Un modelo de rueda de correr simple y económico para el entrenamiento de resistencia progresiva en ratones

Resumen

Este procedimiento describe un modelo de entrenamiento de resistencia de rueda de marcha con carga progresiva traducible en ratones. La principal ventaja de este modelo de entrenamiento de resistencia es que es totalmente voluntario, lo que reduce el estrés de los animales y la carga sobre el investigador.

Resumen

Los modelos de ejercicio basados en la resistencia de roedores desarrollados anteriormente, que incluyen la ablación sinérgica, la estimulación eléctrica, la escalada de escaleras pesadas y, más recientemente, el tirón de trineo con peso, son altamente efectivos para proporcionar un estímulo hipertrófico para inducir adaptaciones del músculo esquelético. Si bien estos modelos han demostrado ser invaluables para la investigación del músculo esquelético, son invasivos o involuntarios y requieren mucha mano de obra. Afortunadamente, muchas cepas de roedores corren voluntariamente largas distancias cuando se les da acceso a una rueda para correr. Los modelos de carrera de rueda cargada (LWR) en roedores son capaces de inducir adaptaciones comúnmente observadas con el entrenamiento de resistencia en humanos, como el aumento de la masa muscular y la hipertrofia de fibras, así como la estimulación de la síntesis de proteínas musculares. Sin embargo, la adición de una carga moderada en la rueda no logra disuadir a los ratones de correr grandes distancias, lo que refleja más un modelo de entrenamiento de resistencia / resistencia, o los ratones dejan de correr casi por completo debido al método de aplicación de carga. Por lo tanto, se ha desarrollado un nuevo modelo de carrera de rueda de alta carga (HLWR) para ratones donde se aplica resistencia externa y se aumenta progresivamente, lo que permite a los ratones continuar corriendo con cargas mucho más altas que las utilizadas anteriormente. Los resultados preliminares de este nuevo modelo HLWR sugieren que proporciona suficiente estímulo para inducir adaptaciones hipertróficas durante el protocolo de entrenamiento de 9 semanas. En este documento, se describen los procedimientos específicos para ejecutar este modelo de entrenamiento de ejercicio basado en la resistencia progresiva simple pero económico en ratones.

Introducción

La masa muscular esquelética comprende aproximadamente el 40% de la masa corporal en humanos adultos; Por lo tanto, mantener la masa muscular esquelética durante toda la vida es fundamental. La masa muscular esquelética desempeña un papel integral en el metabolismo energético, el mantenimiento de la temperatura corporal central y la homeostasis de la glucosa¹. El mantenimiento del músculo esquelético es un equilibrio entre la síntesis de proteínas y la degradación de proteínas, pero todavía existen muchas lagunas en la comprensión de los intrincados mecanismos moleculares que impulsan estos procesos. Para estudiar los mecanismos moleculares que regulan el mantenimiento y crecimiento de la masa muscular, los modelos de investigación de sujetos humanos a menudo emplean intervenciones basadas en ejercicios de resistencia, ya que los estímulos mecánicos desempeñan un papel integral en la regulación de la masa muscular esquelética. Si bien la investigación con sujetos humanos ha sido exitosa, el tiempo necesario para exhibir adaptaciones y preocupaciones éticas con respecto a los procedimientos invasivos (es decir, biopsias musculares) limitan la cantidad de datos que se pueden obtener. Si bien las adaptaciones al ejercicio de resistencia son bastante ubicuas en todas las especies de mamíferos, los modelos animales brindan el beneficio de poder controlar con precisión la dieta y el régimen de ejercicio, al tiempo que permiten la recolección de tejidos completos en todo el cuerpo, como el cerebro, el hígado, el corazón y el músculo esquelético.

Se han desarrollado muchos modelos de entrenamiento de resistencia para su uso en roedores: ablación sinérgica², estimulación eléctrica^3,4, escalada de escalera ponderada^5, tirón de trineo ponderado⁶ y sentadilla en cuclillas⁷. Es evidente que todos estos modelos, si se hacen correctamente, pueden ser modelos efectivos para inducir adaptaciones del músculo esquelético, como la hipertrofia. Sin embargo, las desventajas de estos modelos son que en su mayoría son involuntarios, no forman parte del comportamiento normal de los roedores, requieren mucho tiempo / mano de obra e invasivos.

Afortunadamente, muchas cepas de ratones y ratas corren voluntariamente largas distancias cuando se les da acceso a una rueda para correr. Además, los modelos de ejercicios de rueda de carrera libre (FWR) no se basan en un acondicionamiento extensivo, refuerzo positivo / negativo o anestesia para forzar el movimiento o la actividad muscular ^8,9. La actividad de correr depende en gran medida de la tensión del ratón, el sexo, la edad y una base individual. Lightfoot et al. compararon la actividad de carrera de 15 cepas diferentes de ratones y encontraron que la distancia diaria de carrera varía de 2,93 km a 7,93 km, con ratones C57BL / 6 corriendo más lejos, independientemente del sexo¹⁰. La FWR es comúnmente aceptada como un excelente modelo para inducir adaptaciones de resistencia en músculos esqueléticos y cardíacos 11,12,13,14,15,16; Sin embargo, la utilización de la carrera de ruedas en modelos de entrenamiento de resistencia se investiga con menos frecuencia.

Como se podría sospechar, el efecto hipertrófico de la carrera de la rueda podría aumentarse agregando resistencia a la rueda de rodadura, denominada carrera de rueda cargada (LWR), lo que requiere mayores esfuerzos para correr en la rueda para imitar más de cerca el entrenamiento de resistencia. Utilizando diversos métodos de aplicación de carga, estudios previos han demostrado que el modelo LWR que utiliza ratas y ratones mostró rutinariamente aumentos en la masa muscular de las extremidades de 5% -30% en cuestión de 6-8 semanas 17,18,19,20,21. Además, D'hulst et al. demostraron que un solo ataque de LWR condujo a un aumento del 50% mayor en la activación de la vía de señalización de síntesis de proteínas en comparación con FWR²². La resistencia de la rueda se ha aplicado más comúnmente mediante un método de carga constante basado en la fricción, mediante el cual se utiliza un freno magnético o un perno de tensión para aplicar la resistencia de la rueda 12,19,23,24. Una advertencia del método de carga constante basado en la fricción es que cuando se aplica una resistencia moderada a alta, el animal no puede superar la alta resistencia para iniciar el movimiento de la rueda, cesando efectivamente el entrenamiento. Lo más importante es que muchos de los sistemas de jaulas y ruedas utilizados para los modelos de ruedas de rodadura de roedores son bastante costosos y requieren equipo especializado.

Recientemente, Dungan et al. desarrollaron un modelo de funcionamiento progresivo de rueda ponderada (PoWeR), que aplica una carga a la rueda asimétricamente a través de masas externas adheridas a un solo lado de la rueda. Se cree que la carga desequilibrada de la rueda y la resistencia variable del modelo PoWeR fomentan la actividad continua de carrera y promueven ráfagas más cortas de carrera de rueda cargada en ratones, imitando más de cerca las series y repeticiones realizadas con el entrenamiento de resistencia¹⁷. A pesar de que la distancia promedio de carrera es de 10-12 km por día, el modelo PoWeR produjo un aumento del 16% y 17% en la masa húmeda del músculo plantar y el área de sección transversal de fibra (CSA), respectivamente. A pesar de muchas ventajas prácticas, el modelo PoWeR de LWR tiene algunas limitaciones. Como reconocen los autores, el modelo PoWeR es un estímulo "híbrido" de alto volumen que refleja un modelo combinado de ejercicio de resistencia / resistencia (es decir, entrenamiento concurrente en humanos), en oposición a un modelo más estrictamente basado en ejercicios de resistencia, que potencialmente introduce un efecto de interferencia y contribuye a la hipertrofia menos pronunciada o diferentes mecanismos por los cuales se induce la hipertrofia²⁵ . Es imperativo garantizar que no ocurra un fenómeno de entrenamiento simultáneo en lo que se pretende que sea un modelo de entrenamiento de ejercicios de resistencia. Por lo tanto, el modelo PoWeR se modificó para desarrollar un modelo LWR que utiliza cargas más altas que las utilizadas anteriormente para parecerse más a un modelo de entrenamiento de resistencia. En este documento, se proporcionan detalles para un modelo LWR de entrenamiento de resistencia progresiva simple y económico de 9 semanas en ratones C57BL / 6.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de los Apalaches (# 22-05).

1. Animales

1. Adquirir ratones C57BL/6 de la colonia de ratones interna.
   NOTA: Se utilizaron ratones machos de 5-8 meses de edad al inicio del estudio. La actividad diaria de correr alcanza su punto máximo y se estabiliza alrededor de las 9-10 semanas de edad de²⁶ años. Estudios previos han demostrado que los ratones viejos (22-24 meses) también realizarán carreras de ruedas cargadas²⁷.
2. Aloje a los ratones individualmente en una jaula de roedores estándar con una tapa de alambre y mantenga la jaula en un ambiente controlado (20-24 ° C con un ciclo de luz: oscuridad de 12:12 h).
3. Proporcionar comida estándar para roedores y agua ad libitum.

2. Aparatos de rueda de rodadura

1. Configuración del volante:
   NOTA: Las ruedas de rodadura se ensamblan / configuran de manera similar para todos los protocolos de carrera, excepto para agregar imanes de carga de 1 g o 2.5 g.
   1. Pegue un solo imán sensor de 1 g a la circunferencia media exterior de la rueda de rodadura (Figura 1).
   2. Utilice esta rueda con un solo imán sensor de 1 g solo durante la primera semana de aclimatación de la rueda.
   3. Funcionamiento de la rueda cargada (LWR; protocolo de carga idéntico al PoWeR¹⁷): Siga los pasos 2.1.4-2.1.6.
   4. La semana 2 para LWR requiere 2 g de carga (ver Tabla 1).
   5. Pegue dos imanes de 1 g uno al lado del otro en la circunferencia exterior de la rueda (Figura 2A).
      NOTA: Aquí, es útil usar cinta adhesiva para mantener los imanes en su lugar hasta que el pegamento se seque firmemente; De lo contrario, pueden ser atraídos por el imán del sensor y desprenderse.
   6. Aplique carga adicional en las semanas 3, 4 y 6 colocando otro imán de 1 g encima de cualquiera de los imanes ya presentes.
      NOTA: No se necesita pegamento ya que los imanes se adhieren firmemente entre sí. Por ejemplo, con 6 g de carga en la semana 6, los imanes se apilarán cada uno a tres alturas (Figura 2B).
   7. Funcionamiento de ruedas de alta carga (HLWR): Siga los pasos 2.1.8-2.1.11.
      NOTA: El protocolo HLWR requiere tres juegos de ruedas. El ensamblaje de diferentes juegos de ruedas permite al investigador reutilizar las configuraciones de ruedas para otros ratones una vez que la rueda se limpia y desinfecta a fondo (el investigador debe determinar los números de cada juego según el tamaño de la cohorte / grupo).
   8. El primer juego de ruedas (requerido solo para la semana 2) tendrá un solo imán de 2.5 g; pegar (consulte la NOTA a continuación Paso 2.1.5) un imán de 2,5 g en la circunferencia exterior de la rueda (Figura 3A).
   9. El segundo juego de ruedas (requerido solo para la semana 3) tendrá dos imanes de 2.5 g; pega (consulte la NOTA a continuación Paso 2.1.5) dos imanes de 2,5 g uno al lado del otro en la circunferencia exterior de la rueda (Figura 3B).
   10. El tercer juego de ruedas (requerido para la semana 4 y posteriores) tendrá tres imanes de 2,5 g uno al lado del otro; pegamento (consulte la NOTA a continuación Paso 2.1.5) tres imanes de 2,5 g uno al lado del otro en la circunferencia exterior de la rueda (Figura 3C).
   11. Aplique carga adicional durante las semanas 6 y 8 colocando otro imán de 2,5 g encima de cualquiera de los imanes ya presentes (Figuras 3D, E).

Figura 1: Rueda de rodadura básica con un solo imán sensor de 1 g pegado a la circunferencia exterior media de la rueda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Rueda de rodadura cargada (LWR) con imán sensor e imanes de carga de 1 g. (A) Ejemplo de 2 g de carga, dos imanes de 1 g pegados uno al lado del otro al borde exterior de la rueda; (B) ejemplo de 6 g de carga, dos imanes de 1 g pegados uno al lado del otro al borde exterior de la rueda con 4 g adicionales de carga aplicada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Rueda de rodadura de alta carga (HLWR) con imán sensor e imanes de carga de 2,5 g. (A) ejemplo de 2,5 g de carga, un imán de 2,5 g pegado al borde exterior de la rueda; (B) ejemplo de 5 g de carga, dos imanes de 2,5 g pegados uno al lado del otro al borde exterior de la rueda; (C) ejemplo de 7,5 g de carga, tres imanes de 2,5 g pegados uno al lado del otro al borde exterior de la rueda; (D) ejemplo de 10 g de carga, tres imanes de 2,5 g pegados uno al lado del otro al borde exterior de la rueda, con 2,5 g adicionales de carga aplicada; (E) ejemplo de 12,5 g de carga, tres imanes de 2,5 g pegados uno al lado del otro al borde exterior de la rueda, con 5 g adicionales de carga aplicados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Montaje de la jaula

1. Ensamble las ruedas para correr usando una jaula equipada con una computadora digital para bicicletas para monitorear el tiempo de ejercicio (h) y la distancia recorrida (km). La velocidad media (km/h) se deriva aritméticamente.
   1. Asegúrese de que se inserte una batería nueva en el ciclocomputador antes del montaje.
   2. Ajuste el tamaño de la rueda durante la programación inicial de la computadora para bicicletas (consulte las instrucciones del fabricante); Calcule la distancia por revolución midiendo la circunferencia exterior de la rueda de rodadura (por ejemplo, 3.580 mm para el tipo de rueda utilizado en este documento).
2. Coloque el sensor del ordenador de la bicicleta dentro de una superficie sólida en el exterior de la tapa del armazón, directamente encima de donde se encuentra el imán del sensor de la rueda. Asegúrese de que todos los componentes de la computadora y el sensor estén contenidos dentro de una barrera sólida fuera de la jaula para evitar que los ratones mastiquen los componentes.
   1. Utilice la tapa de una caja de punta de pipeta vacía con un pequeño rectángulo recortado para que resida el sensor magnético de la bicicleta, y la parte principal de la caja (con la rejilla del portapropinas retirada) para sostener la computadora para bicicletas y el cable (Figura 4A).
   2. Perfore dos orificios a través de las esquinas de la superficie sólida para asegurar el sensor magnético de la bicicleta y el soporte de la rueda en su lugar en el exterior de la jaula (Figura 4A).
3. Inserte la distancia entre ejes de rodadura, boca abajo, a través de los huecos de la tapa de la jaula, pero encima de la superficie sólida descrita en el paso 3.2 (figura 4B).
   1. Asegure la distancia entre ejes y el sensor de la computadora a la parte superior de la jaula con hardware (Figura 4C, D).
4. Asegúrese de que el imán del sensor y el sensor de la computadora estén separados no más de 1 cm para permitir el registro adecuado del movimiento de la rueda (la mayoría de los sensores estándar de la computadora para bicicletas son bidireccionales y registrarán el movimiento positivo de la rueda en cualquier dirección de rotación).
5. Fije la rueda de rodadura adecuada (como se describió anteriormente) a la distancia entre ejes desde el interior de la tapa de la jaula y coloque firmemente la tapa en la jaula (Figura 4E, F).
6. Con la rueda colgando de la tapa de la jaula, asegúrese de que al menos 2,5 cm de espacio libre del suelo de la jaula. Coloque una cantidad mínima de material de cama en la jaula para asegurarse de que la rueda gire libremente pero no se vea obstaculizada por la acumulación de ropa de cama.
7. Durante la experimentación, registre los datos de la computadora de la bicicleta en un horario de intervalos constante para garantizar un monitoreo preciso de la actividad.
   1. Reconocer que los ratones son una especie nocturna; Por lo tanto, la mayor parte de su actividad natural en jaula (incluido el funcionamiento de la rueda) se realizará durante las horas oscuras del ciclo de luz.

Figura 4: Montaje de la jaula de la rueda de rodadura. (A) Computadora para bicicleta y sensor magnético colocado en superficie sólida / bandeja; (B) distancia entre ejes invertida colocada encima de la superficie sólida/bandeja y el sensor (vista superior; tenga en cuenta los dos orificios en la superficie/bandeja del sensor para asegurar la base a la tapa de la jaula con hardware), (C) distancia entre ejes invertida con hardware ensamblado (vista inferior); (D) distancia entre ejes invertida con hardware ensamblado (vista superior); (E) conjunto de jaula completa (vista superior); y (F) conjunto de jaula completa (vista lateral). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Protocolos de carga de entrenamiento físico

1. Aloje individualmente ratones sedentarios (SED) durante 9 semanas en una jaula que contiene una rueda de correr bloqueada para evitar correr.
   NOTA: La Tabla 1 proporciona el programa de carga para los protocolos LWR (PoWeR) y HLWR utilizados en el diseño experimental.
2. Reduzca la carga para los grupos LWR y HLWR, si es necesario, para garantizar que los ratones continúen haciendo ejercicio durante todo el protocolo de 9 semanas.

		Semana
		1	2	3	4	5	6	7	8	9
LWR (n = 4)	Carga (g)	0.0	2.0	3.0	4.0	5.0	5.0	6.0	6.0	6.0
	%BM	--	8%	11%	15%	19%	19%	23%	23%	23%
HLWR (n =7)	Carga (g)	0.0	2.5	5.0	7.5	7.5	10.0	10.0	12.5	12.5
	%BM	--	10%	19%	28%	28%	38%	38%	48%	48%

Tabla 1. Protocolos de funcionamiento de ruedas cargadas

5. Pruebas de función muscular in situ , recolección de tejidos y análisis de tejidos

1. Después de la intervención de entrenamiento de 9 semanas, anestesiar a los ratones usando isoflurano inhalado (4% de inducción; 2% de mantenimiento) con oxígeno suplementario, y asegurar un monitoreo adecuado del plano anestésico durante todo el procedimiento.
2. Realizar una prueba de función muscular in situ en el complejo gastrocnemio, plantaris, sóleo (GPS) para probar la fuerza muscular isométrica²⁸. Establecer una curva fuerza-frecuencia estimulando directamente el nervio ciático con agujas de electrodos 27 G a 11 frecuencias ascendentes entre 1-300 Hz, con contracciones tetánicas que ocurren alrededor de 100-150 hz²⁹.
3. Inmediatamente después de la prueba de función muscular, eutanasia a los ratones a través de la dislocación cervical y confirme la eutanasia mediante la extirpación del corazón. Extirpe cuidadosamente los músculos plantaris y sóleo y registre la masa de tejido húmedo.
4. Cubra cada muestra muscular en un medio de incrustación (OCT) y móntela en un corcho. Congélelo en isopentano líquido refrigerado por nitrógeno y guárdelo a -80 °C hasta que se realice un análisis inmunohistoquímico adicional (IHC) en secciones de tejido muscular (10 μm de espesor).
5. Analizar la CSA de la fibra muscular utilizando inmunofluorescencia para laminina. Mida CSA de fibra utilizando una plataforma automática de cuantificación de imágenes³⁰.

6. Análisis estadístico

1. Exprese todos los datos como media ± SD.
2. Realizar análisis estadísticos utilizando software de análisis estadístico con significación establecida en p ≤ 0,05.
3. Compare los datos de carrera de rueda y volumen de entrenamiento con ANOVA bidireccional de medidas repetidas.
4. Compare la masa corporal, la masa tisular, la CSA y la función muscular con un ANOVA unidireccional. Si se encuentran ratios F significativos, comparar las diferencias dentro del grupo utilizando análisis post hoc de Fisher LSD.
5. Calcule los tamaños de efecto y, a continuación, interprete como 0,01, 0,06 y 0,14 para tamaños de efecto pequeño, mediano y grande, respectivamente.

Resultados

En este estudio, 24 ratones C57BL / 6 (6.3 ± 0.7 meses al inicio de este estudio) fueron asignados aleatoriamente a uno de tres grupos de tratamiento: sedentario (SED), carrera de rueda cargada (LWR; igual que PoWeR descrito por Dungan et ^al.17) o LWR alto (HLWR), y luego completaron su respectivo protocolo de 9 semanas. Después de la semana de aclimatación (semana 1), no hubo diferencias de grupo o grupo x tiempo en la distancia de carrera o el volumen de entrenamiento (Fi...

Discusión

Los modelos de ejercicios de resistencia existentes en roedores han demostrado ser invaluables para la investigación del músculo esquelético; Sin embargo, muchos de estos modelos son invasivos, involuntarios y/o requieren mucho tiempo y mano de obra. LWR es un modelo excelente que no solo induce adaptaciones musculares similares a las observadas en otros modelos de entrenamiento de ejercicios de resistencia bien aceptados, sino que también proporciona un estímulo de ejercicio crónico y de bajo estrés para el anima...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 g disc neodymium magnets	Applied Magnets	ND018-6	Used for all sensor magnets and 1 g increments of wheel loading
2.5 g disc neodymium magnets	Applied Magnets	ND022	Used for 2.5 g increments of wheel loading
8-32 x 1" stainless steel screws	Amazon		https://www.amazon.com/gp/product/B07939RS23/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
8-32 Wing Nuts	Amazon		https://www.amazon.com/gp/product/B07YYWW2SB/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1
10 µL pipette tip box (empty)	Thermo Scientific	2140	We used empty ART Pipette tip boxes, but any similar sized boxes/trays would suffice
Extreme Liquid Glue	Loctite
Laminin primary antibody	Novus Biologicals	NB300-144AF647	primary antibody conjugated with AF657; 1:200 in PBS containing 10% normal goat serum
Lithium 3 V battery	n/a	CR2032
M10 (3/16" x 1 1/4") stainless steel fender washers	Amazon		https://www.amazon.com/gp/product/B00OHUHEU8/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1
MyoVision: Automated Image Quantification Platform	Wen et al. (2017)	v1.0	https://www.uky.edu/chs/center-for-muscle-biology/myovision
Polycarbonate rodent cage (430 mm L x 290 mm W x 201 mm H), with narrow width stainless steel wired bar lid	Orchid Scientific	Polycarbonate Rat Cage Type II	https://orchidscientific.com/product/rat-cage/ - 1519974600758-c29bc1c5-6dfa
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