一种简单且廉价的跑轮模型，用于小鼠的渐进式阻力训练

摘要

此过程描述了小鼠中可翻译的渐进式负载跑轮阻力训练模型。这种阻力训练模型的主要优点是它完全是自愿的，从而减轻了动物的压力和研究人员的负担。

摘要

以前开发的基于啮齿动物抗性的运动模型，包括协同消融、电刺激、加重梯子攀爬和最近的加重拉雪橇，在提供肥大刺激以诱导骨骼肌适应方面非常有效。虽然这些模型已被证明对骨骼肌研究非常宝贵，但它们要么是侵入性的，要么是非自愿的，而且是劳动密集型的。幸运的是，许多啮齿动物品系在获得跑轮时自愿长距离奔跑。啮齿动物的负载轮运行（LWR）模型能够诱导人类阻力训练中常见的适应性，例如增加肌肉质量和纤维肥大，以及刺激肌肉蛋白质合成。然而，增加适度的车轮负荷要么不能阻止小鼠跑很远的距离，这更能反映耐力/阻力训练模型，要么由于负荷应用方法，小鼠几乎完全停止跑步。因此，已经为施加外部阻力并逐渐增加的小鼠开发了一种新颖的高负载轮运行模型（HLWR），使小鼠能够以比以前使用的高负载继续跑步。这种新颖的HLWR模型的初步结果表明，它提供了足够的刺激，以在9周的训练方案中诱导肥大适应。本文描述了在小鼠中执行这种简单但廉价的渐进式基于阻力的运动训练模型的具体程序。

引言

骨骼肌质量约占成年人体重的 40%;因此，在整个生命中保持骨骼肌质量至关重要。骨骼肌质量在能量代谢、维持核心体温和葡萄糖稳态中起着不可或缺的作用¹.骨骼肌的维持是蛋白质合成和蛋白质降解之间的平衡，但在理解驱动这些过程的复杂分子机制方面仍然存在许多差距。为了研究调节肌肉质量维持和生长的分子机制，人类受试者的研究模型经常采用基于阻力运动的干预措施，因为机械刺激在骨骼肌质量的调节中起着不可或缺的作用。虽然人类受试者研究取得了成功，但展示适应性所需的时间和对侵入性程序（即肌肉活检）的伦理问题限制了可以获得的数据量。虽然对阻力运动的适应在哺乳动物物种中相当普遍，但动物模型提供了能够精确控制饮食和运动方案的好处，同时还允许收集全身的整个组织，如大脑、肝脏、心脏和骨骼肌。

已经开发了许多用于啮齿动物的阻力训练模型:协同消融²、电刺激^3，4、加重梯子攀爬⁵、加重拉雪橇⁶ 和拉布深蹲⁷。很明显，如果操作正确，所有这些模型都可以成为诱导骨骼肌适应的有效模型，例如肥大。然而，这些模型的缺点是它们大多是非自愿的，而不是正常啮齿动物行为的一部分，时间/劳动密集型和侵入性。

幸运的是，许多小鼠和大鼠品系在获得跑轮时自愿长距离奔跑。此外，自由跑轮 （FWR） 运动模型不依赖于广泛的调理、正/负强化或麻醉来强制运动或肌肉活动^8，9。跑步活动在很大程度上取决于小鼠的品系、性别、年龄和个人基础。Lightfoot等比较了15种不同小鼠品系的跑步活动，发现日跑步距离从2.93公里到7.93公里不等，其中C57BL/6只小鼠跑得最远，不分性别¹⁰只。FWR被普遍认为是诱导骨骼肌和心肌耐力适应的优秀模型¹¹，^12，13，14，^15，16;然而，在阻力训练模型中使用车轮运行较少被研究。

正如人们可能怀疑的那样，车轮运行的肥大效应可以通过增加对跑轮的阻力来增强，称为负载轮运行（LWR），因此需要更大的努力在车轮上运行以更接近地模仿阻力训练。使用不同的负荷应用方法，以前的研究表明，利用大鼠和小鼠的LWR模型在6-8周内常规地显示出肢体肌肉质量增加5%-30%¹⁷，^18，19，^20，21。此外，D'hulst等人证明，与FWR²²相比，单次LWR导致蛋白质合成信号通路的激活增加50%。车轮阻力最常通过基于摩擦的恒定载荷方法施加，其中使用磁力制动器或张力螺栓来施加车轮阻力¹²，¹⁹，^23，24。基于摩擦的恒定负载方法的一个警告是，当施加中到高阻力时，动物无法克服高阻力来启动车轮的运动，从而有效地停止训练。最重要的是，许多用于啮齿动物跑轮模型的笼子和车轮系统非常昂贵，并且需要专门的设备。

最近，Dungan等人开发了一种渐进式加权轮运行（PoWeR）模型，该模型通过粘附在车轮单侧的外部质量 不 对称地将载荷施加到车轮上。PoWeR模型的不平衡车轮负荷和可变阻力被认为可以鼓励小鼠的持续跑步活动并促进较短的负荷轮运行爆发，更接近于阻力训练¹⁷进行的集合和重复。尽管平均跑步距离为每天 10-12 公里，但 PoWeR 模型的足底肌湿质量和纤维横截面积 （CSA） 分别增加了 16% 和 17%。尽管有许多实际优势，但轻水堆的PoWeR模型确实存在一些局限性。正如作者所认识到的那样，PoWeR模型是一种大容量的"混合"刺激，反映了混合的耐力/阻力运动模型（即人类的并发训练），而不是更严格的基于阻力运动的模型，可能会引入干扰效应并导致不太明显的肥大或诱导肥大的不同机制²⁵.确保在旨在成为阻力运动训练的模型中不会同时发生训练现象势在必行。因此，对PoWeR模型进行了修改，以开发一个LWR模型，该模型利用比以前使用的更高的负载，更接近阻力训练模型。本文提供了C57BL / 6小鼠中简单且廉价的9周渐进阻力训练LWR模型的详细信息。

研究方案

这项研究得到了阿巴拉契亚州立大学机构动物护理和使用委员会（#22-05）的批准。

1. 动物

1. 从内部小鼠群体中采购C57BL / 6小鼠。
   注意:使用研究开始时5-8个月大的雄性小鼠。每日跑步活动在²⁶ 岁时大约 9-10 周达到高峰和平台期。先前的研究表明，老年小鼠（22-24个月）也将执行负载轮运行²⁷。
2. 将小鼠单独安置在带有金属丝盖的标准啮齿动物笼中，并将笼子保持在受控环境中（20-24°C，12:12小时光:暗循环）。
3. 随意提供标准的啮齿动物食物和水。

2. 跑轮装置

1. 运行轮设置:
   注意:除了添加 1 g 或 2.5 g 负载磁铁外，所有运行协议的运行轮组装/设置都类似。
   1. 将单个 1 g 传感器磁铁粘在跑轮的外中圆周上（图 1）。
   2. 将此车轮与单个 1 g 传感器磁铁一起使用，仅用于车轮适应的第一周。
   3. 加载轮运行（LWR;与 PoWeR¹⁷ 相同的加载协议）:遵循步骤 2.1.4-2.1.6。
   4. 轻水堆的第 2 周需要 2 g 的负荷（见表 1）。
   5. 将两个 1 g 磁铁并排粘在车轮的外圆周上（图 2A）。
      注意:在这里，使用胶带将磁铁固定到位直到胶水牢固干燥会很有帮助;否则，它们可能会被传感器磁铁吸引并脱落。
   6. 在第 3、4 和 6 周，通过在已经存在的任一磁铁上放置另一个 1 g 磁铁来施加额外的负载。
      注意:无需胶水，因为磁铁牢固地相互粘附。例如，在第 6 周负载 6 g 时，每个磁铁将堆叠三层（图 2B）。
   7. 高负载车轮运行 （HLWR）:遵循步骤 2.1.8-2.1.11。
      注意:HLWR 协议需要三组轮子。组装不同的轮子组允许研究人员在彻底清洁和消毒轮子后为其他小鼠重复使用轮子设置（每组的数量应由研究人员根据队列/组大小确定）。
   8. 第一组轮子（仅在第 2 周需要）将有一个 2.5 克磁铁;将一块 2.5 g 磁铁粘在车轮的外圆周上（请参阅步骤 2.1.5 下面的注释）（图 3A）。
   9. 第二组轮子（仅在第 3 周需要）将有两个 2.5 g 磁铁;将两个 2.5 g 磁铁并排粘在车轮的外圆周上（图 3B）。
   10. 第三组轮子（第 4 周及以后需要）将并排有三个 2.5 g 磁铁;将三个 2.5 g 磁铁并排粘在车轮的外圆周上（图 3C）。
   11. 在第 6 周和第 8 周施加额外的负载，方法是在已经存在的任一磁铁上放置另一个 2.5 g 磁铁（图 3D、E）。

图 1:基本运行轮，单个 1 g 传感器磁铁粘在车轮的中间外圆周上。 请点击此处查看此图的大图。

图 2:带有传感器磁铁和 1 g 加载磁铁的加载运行轮 （LWR）。 （A） 2 g 负载示例，两个 1 g 磁铁并排粘在车轮外边缘;（B）以6g负载为例，两个1g磁铁并排粘在车轮外边缘，并施加额外的4g负载。请点击此处查看此图的大图。

图 3:带有传感器磁铁和 2.5 g 负载磁铁的高负载跑轮 （HLWR）。 （A） 2.5 g 负载示例，一个 2.5 g 磁铁粘在车轮外边缘;（B）以5克负载为例，两个2.5克磁铁并排粘在车轮外边缘;（C）以7.5g负载为例，三个2.5g磁铁并排粘在车轮外边缘;（D）以10克负载为例，三个2.5克磁铁并排粘在车轮外边缘，并额外施加2.5克载荷;（E）以12.5g负载为例，三个2.5g磁铁并排粘在车轮外边缘，并施加额外的5g负载。请点击此处查看此图的大图。

3. 保持架组装

1. 使用配备数字自行车码表的笼子组装跑轮，以监控锻炼时间 （h） 和行驶距离 （km）。平均速度（公里/小时）是通过算术得出的。
   1. 确保在组装之前将新电池插入自行车码表。
   2. 在初始自行车计算机编程期间设置车轮尺寸（请参阅制造商的说明）;通过测量运行轮的外周计算每转距离（例如，此处使用的轮类型为3，580毫米）。
2. 将自行车码表传感器放在笼盖外侧的固体表面上，直接位于车轮传感器磁铁所在的正上方。确保所有计算机和传感器组件都包含在笼子外的坚固屏障内，以防止老鼠咀嚼组件。
   1. 利用空移液器吸头盒的盖子，切出一个小矩形，供磁性自行车传感器驻留，盒子的主要部分（移除吸头架网格）来固定自行车码表和电线（图 4A）。
   2. 在固体表面的角落钻两个孔，将磁性自行车传感器和行走轮架固定在保持架外侧（图 4A）。
3. 将运行轴距倒置插入保持架盖上的间隙，但插入步骤 3.2 中所述的固体表面顶部（图 4B）。
   1. 用硬件将轴距和计算机传感器固定到保持架顶部（图 4C、D）。
4. 确保传感器磁铁和计算机传感器之间的间隔不超过 1 厘米，以便正确记录车轮运动（大多数标准自行车计算机传感器是双向的，将记录任一旋转方向的正车轮运动）。
5. 将适当的行走轮（如上所述）从笼盖内侧连接到轴距，并将盖子牢固地放在笼子上（图 4E、F）。
6. 将轮子悬挂在笼盖上，确保与笼子地板至少有 2.5 厘米的间隙。在笼子中放置最少量的垫料，以确保轮子自由旋转，但不会因垫料堆积而受到阻碍。
7. 在实验期间，以一致的间隔计划记录来自自行车码表的数据，以确保准确的活动监控。
   1. 认识到小鼠是一种夜行动物;因此，它们的大部分自然笼活动（包括车轮运行）将在光照周期的黑暗时间进行。

图 4:运行轮保持架组件。 （A） 放置在固体表面/托盘中的自行车码表和磁性传感器;（B）倒轴距放置在实心表面/托盘和传感器的顶部（顶视图;注意传感器表面/托盘上的两个孔，用于用硬件将底座固定到笼盖上），（C）倒轴距与硬件组装好的硬件（底视图）;（D）倒轴距与硬件组装（顶视图）;（五）全笼总成（俯视图）;和 （F） 全保持架组件（侧视图）。 请点击此处查看此图的大图。

4. 运动训练负荷协议

1. 将久坐（SED）小鼠单独饲养在包含锁定跑轮的笼子中9周，以防止任何跑步。
   注意:表1提供了实验设计中使用的LWR（PoWeR）和HLWR协议的加载时间表。
2. 如有必要，减少LWR和HLWR组的负荷，以确保小鼠在整个9周方案中继续锻炼。

		周
		1	2	3	4	5	6	7	8	9
轻水堆 （n = 4）	负载 （g）	0.0	2.0	3.0	4.0	5.0	5.0	6.0	6.0	6.0
	%BM	--	8%	11%	15%	19%	19%	23%	23%	23%
HLWR （n =7）	负载 （g）	0.0	2.5	5.0	7.5	7.5	10.0	10.0	12.5	12.5
	%BM	--	10%	19%	28%	28%	38%	38%	48%	48%

表 1.加载轮运行协议

5. 原位 肌肉功能测试、组织采集和组织分析

1. 在9周的训练干预之后，使用吸入异氟醚（4%诱导;2%维持）和辅助氧气麻醉小鼠，并确保在整个过程中进行适当的麻醉平面监测。
2. 对腓肠肌、足底肌、比目鱼肌 （GPS） 复合体进行 原位 肌肉功能测试，以测试等长肌肉力量²⁸。通过用 27 G 电极针在 1-300 Hz 之间的 11 个上升频率直接刺激坐骨神经来建立力-频率曲线，破伤风收缩发生在 100-150 Hz²⁹ 左右。
3. 肌肉功能测试后，立即通过颈椎脱位 对 小鼠实施安乐死，并通过切除心脏来确认安乐死。小心切除足底和比目鱼肌并记录湿组织块。
4. 将每个肌肉样品涂覆在包埋培养基（OCT）中，并将其安装在软木塞上。将其冷冻在液氮冷却的异戊烷中，并将其储存在-80°C，直到对肌肉组织切片（10μm厚）进行进一步的免疫组织化学（IHC）分析。
5. 使用层粘连蛋白的免疫荧光分析肌纤维 CSA。使用自动图像量化平台³⁰测量光纤CSA。

6. 统计分析

1. 将所有数据表示为平均值±标准偏差。
2. 使用显著性设置为 p ≤ 0.05 的统计分析软件进行统计分析。
3. 将车轮运行和训练量数据与重复测量双向方差分析进行比较。
4. 将体重、组织质量、CSA 和肌肉功能与单因素方差分析进行比较。如果发现显着的 F 比，请使用费舍尔 LSD 事后分析比较组内差异。
5. 计算效应大小，然后分别将其解释为 0.01、0.06 和 0.14（对于小、中和大效应大小）。

结果

在这项研究中，24只C57BL / 6小鼠（本研究开始时为6.3±0.7个月）被随机分配到三个治疗组之一:久坐（SED），负荷轮跑（LWR;与Dungan等人描述的PoWeR相同¹⁷）或高LWR（HLWR），然后完成各自的9周方案。在适应周（第 1 周）之后，跑步距离或训练量没有组或组 x 时间差异（图 5）。

讨论

啮齿动物现有的阻力运动模型已被证明对骨骼肌研究非常宝贵;然而，其中许多模型是侵入性的、非自愿的和/或时间和劳动密集型的。LWR是一种出色的模型，它不仅诱导了与其他公认的阻力运动训练模型中观察到的类似的肌肉适应，而且还为动物提供了慢性，低压力的运动刺激，研究人员的时间/劳动承诺最少。此外，由于LWR模型需要研究人员的最少直接干预，因此可以轻松地同时对整个小鼠队列?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 g disc neodymium magnets	Applied Magnets	ND018-6	Used for all sensor magnets and 1 g increments of wheel loading
2.5 g disc neodymium magnets	Applied Magnets	ND022	Used for 2.5 g increments of wheel loading
8-32 x 1" stainless steel screws	Amazon		https://www.amazon.com/gp/product/B07939RS23/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
8-32 Wing Nuts	Amazon		https://www.amazon.com/gp/product/B07YYWW2SB/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1
10 µL pipette tip box (empty)	Thermo Scientific	2140	We used empty ART Pipette tip boxes, but any similar sized boxes/trays would suffice
Extreme Liquid Glue	Loctite
Laminin primary antibody	Novus Biologicals	NB300-144AF647	primary antibody conjugated with AF657; 1:200 in PBS containing 10% normal goat serum
Lithium 3 V battery	n/a	CR2032
M10 (3/16" x 1 1/4") stainless steel fender washers	Amazon		https://www.amazon.com/gp/product/B00OHUHEU8/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1
MyoVision: Automated Image Quantification Platform	Wen et al. (2017)	v1.0	https://www.uky.edu/chs/center-for-muscle-biology/myovision
Polycarbonate rodent cage (430 mm L x 290 mm W x 201 mm H), with narrow width stainless steel wired bar lid	Orchid Scientific	Polycarbonate Rat Cage Type II	https://orchidscientific.com/product/rat-cage/ - 1519974600758-c29bc1c5-6dfa
Sigma Sport 509 Bike Computer	Sigma Sport		Does not need to be this model in particular, but must have distance and time monitoring capabilities
Silent Spinner Running Wheel (mini 11.4 cm)	Kaytee	SKU# 100079369	https://www.kaytee.com/all-products/small-animal/silent-spinner-wheel