JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол устанавливает модель перитонеального фиброза, индуцированного хлоргексидином глюконатом (КГ), у мышей с помощью перитонеального диализа (ПД). Текущая модель проста и удобна в использовании по сравнению с другими моделями PD на животных.

Аннотация

Перитонеальный фиброз является важным осложнением перитонеального диализа (БП). Для исследования и решения этой проблемы требуется соответствующая животная модель БП. Настоящий протокол устанавливает модель перитонеального фиброза, индуцированную хлоргексидином глюконатом (ХГ), которая имитирует состояние пациента с БП. Перитонеальный фиброз был индуцирован внутрибрюшинной инъекцией 0,1% КГ в 15% этаноле в течение 3 недель (вводили через день), в общей сложности девять раз у самцов мышей C57BL / 6. Затем на 22-й день были проведены перитонеальные функциональные пробы. После того, как мыши были принесены в жертву, была собрана париетальная брюшина брюшной стенки и висцеральная брюшина печени. Они были толще и более фиброзными при микроскопическом анализе после трихромного окрашивания Массона. Скорость ультрафильтрации снизилась, а массовый транспорт глюкозы указал на индуцированное ХГ увеличение проницаемости брюшины. Созданная таким образом модель БП может быть применена для улучшения технологии БП, эффективности диализа и продления выживаемости пациентов.

Введение

Перитонеальный диализ (ПД) является одним из видов заместительной почечной терапии. Однако у ПД есть проблемы, которые невозможно решить. Например, длительное лечение БП может вызвать повреждение брюшины, что в конечном итоге приведет к неудаче ультрафильтрации и прекращению лечения 1,2,3,4,5,6. Перитонеальный фиброз является одним из самых серьезных осложнений 7,8. Перитонеальный фиброз характеризуется отложением и накоплением внеклеточного матрикса в интерстиции, а также неоангиогенезом и васкулопатией брюшины 9,10.

Основными причинами этих перитонеальных изменений являются рецидивирующий перитонит и небиосовместимость диализата, которые являются гиперосмотическими, с высоким содержанием глюкозы, низким рН и накоплением продуктов распада глюкозы11,12. Таким образом, подходящие экспериментальные модели на животных могут помочь исследователям лучше изучить физиологические и патологические изменения брюшины во время терапии БП. Таким образом, создание модели БП животных важно для улучшения технологии БП и эффективности диализа, а также для продления выживаемости пациентов. Это исследование было направлено на создание модели БП у мышей путем внутрибрюшинной (внутривенной) инъекции хлоргексидина глюконата (КГ), как описано ранее13,14. Эта модель мыши PD проста, удобна в использовании и осуществима по сравнению с другими моделями PD животных.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты на мышах были одобрены Центром лабораторных животных больницы E-DA / Университета I-Shou и проводились в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» (NRC, США 2011 г.). Для настоящего исследования использовали самцов мышей C57BL/6 в возрасте 7-8 недель.

1. Химическая подготовка

  1. Приготовьте химический раздражитель, разбавив 0,1% хлоргексидина глюконата (CG, см. Таблицу материалов) в 15% этаноле.

2. Лечение животных

  1. Назначьте трех мышей в качестве контрольной группы. Выполняйте внутрибрюшинную инъекцию (в/) 1 мл/кг 0,9% физиологического раствора (НС) через день в течение 3 недель, всего девять раз.
  2. Назначьте трех мышей в группу перитонеального фиброза. Индуцировать перитонеальный фиброз с помощью хлоргексидина глюконата (ХГ) путем внутримышечного введения 0,1% ХГ в 15% этаноле (этап 1.1) в дозе 12,5 мкл / г массы тела. Выполняйте это через день в течение 3 недель, всего девять раз.

3. Тесты функции брюшины (модифицированный тест перитонеального равновесия)

  1. Приготовьте диализирующий раствор, содержащий 4,25% глюкозы. Возьмите 0,5 мл образца диализата с помощью шприца, а затем проверьте концентрацию глюкозы в образце диализата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация глюкозы определяется по методу гексокиназы/G6PD. Образцы диализата были подвергнуты анализу Glu 2 L-типа и исследованы с помощью биохимического анализатора (см. Таблицу материалов). Это начальная концентрация глюкозы диализата.
  2. Обезболивают мышей внутримышечным введением Золетила и Ксилазина (приготовленных в соотношении 1:2 по объему, см. Таблицу материалов) в дозе 20 мкл/20 гв. Кроме того, используйте ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  3. Проводят внутривенную инстилляцию диализирующего раствора (2 мл/20 г массы тела).
  4. Через 30 минут оцените и проверьте глубину анестезии при отсутствии рефлекса защемления пальцев ног. Затем выполните вертикальный разрез по средней линии брюшной полости (под мечевидным отростком), затем откройте брюшную полость мышей и соберите внутрибрюшинную жидкость с помощью шприца (определяемого как «объем 1»). Затем измерьте вес чистого и сухого хлопка и поместите вату в брюшную полость мышей, чтобы поглотить остаточную внутрибрюшинную жидкость. Наконец, снова измерьте вес хлопка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прибавка в весе хлопка равна весу остаточной внутрибрюшинной жидкости. Затем преобразуйте в полученный объем (удельный вес: 1 г/см3; определяется как «объем 2»). Окончательный объем диализата составляет том 1 плюс том 2.
  5. Используйте 0,5 мл образца диализата (конечный диализат) для измерения концентрации глюкозы. Это конечная концентрация глюкозы диализата.
  6. Рассчитайте чистую ультрафильтрацию по формуле15:
    figure-protocol-3047
  7. Рассчитайте проницаемость брюшины по следующей формуле15:
    figure-protocol-3231

4. Тканевая подготовка мышц брюшной стенки и печени и гистологический анализ

  1. Принесите мышей в жертву с помощью пункции сердца (флеботомии)3,16.
  2. Разрез брюшной стенки (1 см х 1 см) и тотальная гепатэктомия. Зафиксируйте брюшную стенку и ткани печени мышей на ночь в 10% нейтральном буферном формалине.
  3. Подготовьте парафиновые срезы мышц брюшной стенки и печени толщиной 3 мкм и проведите гистологический анализ в соответствии с ранее опубликованным отчетом17.
  4. Оцените париетальную брюшину брюшной стенки и висцеральную брюшину поверхности печени мышей с помощью морфометрии18.
  5. Выполняйте статистический анализ с помощью программного обеспечения для статистики и построения графиков (см. Таблицу материалов). Выразите все данные как среднее ± SD и проанализируйте статистическую значимость с помощью t-критерия19. Определите значения с P < 0,05 как значимые результаты.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 1A, B париетальная брюшина брюшной стенки была заметно толще и более фиброзной при трихромном окрашиванииМассона 17, что указывает на то, что в группе, подвергшейся воздействию ХГ, перитонеальный фиброз более тяжелый, чем в контрольной гру?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом исследовании модель БП мыши представлена внутримышной инъекцией ХГ, и результаты показали перитонеальный фиброз и функциональное ухудшение в этой модели, которая имитировала состояние пациента с БП.

В протоколе есть несколько важных шагов. Во-первых, для выполне?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Мы искренне благодарим Шин-Хан Ценга за критическое обсуждение и частичное выполнение исследования. Это исследование было поддержано EDAHP110003 и NCKUEDA110002 из Исследовательского фонда больницы E-DA и Национального университета Ченг Кунг, Тайвань.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Normal SalineY F CHEMICAL CORP., New Taipei City, Taiwan-
10% neutral buffered formalinTaiwan Burnett International Co., Ltd., Taipei City, Taiwan00002A
Automatic biochemical analyzerHitachi Ltd., Tokyo, JapanLabospect Series 008for determining glucose concentration
Chlorhexidine digluconate solution, 20% in H2OSigma-Aldrich, MO, USAC9394diluted to 0.1% with 15% ethanol for injection
EthanolAvantor Performance Materials, LLC, PA, USABAKR8006-05diluted to 15% with normal saline for working concentration
Glucose (Dianeal)Baxter International, Inc., IL, USAFNB9896Commercial dialysis solution (4.25%)
GraphPad Prism 8.0GraphPad Software, Inc., CA, US
L-type Glu 2 assayFUJIFILM Wako, Japan461-32403
Xylazine 20Juily Pharmaceutical Co., Ltd., New Taipei City, Taiwan-
Zoletil 50Virbac Laboratories, Carros, France-

Ссылки

  1. Han, S. H., et al. Improving outcome of CAPD: twenty-five years' experience in a single Korean center. Peritoneal Dialysis International. 27 (4), 432-440 (2007).
  2. Kawaguchi, Y., Hasegawa, T., Nakayama, M., Kubo, H., Shigematu, T. Issues affecting the longevity of the continuous peritoneal dialysis therapy. Kidney International Supplements. 62, 105-107 (1997).
  3. Lee, Y. C., et al. Vitamin D can ameliorate chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis and functional deterioration through the inhibition of epithelial-to-mesenchymal transition of mesothelial cells. BioMed Research International. 2015, 595030(2015).
  4. Nakamoto, H., Kawaguchi, Y., Suzuki, H. Is technique survival on peritoneal dialysis better in Japan. Peritoneal Dialysis International. 26 (2), 136-143 (2006).
  5. Schaefer, F., Klaus, G., Muller-Wiefel, D. E., Mehls, O. Current practice of peritoneal dialysis in children: results of a longitudinal survey. Mid European Pediatric Peritoneal Dialysis Study Group (MEPPS). Peritoneal Dialysis International. 19, Suppl 2 445-449 (1999).
  6. Woodrow, G., Turney, J. H., Brownjohn, A. M. Technique failure in peritoneal dialysis and its impact on patient survival. Peritoneal Dialysis International. 17 (4), 360-364 (1997).
  7. Schmidt, D. W., Flessner, M. F. Pathogenesis and treatment of encapsulating peritoneal sclerosis: basic and translational research. Peritoneal Dialysis International. 28, Suppl 5 10-15 (2008).
  8. Augustine, T., Brown, P. W., Davies, S. D., Summers, A. M., Wilkie, M. E. Encapsulating peritoneal sclerosis: clinical significance and implications. Nephron Clinical Practice. 111 (2), 149-154 (2009).
  9. Di Paolo, N., Nicolai, G. A., Garosi, G. The peritoneum: from histological studies to mesothelial transplant through animal experimentation. Peritoneal Dialysis International. 28, Suppl 5 5-9 (2008).
  10. Fusshoeller, A. Histomorphological and functional changes of the peritoneal membrane during long-term peritoneal dialysis. Pediatric Nephrology. 23 (1), 19-25 (2008).
  11. Goffin, E. Peritoneal membrane structural and functional changes during peritoneal dialysis. Seminars in Dialysis. 21 (3), 258-265 (2008).
  12. Ito, T., Yorioka, N. Peritoneal damage by peritoneal dialysis solutions. Clinical and Experimental Nephrology. 12 (4), 243-249 (2008).
  13. Io, K., et al. SAHA suppresses peritoneal fibrosis in mice. Peritoneal Dialysis International. 35 (3), 246-258 (2015).
  14. Yoh, K., Ojima, M., Takahashi, S. Th2-biased GATA-3 transgenic mice developed severe experimental peritoneal fibrosis compared with Th1-biased T-bet and Th17-biased RORgammat transgenic mice. Experimental Animals. 64 (4), 353-362 (2015).
  15. Karl, Z. J. T., et al. Peritoneal Equilibration Test. Peritoneal Dialysis International. 7 (3), 138-148 (1987).
  16. Lee, Y. C., et al. The clinical implication of vitamin D nanomedicine for peritoneal dialysis-related peritoneal damage. International Journal of Nanomedicine. 14, 9665-9675 (2019).
  17. Goldner, J. A. Modification of the masson trichrome technique for routine laboratory purposes. The American Journal of Pathology. 14 (2), 237-243 (1938).
  18. Cheng, F. Y., et al. Novel application of magnetite nanoparticle-mediated vitamin D3 delivery for peritoneal dialysis-related peritoneal damage. International Journal of Nanomedicine. 16, 2137-2146 (2021).
  19. Ross, A., Willson, V. L. Basic and Advanced Statistical Tests: Writing Results Sections and Creating Tables and Figures. , SensePublishers. 13-16 (2017).
  20. Suga, H., et al. Preventive effect of pirfenidone against experimental sclerosing peritonitis in rats. Experimental and Toxicologic Pathology. 47 (4), 287-291 (1995).
  21. Ishii, Y., et al. An experimental sclerosing encapsulating peritonitis model in mice. Nephrology Dialysis Transplantation. 16 (6), 1262-1266 (2001).
  22. Nishino, T., et al. Antisense oligonucleotides against collagen-binding stress protein HSP47 suppress peritoneal fibrosis in rats. Kidney International. 64 (3), 887-896 (2003).
  23. Mishima, Y., et al. Enhanced expression of heat shock protein 47 in rat model of peritoneal fibrosis. Peritoneal Dialysis International. 23 (1), 14-22 (2003).
  24. Kushiyama, T., et al. Effects of liposome-encapsulated clodronate on chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (10), 3143-3154 (2011).
  25. Nishino, T., et al. Involvement of lymphocyte infiltration in the progression of mouse peritoneal fibrosis model. Renal Failure. 34 (6), 760-766 (2012).
  26. Lua, I., Li, Y., Pappoe, L. S., Asahina, K. Myofibroblastic conversion and regeneration of mesothelial cells in peritoneal and liver fibrosis. The American Journal of Pathology. 185 (12), 3258-3273 (2015).
  27. Kitamura, M., et al. Epigallocatechin gallate suppresses peritoneal fibrosis in mice. Chemico-Biological Interactions. 195 (1), 95-104 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены