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Method Article
여기에서는 발아 효모인 Saccharomyces cerevisiae의 살아있는 세포 이미징에서 형광 단백질 기반 소기관 마커 세트를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.
싹트는 효모인 Saccharomyces cerevisiae는 세포 기관의 기능과 역학을 연구하는 고전적인 모델 시스템입니다. 이전 연구에서는 핵, 소포체(ER), 골지체, 엔도솜, 액포, 미토콘드리아, 과산화소체, 지질 방울 및 자가포식소체를 포함한 주요 소기관 및 내막 구조에 대한 형광 단백질 기반 마커를 구축했습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 효모 형질전환을 위한 DNA 준비, 형질전환체의 선택 및 평가, 형광 현미경 관찰 및 예상 결과를 포함하여 효모에서 이러한 마커를 사용하는 절차를 설명합니다. 이 텍스트는 다른 배경에서 효모 세포 기관 연구 분야에 진입하는 연구자를 대상으로 합니다. 필수 단계뿐만 아니라 현미경 하드웨어 고려 사항 및 몇 가지 일반적인 위험에 대한 기술 노트도 다룹니다. 이는 사람들이 살아있는 세포 형광 현미경으로 효모 세포 내 독립체를 관찰할 수 있는 출발점을 제공합니다. 이러한 도구와 방법은 단백질 세포 내 국소화를 식별하고 타임 랩스 이미징에서 관심 소기관을 추적하는 데 사용할 수 있습니다.
세포내(subcellular compartmentalization)를 막(membrane-bound)으로 묶인 소기관(organelle)으로 구획화하는 것은 진핵세포(eukaryotic cell)의 조직에서 일반적인 원리입니다. 각 소기관은 특정 기능을 수행합니다. 진핵생물 생물학의 다른 많은 측면과 마찬가지로, 싹을 틔우는 효모인 Saccharomyces cerevisiae는 세포 기관 조직과 역학의 기본 원리를 설명하는 데 있어 고전적인 모델 시스템이었습니다. 예를 들어 단백질 분비 경로, 과옥시솜 단백질 수입 경로 및 자가포식 경로 1,2,3에서 발견된 정액 등이 있습니다.
전형적인 영양이 풍부한 조건에서 빠르게 성장하는 효모 세포에는 소포체(ER), 초기 골기, 후기 골기/초기 엔도솜, 후기 엔도솜, 액포 및 미토콘드리아가 포함됩니다. 일부 과산화소체, 지질 방울 및 자가포식소체(처음 두 개보다 훨씬 적으며, 주로 영양이 풍부한 조건에서 존재하는 Cvt 소포 유형4)도 존재하지만 특정 배양 조건(지질이 풍부한 배지, 기아 배지 등)에서 두드러지지는 않습니다. 다른 일반적인 진핵 생물 모델과 비교할 때 효모 세포는 매우 작습니다. 일반적인 효모 세포의 직경은 약 5μm로, 대부분의 동식물 세포의 경우 수십 마이크로미터에 비해 높습니다. 결과적으로, 일반적으로 단일 부착 동물 세포를 포함하는 동일한 이미징 필드에서 일반적으로 다양한 세포 주기 단계에서 수십 개의 효모 세포를 볼 수 있습니다. 크기 차이 외에도 효모 세포 기관 형태에는 몇 가지 독특한 특징이 있습니다. 초구조 수준에서 효모 ER은 다른 시스템과 마찬가지로 시트와 세뇨관으로 구성됩니다. 형광 현미경 검사에서 효모 ER은 사이에 몇 가지 상호 연결 구조가 있는 두 개의 고리로 나타납니다. 내부 고리는 핵 외피와 연속적인 핵 ER이고 외부 고리는 원형질막5 아래에 있는 관형 네트워크인 주변 ER입니다. 식물 세포와 유사하지만 동물 세포와는 다른 하이브리드 소기관인 후기 골기(late Golgi)/초기 엔도솜(early endosome)은 분비 경로(secretory pathway)와 내세포 경로(endocytic pathway) 사이의 교차점에 위치합니다 6,7. 형태학적으로, 효모 골지체는 세포질에 분산되어 있습니다. 액포는 동물 세포의 리소좀과 기능적으로 유사합니다. 그들은 종종 세포질의 많은 부분을 차지하고 빈번한 핵분열과 융합을 겪습니다. 형광 공동 국소화 마커의 사용 외에도, 액포막은 적어도 두 가지 기준에 의해 핵 ER과 구별될 수 있습니다: 액포막은 일반적으로 핵 ER보다 더 둥글고, DIC에서 액포의 오목한 모양도 핵보다 더 뚜렷합니다.
일상적으로, 우리는 살아있는 효모 세포에서 앞서 언급한 소기관을 시각화하기 위해 일련의 형광 단백질 기반 마커를 사용합니다(표 1). 이러한 소기관 마커의 충실도와 기능은 실험적으로 검증되었습니다 7,8. 이러한 마커 구조체는 형광 단백질 키메라 카세트를 효모 게놈에 도입하기 위한 것입니다. 아래에 요약된 바와 같이, 효모 형질전환을 준비하기 위해 선형 DNA 단편은 효소 분해 또는 PCR 증폭에 의해 생성됩니다 7,8. 선형 DNA 단편은 상동 재조합을 통해 게놈에 통합됩니다. 이 프로토콜에 설명된 플라스미드의 경우, 세 가지 유형의 설계가 사용됩니다. 플라스미드의 대부분을 커버하는 첫 번째 유형에서, 구조체의 여러 사본을 운반하는 형질전환체를 얻는 것이 종종 가능하다. 이것은 일반적으로 바람직하지 않은데, 그 이유는 형질전환체에 걸쳐 발현적이고 기능적 변이를 도입할 가능성이 있기 때문이다. 단일 복제 형질전환체는 이 프로토콜에 설명된 대로 이미징, 면역 블로팅 또는 신중하게 설계된 PCR 테스트를 통해 식별해야 합니다. GFP-Sed5, GFP-Pep12 및 GFP-Atg8을 포함하는 두 번째 유형에서는 반수체 효모 세포에서 단일 복제 통합만 생성됩니다. 첫 번째 유형과 두 번째 유형 모두 게놈에서 마커 유전자의 내인성 사본을 그대로 유지합니다. Sec7-2GFP 및 Vph1-2GFP를 포함하는 세 번째 유형의 플라스미드 설계는 C-말단 knock-in을 도입하여 키메라가 해당 마커 유전자의 유일한 사본이 되도록 하기 위한 것입니다.
여기에서는 이러한 소기관 마커를 활용하는 절차를 설명하고, 모범적인 현미경 이미지를 제공하며, 효모 소기관 이미징을 처음 접하는 연구자를 위한 예방 조치에 대해 논의합니다.
1. 효모 균주 구조
2. 형광 현미경 검사법: 일반적인 절차 및 단 하나 시점 화상 진찰
3. 타임랩스 이미징
참고: 타임 랩스 이미징 절차는 샘플 준비 및 이미징 매개변수의 두 영역에서 단일 시점 이미징 절차와 다릅니다.
4. 이미지 스택의 시각화 및 통합 사본 수 평가
소기관 형태 및 역학은 효모 세포가 외부 및 내부 신호에 반응함에 따라 변경될 수 있습니다. 여기에서는 mid-log 단계에서 효모 소기관의 대표적인 이미지를 제공합니다(그림 3A,B). 앞서 언급했듯이 여러 소기관은 뚜렷한 형태학적 특징을 가지고 있으므로 다른 소기관 마커와 광범위하게 비교하지 않고도 쉽게 인식할 수 있습니다. 여기?...
여기에 설명된 프로토콜은 다른 연구 분야에서 진입하는 사람들이 효모 소기관 이미징을 탐구할 수 있는 간단한 시작을 제공합니다. 특정 주제로 넘어가기 전에 이미징 소프트웨어에서 자동 기능을 과도하게 사용하지 말아야 한다는 점을 다시 한 번 강조하고 싶습니다. 현미경 이미지는 단순히 예쁜 그림이 아니라 과학적 데이터이므로 그에 따라 획득 및 해석을 다루어?...
저자들은 원고 준비에 아낌없는 도움을 준 Xie 연구실 구성원들에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 연구는 중국국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 보조금 91957104), 상하이시 교육위원회(Shanghai Municipal Education Commission, 보조금 2017-01-07-00-02-E00035), 상하이시 과학기술위원회(Shanghai Municipal Science and Technology Commission, 보조금 22ZR1433800)의 지원을 받았다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adenine | Sangon Biotech | A600013 | |
Casaminoacid | Sangon Biotech | A603060 | |
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma Aldrich | L7647 | |
D-Glucose | Sangon Biotech | A501991 | |
Fiji | https://fiji.sc/ | ||
Glass-bottom petri dish | NEST | 706001 | Φ35 mm |
ImajeJ | https://imagej.net/ | ||
Inverted florescence microscope | Olympus | IX83 equipped with UPLXAPO 100X oil immersion objective, Lumencor Spectra X light source, and Hamamatsu Orca Flash4.0 LT camera. | |
L-Histidine | Sangon Biotech | A604351 | |
L-Leucine | Sangon Biotech | A100811 | |
L-Lysine | Sangon Biotech | A602759 | |
L-Methionine | Sangon Biotech | A100801 | |
L-Tryptophan | Sangon Biotech | A601911 | |
Microscope cover glass | CITOTEST | 10222222C | 22 mm x 22 mm, 0.16–0.19 mm |
Microscope slides | CITOTEST | 1A5101 | 25 mm x 75 mm, 1–1.2 mm |
Peptone | Sangon Biotech | A505247 | |
Uracil | Sangon Biotech | A610564 | |
Visiview | Visitron System GmbH | https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html | |
Yeast extract | Sangon Biotech | A100850 | |
Yeast nitrogen base without amino acids | Sangon Biotech | A610507 | |
YNB without amino acids and ammonium sulfate | Sangon Biotech | A600505 |
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