מודל עכברים של נזק פריטוניאלי הנגרם על ידי כלורהקסידין גלוקונאט

Summary

הפרוטוקול הנוכחי קובע מודל עכבר לדיאליזה פריטוניאלית (PD) של פיברוזיס פריטוניאלי המושרה על ידי כלורהקסידין גלוקונאט (CG). המודל הנוכחי פשוט וקל לשימוש בהשוואה למודלים אחרים של חיות פרקינסון.

Abstract

פיברוזיס פריטוניאלי הוא סיבוך חשוב של דיאליזה פריטוניאלית (PD). כדי לחקור בעיה זו ולטפל בה, נדרש מודל מתאים של פרקינסון בבעלי חיים. הפרוטוקול הנוכחי מבסס מודל פיברוזיס פריטוניאלי המושרה על ידי כלורהקסידין גלוקונאט (CG) המחקה את מצבו של חולה עם פרקינסון. פיברוזיס פריטוניאלי נגרם על ידי הזרקה תוך צפקית של 0.1% CG באתנול 15% במשך 3 שבועות (ניתן אחת ליומיים), בסך הכל תשע פעמים בעכברים זכרים C57BL/6. בדיקות תפקודיות פריטוניאליות בוצעו ביום ה-22. לאחר הקרבת העכברים, נקצרו הצפק הקודקודי של דופן הבטן והצפק הקרבי של הכבד. הם היו עבים יותר ופיברוטיים יותר כאשר נותחו מיקרוסקופית לאחר צביעת הטריכרום של מאסון. קצב האולטרה-סינון ירד, והעברת מסת גלוקוז הצביעה על עלייה הנגרמת על ידי CG בחדירות הצפק. למודל הפרקינסון שהוקם עשויים להיות יישומים בשיפור טכנולוגיית פרקינסון, יעילות הדיאליזה והארכת הישרדות המטופלים.

Introduction

דיאליזה פריטוניאלית (PD) היא סוג של טיפול בתחליפי כליות. עם זאת, לפרקינסון יש בעיות שלא ניתן לפתור. לדוגמה, טיפול ארוך טווח בפרקינסון עלול לגרום לנזק לצפק, מה שיוביל בסופו של דבר לכישלון אולטרה-סינון ולנסיגה מטיפול 1,2,3,4,5,6. פיברוזיס פריטוניאלי הוא אחד הסיבוכים החמורים ביותר ^7,8. פיברוזיס פריטוניאלי מאופיין על ידי תצהיר והצטברות של מטריצה תאית בתוך interstitium, ו neo-אנגיוגנזה ו vasculopathy של הצפק ^9,10.

הגורמים העיקריים לשינויים אלה בצפק הם דלקת צפק חוזרת ואי תאימות ביולוגית של הדיאליזה, שהם היפראוסמוטיים, גלוקוז גבוה, pH נמוך, והצטברות מוצר השפלת גלוקוז^11,12. לכן, מודלים ניסיוניים מתאימים בבעלי חיים יכולים לסייע לחוקרים לחקור טוב יותר את השינויים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של הצפק במהלך הטיפול בפרקינסון. לכן, ביסוס מודל פרקינסון של בעלי חיים חשוב לשיפור טכנולוגיית פרקינסון ויעילות הדיאליזה ולהארכת הישרדות החולים. מחקר זה נועד ליצור מודל עכבר PD על ידי הזרקה intraperitoneal (i.p.) של chlorhexidine gluconate (CG), כפי שתואר קודם^13,14. דגם עכבר PD זה הוא פשוט, קל לשימוש וישים בהשוואה למודלים אחרים של חיות פרקינסון.

Protocol

כל ניסויי העכבר אושרו על ידי מרכז חיות המעבדה של בית החולים E-DA / אוניברסיטת I-Shou וטופלו על פי "המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה" (NRC, ארה"ב 2011). עכברי C57BL/6 זכרים, בני 7-8 שבועות, שימשו במחקר הנוכחי.

1. הכנה כימית

1. הכינו את החומר המגרה הכימי על ידי דילול 0.1% כלורהקסידין גלוקונאט (CG, ראו טבלת חומרים) באתנול 15%.

2. טיפול בבעלי חיים

1. הקצו שלושה עכברים כקבוצת הביקורת. בצע הזרקה תוך צפקית (i.p.) של 1 מ"ל / ק"ג של 0.9% מלוחים נורמליים (NS) כל יומיים במשך 3 שבועות, בסך הכל תשע פעמים.
2. הקצה שלושה עכברים לקבוצת פיברוזיס הצפק. לגרום לפיברוזיס פריטוניאלי באמצעות כלורהקסידין גלוקונאט (CG) על ידי מתן זריקות i.p. של 0.1% של CG באתנול 15% (שלב 1.1) במינון של 12.5 μL / g משקל גוף. בצעו זאת אחת ליומיים במשך 3 שבועות, ובסך הכל תשע פעמים.

3. בדיקות תפקוד פריטוניאלי (מבחן שיווי משקל פריטוניאלי שונה)

1. הכינו תמיסת דיאליזה המכילה 4.25% גלוקוז. צייר 0.5 מ"ל של דגימת דיאליזה עם מזרק, ולאחר מכן לבדוק את ריכוז הגלוקוז במדגם דיאליזה.
   הערה: ריכוז הגלוקוז נקבע על פי שיטת הקסוקינאז/G6PD. דגימות דיאליזה היו נגישות לבדיקת Glu 2 מסוג L ונחקרו באמצעות אנלייזר ביוכימי (ראה טבלת חומרים). זהו ריכוז הגלוקוז הראשוני בדיאליזה.
2. מרדימים את העכברים על ידי הזרקה תוך שרירית של זולטיל וקסילזין (מוכן ביחס של 1:2 לפי נפח, ראה טבלת חומרים) במינון של 20 μL/20 gw. בנוסף, יש להשתמש במשחה וטרינרית על העיניים למניעת יובש בהרדמה.
3. ביצוע החדרת תמיסת הדיאליזה (2 מ"ל/20 גרם משקל גוף).
4. לאחר 30 דקות, להעריך ולאמת את עומק ההרדמה עם חוסר רפלקס צביטת הבוהן. לאחר מכן, בצע חתך אנכי בקו האמצע של הבטן (מתחת לתהליך הקסיפואיד), ולאחר מכן פתח את בטן העכברים ואסף את הנוזל התוך צפקי באמצעות מזרק (מוגדר כ"נפח 1"). לאחר מכן, מדדו את משקלה של כותנה נקייה ויבשה והכניסו את הכותנה לחלל הבטן של העכברים כדי לספוג את שאריות הנוזל התוך-צפקי. לבסוף, מדדו שוב את משקל הכותנה.
   הערה: העלייה במשקל של כותנה שווה למשקל של נוזל intraperitoneal שיורית. לאחר מכן, להמיר לנפח המתקבל (כוח משיכה סגולי: 1 גרם / ס"מ³; מוגדר כ "נפח 2"). נפח הדיאליזה הסופי הוא כרך 1 ועוד כרך 2.
5. השתמש 0.5 מ"ל של דגימת דיאליזה (דיאליזה סופית) כדי למדוד את ריכוז הגלוקוז. זהו ריכוז הגלוקוז הסופי בדיאליזה.
6. חשב את ultrafiltration נטו באמצעות הנוסחה¹⁵:
   
7. חישוב חדירות הצפק באמצעות הנוסחה הבאה¹⁵:
   

4. הכנת רקמות של שריר דופן הבטן והכבד וניתוח היסטולוגי

1. להקריב את העכברים באמצעות ניקוב לב (phlebotomy)^3,16.
2. לחתוך את דופן הבטן (1 ס"מ x 1 ס"מ) ואת hepatectomy הכולל. תקנו את דופן הבטן ורקמות הכבד של העכברים למשך הלילה בפורמלין חוצץ ניטרלי 10%.
3. הכינו קטעי פרפין בעובי 3 מיקרומטר של שריר דופן הבטן והכבד, ובצעו ניתוח היסטולוגי בעקבות דו"ח¹⁷ שפורסם בעבר.
4. להעריך את הצפק הקודקוד של דופן הבטן ואת הצפק הקרבי של משטחי הכבד של העכברים באמצעות מורפומטריה¹⁸.
5. ביצוע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות סטטיסטיקה ותוכנות גרפים (ראה טבלת חומרים). בטא את כל הנתונים כממוצע ± SD ונתח מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן t¹⁹. הגדר ערכים עם P <- 0.05 כתוצאות משמעותיות.

תוצאות

באיור 1A,B, הצפק הקודקודי של דופן הבטן היה עבה יותר באופן ניכר ופיברוטי יותר תחת צביעת הטריכרום¹⁷ של מאסון, מה שמצביע על כך שבקבוצת הביקורת שנחשפה ל-CG, פיברוזיס פריטוניאלי חמור יותר מאשר בקבוצת הביקורת במי מלח (NS). באיור 2A,B, הצפק הקרבי של מ?...

Discussion

במחקר זה, מודל PD של עכבר מוצג על ידי הזרקת i.p. של CG, והתוצאות הראו פיברוזיס פריטוניאלי והידרדרות תפקודית במודל זה, אשר חיקו את מצבו של חולה פרקינסון.

ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, לצורך ביצוע הזרקת i.p. של CG או NS, יש להרים את עור דופן הבטן של העכבר באמצעות מלקחיים כדי ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline	Y F CHEMICAL CORP., New Taipei City, Taiwan	-
10% neutral buffered formalin	Taiwan Burnett International Co., Ltd., Taipei City, Taiwan	00002A
Automatic biochemical analyzer	Hitachi Ltd., Tokyo, Japan	Labospect Series 008	for determining glucose concentration
Chlorhexidine digluconate solution, 20% in H2O	Sigma-Aldrich, MO, USA	C9394	diluted to 0.1% with 15% ethanol for injection
Ethanol	Avantor Performance Materials, LLC, PA, USA	BAKR8006-05	diluted to 15% with normal saline for working concentration
Glucose (Dianeal)	Baxter International, Inc., IL, USA	FNB9896	Commercial dialysis solution (4.25%)
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software, Inc., CA, US
L-type Glu 2 assay	FUJIFILM Wako, Japan	461-32403
Xylazine 20	Juily Pharmaceutical Co., Ltd., New Taipei City, Taiwan	-
Zoletil 50	Virbac Laboratories, Carros, France	-