葡萄糖酸氯己定诱导腹膜损伤的小鼠模型

摘要

本协议建立了葡萄糖酸氯己定（CG）诱导的腹膜纤维化的腹膜透析（PD）小鼠模型。与其他PD动物模型相比，目前的模型简单易用。

摘要

腹膜纤维化是腹膜透析（PD）的重要并发症。为了调查和解决这个问题，需要适当的PD动物模型。本协议建立了葡萄糖酸氯己定（CG）诱导的腹膜纤维化模型，该模型模拟PD患者的状况。 腹膜内注射0.1%的CG在15%乙醇中3周（每隔一天给药），在雄性C57BL / 6小鼠中总共9次诱导腹膜纤维化。然后在第22天进行腹膜功能测试。处死小鼠后，收获腹壁壁腹膜和肝脏内脏腹膜。在Masson的三色染色后进行显微镜分析时，它们更厚，纤维化更多。超滤速率降低，葡萄糖质量转运表明CG诱导的腹膜通透性增加。这样建立的PD模型在改善PD技术、透析疗效和延长患者生存期方面具有应用价值。

引言

腹膜透析（PD）是一种肾脏替代疗法。但是，PD存在无法解决的问题。例如，长期PD治疗可引起腹膜损伤，最终导致超滤失败^{和治疗停止}1，²，³，⁴，^5，6。腹膜纤维化是最严重的并发症之一^7，8。腹膜纤维化的特征是间质内细胞外基质的沉积和积累，以及腹膜^9，10的新血管生成和血管病变。

这些腹膜变化的主要原因是复发性腹膜炎和透析液的非生物相容性，它们是高渗、高葡萄糖、低pH和葡萄糖降解产物积累^11，12。因此，合适的动物实验模型可以帮助研究人员更好地研究PD治疗过程中腹膜的生理和病理变化。因此，建立动物PD模型对于提高PD技术和透析疗效，延长患者生存期具有重要意义。本研究旨在通过腹膜内（ip）注射葡萄糖酸氯己定（CG）来生成PD小鼠模型，如前^{所述13，14}。与其他PD动物模型相比，该PD小鼠模型简单，易于使用且可行。

研究方案

所有小鼠实验均由E-DA医院/义寿大学实验动物中心批准，并根据"实验动物护理和使用指南"（NRC，美国2011）进行处理。雄性C57BL / 6小鼠，7-8周龄，用于本研究。

1. 化学制剂

1. 通过在15%乙醇中稀释0.1%葡萄糖酸氯己定（CG，见 材料表）来制备化学刺激物。

2. 动物治疗

1. 指定三只小鼠作为对照组。每隔一天进行 1 mL/kg 0.9% 生理盐水 （NS） 的腹膜内注射 （ip），持续 3 周，共 9 次。
2. 将三只小鼠分配到腹膜纤维化组。使用葡萄糖酸氯己定（CG）以12.5μL / g体重的剂量腹膜注射0.1%的CG在15%乙醇中（步骤1.1）诱导腹膜纤维化。每隔一天执行一次，持续 3 周，总共 9 次。

3. 腹膜功能检查（改良腹膜平衡试验）

1. 制备含有4.25%葡萄糖的透析溶液。用注射器抽取0.5mL透析液样品，然后检查透析液样品中的葡萄糖浓度。
   注意:葡萄糖浓度根据己糖激酶/ G6PD方法测定。透析液样品进行L型Glu 2测定，并用生化分析仪进行研究（见 材料表）。这是初始透析液葡萄糖浓度。
2. 通过肌肉注射唑莱地尔和赛拉嗪（以1:2体积的比例制备，参见 材料表）以20μL / 20gw的剂量麻醉小鼠。此外，在眼睛上使用兽医软膏以防止麻醉下干燥。
3. 进行腹膜滴注透析溶液（2mL / 20g体重）。
4. 30分钟后，评估并验证缺乏脚趾夹反射的麻醉深度。然后，在腹部中线（剑突下方）进行垂直切口，然后打开小鼠的腹部并用注射器收集腹膜内液（定义为"体积1"）。然后，测量干净干燥的棉花的重量，并将棉花放入小鼠的腹腔中以吸收残留的腹腔内液。最后，再次测量棉花重量。
   注意:棉花的体重增加等于残留腹腔内液的重量。然后，转换为获得的体积（比重:1 g/cm³;定义为"体积2"）。最终透析液体积为第 1 卷加第 2 卷。
5. 使用 0.5 mL 透析液样品（最终透析液）测量葡萄糖浓度。这是最终的透析液葡萄糖浓度。
6. 使用公式¹⁵ 计算净超滤:
   
7. 使用以下公式¹⁵计算腹膜通透性:
   

4.腹壁肌肉和肝脏的组织准备及组织学分析

1. 通过心脏穿刺（静脉切开术） 处 死小鼠^3，16。
2. 切开腹壁（1 cm x 1 cm）和全肝切除术。将小鼠的腹壁和肝组织在10%中性缓冲福尔马林中固定过夜。
3. 准备腹壁肌肉和肝脏的3μm厚的石蜡切片，并根据先前发表的报告¹⁷进行组织学分析。
4. 使用形态测量法评估小鼠腹壁的顶腹膜和肝脏表面的内脏腹膜¹⁸。
5. 使用统计和绘图软件进行统计分析（见 材料表）。将所有数据表示为平均值± SD，并使用^{t 检验 19} 分析统计显著性。将 P < 0.05 的值定义为显著结果。

结果

在图1A，B中，在Masson三色染色¹⁷下，腹壁壁壁腹膜明显增厚且纤维化更多，表明在CG暴露组中，腹膜纤维化比对照盐水组（NS）更严重。在图2A，B中，肝脏表面的内脏腹膜也明显增厚且纤维化，从而证明在CG暴露组中，腹膜纤维化比对照盐水组（NS）更严重。在图3A中，CG组的超滤速率降低?...

讨论

本研究通过腹腔注射CG提出了小鼠PD模型，结果显示该模型存在腹膜纤维化和功能恶化，模拟PD患者的病情。

协议中有几个关键步骤。首先，为了进行CG或NS的腹腔注射，必须使用镊子拾取小鼠的腹壁皮肤，以防止穿刺引起的腹膜内器官损伤。其次，在收集腹壁腹膜进行组织学分析时，必须避免腹腔注射损伤的区域。

在腹膜纤维化的几种实验动物模型中，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline	Y F CHEMICAL CORP., New Taipei City, Taiwan	-
10% neutral buffered formalin	Taiwan Burnett International Co., Ltd., Taipei City, Taiwan	00002A
Automatic biochemical analyzer	Hitachi Ltd., Tokyo, Japan	Labospect Series 008	for determining glucose concentration
Chlorhexidine digluconate solution, 20% in H2O	Sigma-Aldrich, MO, USA	C9394	diluted to 0.1% with 15% ethanol for injection
Ethanol	Avantor Performance Materials, LLC, PA, USA	BAKR8006-05	diluted to 15% with normal saline for working concentration
Glucose (Dianeal)	Baxter International, Inc., IL, USA	FNB9896	Commercial dialysis solution (4.25%)
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software, Inc., CA, US
L-type Glu 2 assay	FUJIFILM Wako, Japan	461-32403
Xylazine 20	Juily Pharmaceutical Co., Ltd., New Taipei City, Taiwan	-
Zoletil 50	Virbac Laboratories, Carros, France	-