Un modèle de souris de dommages péritonéaux induits par le gluconate de chlorhexidine

Résumé

Le présent protocole établit un modèle murin de dialyse péritonéale () de fibrose péritonéale induite par le gluconate de chlorhexidine (CG). Le modèle actuel est simple et facile à utiliser par rapport aux autres modèles animaux de DP.

Résumé

La fibrose péritonéale est une complication importante de la dialyse péritonéale (MP). Pour étudier et résoudre ce problème, un modèle animal approprié de MP est nécessaire. Le présent protocole établit un modèle de fibrose péritonéale induite par le gluconate de chlorhexidine (CG) qui imite l’état d’un patient atteint de la MP. La fibrose péritonéale a été induite par injection intrapéritonéale de 0,1% de CG dans de l’éthanol à 15% pendant 3 semaines (administrée tous les deux jours), pour un total de neuf fois chez des souris mâles C57BL/6. Des tests fonctionnels péritonéaux ont ensuite été effectués le jour 22. Après le sacrifice des souris, le péritoine pariétal de la paroi abdominale et le péritoine viscéral du foie ont été récoltés. Ils étaient plus épais et plus fibrotiques lorsqu’ils étaient analysés au microscope après la coloration trichrome de Masson. Le taux d’ultrafiltration a diminué et le transport de masse de glucose a indiqué une augmentation de la perméabilité péritonéale induite par CG. Le modèle de MP ainsi établi peut avoir des applications dans l’amélioration de la technologie de la MP, l’efficacité de la dialyse et la prolongation de la survie des patients.

Introduction

La dialyse péritonéale (DP) est un type de thérapie de remplacement rénal. Cependant, la MP a des problèmes qui ne peuvent pas être résolus. Par exemple, le traitement à long terme de la MP peut causer des dommages péritonéaux, entraînant éventuellement un échec de l’ultrafiltration et l’arrêt du traitement 1,2,3,4,5,6. La fibrose péritonéale est l’une des complications les plus graves ^7,8. La fibrose péritonéale est caractérisée par le dépôt et l’accumulation de matrice extracellulaire dans l’interstitium, ainsi que par la néo-angiogenèse et la vasculopathie du péritoine ^9,10.

Les principales causes de ces changements péritonéaux sont la péritonite récurrente et la non-biocompatibilité du dialysat, qui sont hyperosmotiques, hyperglycémiques, faible pH et accumulation de produits de dégradation du glucose^11,12. Par conséquent, des modèles expérimentaux animaux appropriés peuvent aider les chercheurs à mieux étudier les changements physiologiques et pathologiques du péritoine pendant le traitement par MP. Par conséquent, l’établissement d’un modèle animal de MP est important pour améliorer la technologie de la MP et l’efficacité de la dialyse et prolonger la survie des patients. Cette étude visait à générer un modèle murin par injection intrapéritonéale (i.p.) de gluconate de chlorhexidine (CG), comme décrit précédemment^13,14. Ce modèle de souris est simple, facile à utiliser et réalisable par rapport aux autres modèles animaux.

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Protocole

Toutes les expériences sur les souris ont été approuvées par le Centre des animaux de laboratoire de l’hôpital E-DA / Université I-Shou et ont été traitées conformément au « Guide for the Care and Use of Laboratory Animals » (NRC, États-Unis 2011). Des souris mâles C57BL/6, âgées de 7 à 8 semaines, ont été utilisées pour la présente étude.

1. Préparation chimique

1. Préparer l’irritant chimique en diluant le gluconate de chlorhexidine à 0,1 % (CG, voir le tableau des matières) dans de l’éthanol à 15 %.

2. Traitement des animaux

1. Assignez trois souris comme groupe témoin. Effectuer une injection intrapéritonéale (i.p.) de 1 mL/kg de solution saline normale à 0,9 % tous les deux jours pendant 3 semaines, pour un total de neuf fois.
2. Assignez trois souris au groupe de fibrose péritonéale. Induire une fibrose péritonéale à l’aide de gluconate de chlorhexidine (CG) en administrant des injections i.p. de 0,1% de CG dans de l’éthanol à 15% (étape 1.1) à une dose de 12,5 μL / g de poids corporel. Effectuez cela tous les deux jours pendant 3 semaines, pour un total de neuf fois.

3. Tests de la fonction péritonéale (test d’équilibre péritonéal modifié)

1. Préparez une solution de dialyse contenant 4,25% de glucose. Prélever 0,5 mL d’échantillon de dialysat avec une seringue, puis vérifier la concentration de glucose dans l’échantillon de dialysat.
   NOTE: La concentration de glucose est déterminée selon la méthode hexokinase/G6PD. Les échantillons de dialysat ont été consultés pour le test Glu 2 de type L et étudiés à l’aide d’un analyseur biochimique (voir le tableau des matériaux). Il s’agit de la concentration initiale de glucose du dialysat.
2. Anesthésier les souris par injection intramusculaire de Zoletil et de Xylazine (préparées dans un rapport de 1:2 en volume, voir le tableau des matières) à une dose de 20 μL/20 gw. De plus, utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
3. Effectuer l’instillation intraveineuse de la solution de dialyse (2 mL/20 g de poids corporel).
4. Après 30 min, évaluer et vérifier la profondeur de l’anesthésie avec absence de réflexe de pincement des orteils. Ensuite, effectuez une incision verticale dans la ligne médiane de l’abdomen (sous le processus xiphoïde), puis ouvrez l’abdomen des souris et recueillez le liquide intrapéritonéal avec une seringue (définie comme « volume 1 »). Ensuite, mesurez le poids d’un coton propre et sec et mettez le coton dans la cavité abdominale des souris pour absorber le liquide intrapéritonéal résiduel. Enfin, mesurez à nouveau le poids du coton.
   NOTE: Le gain de poids du coton est égal au poids du liquide intrapéritonéal résiduel. Ensuite, convertissez au volume obtenu (densité : 1 g/^cm3 ; défini comme « volume 2 »). Le volume final du dialysat est le volume 1 plus le volume 2.
5. Utilisez 0,5 mL d’échantillon de dialysat (dialysat final) pour mesurer la concentration de glucose. Il s’agit de la concentration finale de glucose du dialysat.
6. Calculer l’ultrafiltration nette à l’aide de la formule¹⁵ :
   
7. Calculer la perméabilité péritonéale à l’aide de la formule¹⁵ suivante :
   

4. Préparation tissulaire du muscle de la paroi abdominale et du foie et analyse histologique

1. Sacrifier les souris par ponction cardiaque (phlébotomie)^3,16.
2. Couper la paroi abdominale (1 cm x 1 cm) et hépatectomie totale. Fixez la paroi abdominale et les tissus hépatiques des souris pendant la nuit dans du formol tamponné neutre à 10%.
3. Préparer des sections de paraffine de 3 μm d’épaisseur du muscle et du foie de la paroi abdominale et effectuer une analyse histologique à la suite du rapport¹⁷ publié précédemment.
4. Évaluer le péritoine pariétal de la paroi abdominale et le péritoine viscéral des surfaces hépatiques des souris à l’aide de la morphométrie¹⁸.
5. Effectuer des analyses statistiques à l’aide de statistiques et de logiciels graphiques (voir le tableau des matériaux). Exprimer toutes les données sous forme de moyenne ± écart-type et analyser la signification statistique à l’aide d’un test t¹⁹. Définissez des valeurs avec P < 0,05 comme résultats significatifs.

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Résultats

Dans la figure 1A,B, le péritoine pariétal de la paroi abdominale était nettement plus épais et plus fibrotique sous la coloration trichrome de Masson¹⁷, ce qui indique que dans le groupe exposé à CG, la fibrose péritonéale est plus grave que dans le groupe témoin saline (NS). Dans la figure 2A,B, le péritoine viscéral des surfaces hépatiques était également nettement plus épais et plus fibrotique, prouvant...

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Discussion

Dans cette étude, un modèle de MP murine est présenté par injection i.p. de CG, et les résultats ont montré une fibrose péritonéale et une détérioration fonctionnelle dans ce modèle, qui imitait l’état du patient MP.

Le protocole comporte plusieurs étapes critiques. Tout d’abord, pour effectuer une injection intra-électrique de CG ou NS, la peau de la paroi abdominale de la souris doit être ramassée à l’aide d’une pince pour prévenir les dommages aux organes intrapér...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline	Y F CHEMICAL CORP., New Taipei City, Taiwan	-
10% neutral buffered formalin	Taiwan Burnett International Co., Ltd., Taipei City, Taiwan	00002A
Automatic biochemical analyzer	Hitachi Ltd., Tokyo, Japan	Labospect Series 008	for determining glucose concentration
Chlorhexidine digluconate solution, 20% in H2O	Sigma-Aldrich, MO, USA	C9394	diluted to 0.1% with 15% ethanol for injection
Ethanol	Avantor Performance Materials, LLC, PA, USA	BAKR8006-05	diluted to 15% with normal saline for working concentration
Glucose (Dianeal)	Baxter International, Inc., IL, USA	FNB9896	Commercial dialysis solution (4.25%)
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software, Inc., CA, US
L-type Glu 2 assay	FUJIFILM Wako, Japan	461-32403
Xylazine 20	Juily Pharmaceutical Co., Ltd., New Taipei City, Taiwan	-
Zoletil 50	Virbac Laboratories, Carros, France	-