니 1)보다 훨씬 더 밝게 보입니다. 대조적으로, 단일 사본은 서로 비슷하게 보입니다(그림 2B).
   2. 각 변형주에 대해 8개의 변환체에서 이미지를 검사하여 동일한 밝기/대비 설정을 사용하는지 확인합니다.
   3. 후속 연구를 위해 3개 이상의 단일 복제 형질전환체를 다시 줄무늬로 만들고 저장합니다.
7. 프레젠테이션용 이미지를 내보냅니다.
   1. 이미지 > 복제로 이동하여 관심 있는 이미지의 복사본을 만들고 원하는 이름을 지정합니다.
   2. 이미지 > 8비트 유형으로 이동하여 중복 복사본을 16비트에서 8비트> 변환하고 필요에 따라 저장합니다.
      참고: 이 설정이 적용되면 밝기/대비 설정이 이전에 기록되지 않은 경우 해당 정보를 쉽게 검색할 수 있는 방법이 없으므로 후속 이미지 시각화에서 동일한 설정을 다시 적용하는 쉬운 방법이 없습니다. 이는 이전 복제 작업이 권장되는 이유이기도 합니다.
   3. z 스택을 개별 이미지 모음으로 분할하려면 이미지 > 스택 > 스택을 이미지로 이동하여 필요에 따라 저장하십시오.
      참고: 피지에서는 이미지를 더 작은 영역으로 자를 수도 있습니다.

결과

소기관 형태 및 역학은 효모 세포가 외부 및 내부 신호에 반응함에 따라 변경될 수 있습니다. 여기에서는 mid-log 단계에서 효모 소기관의 대표적인 이미지를 제공합니다(그림 3A,B). 앞서 언급했듯이 여러 소기관은 뚜렷한 형태학적 특징을 가지고 있으므로 다른 소기관 마커와 광범위하게 비교하지 않고도 쉽게 인식할 수 있습니다. 여기?...

토론

여기에 설명된 프로토콜은 다른 연구 분야에서 진입하는 사람들이 효모 소기관 이미징을 탐구할 수 있는 간단한 시작을 제공합니다. 특정 주제로 넘어가기 전에 이미징 소프트웨어에서 자동 기능을 과도하게 사용하지 말아야 한다는 점을 다시 한 번 강조하고 싶습니다. 현미경 이미지는 단순히 예쁜 그림이 아니라 과학적 데이터이므로 그에 따라 획득 및 해석을 다루어?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sangon Biotech	A600013
Casaminoacid	Sangon Biotech	A603060
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack bean)	Sigma Aldrich	L7647
D-Glucose	Sangon Biotech	A501991
Fiji			https://fiji.sc/
Glass-bottom petri dish	NEST	706001	Φ35 mm
ImajeJ			https://imagej.net/
Inverted florescence microscope	Olympus		IX83 equipped with UPLXAPO 100X oil immersion objective, Lumencor Spectra X light source, and Hamamatsu Orca Flash4.0 LT camera.
L-Histidine	Sangon Biotech	A604351
L-Leucine	Sangon Biotech	A100811
L-Lysine	Sangon Biotech	A602759
L-Methionine	Sangon Biotech	A100801
L-Tryptophan	Sangon Biotech	A601911
Microscope cover glass	CITOTEST	10222222C	22 mm x 22 mm, 0.16–0.19 mm
Microscope slides	CITOTEST	1A5101	25 mm x 75 mm, 1–1.2 mm
Peptone	Sangon Biotech	A505247
Uracil	Sangon Biotech	A610564
Visiview	Visitron System GmbH		https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html
Yeast extract	Sangon Biotech	A100850
Yeast nitrogen base without amino acids	Sangon Biotech	A610507
YNB without amino acids and ammonium sulfate	Sangon Biotech	A600505