마우스의 점진적 저항 훈련을 위한 간단하고 저렴한 러닝 휠 모델

요약

이 절차는 마우스에서 번역 가능한 프로그레시브 로드 러닝 휠 저항 훈련 모델을 설명합니다. 이 저항 훈련 모델의 주요 장점은 전적으로 자발적이므로 동물의 스트레스와 연구원의 부담을 줄인다는 것입니다.

초록

시너지 절제, 전기 자극, 가중 사다리 등반, 그리고 가장 최근에는 가중 썰매 당기기를 포함하여 이전에 개발 된 설치류 저항 기반 운동 모델은 골격근 적응을 유도하는 비대 자극을 제공하는 데 매우 효과적입니다. 이러한 모델은 골격근 연구에 매우 중요한 것으로 입증되었지만 침습적이거나 비자발적이며 노동 집약적입니다. 다행히도 많은 설치류 균주는 달리는 바퀴에 접근 할 수있을 때 자발적으로 장거리를 달립니다. 설치류의 로드 휠 러닝(LWR) 모델은 근육량 증가 및 섬유 비대, 근육 단백질 합성 자극과 같은 인간의 저항 훈련에서 일반적으로 관찰되는 적응을 유도할 수 있습니다. 그러나 적당한 휠 하중을 추가하면 마우스가 먼 거리를 달리는 것을 막지 못하거나 지구력 / 저항 훈련 모델을 더 잘 반영하거나 마우스가 하중 적용 방법으로 인해 거의 완전히 달리기를 중단합니다. 따라서 외부 저항이 적용되고 점진적으로 증가하는 마우스를 위해 새로운 고하중 휠 주행 모델(HLWR)이 개발되어 마우스가 이전에 활용된 것보다 훨씬 더 높은 하중으로 계속 달릴 수 있습니다. 이 새로운 HLWR 모델의 예비 결과는 9 주 훈련 프로토콜 동안 비대 적응을 유도하기에 충분한 자극을 제공한다는 것을 시사합니다. 본 명세서에서는 마우스에서 간단하면서도 저렴한 점진적 저항 기반 운동 훈련 모델을 실행하기 위한 구체적인 절차가 설명된다.

서문

골격근 질량은 성인 인간의 체질량의 약 40 %를 차지합니다. 따라서 평생 동안 골격근을 유지하는 것이 중요합니다. 골격근 질량은 에너지 대사, 심부 체온 유지 및 포도당 항상성¹에 필수적인 역할을 합니다. 골격근의 유지는 단백질 합성과 단백질 분해 사이의 균형이지만 이러한 과정을 주도하는 복잡한 분자 메커니즘에 대한 이해에는 여전히 많은 격차가 존재합니다. 근육량의 유지와 성장을 조절하는 분자 메커니즘을 연구하기 위해 인간 피험자의 연구 모델은 기계적 자극이 골격근 질량 조절에 필수적인 역할을하기 때문에 종종 저항 운동 기반 개입을 사용합니다. 인간 피험자 연구는 성공적이었지만 침습적 절차(즉, 근육 생검)에 대한 적응 및 윤리적 문제를 나타내는 데 필요한 시간은 얻을 수 있는 데이터의 양을 제한합니다. 저항 운동에 대한 적응은 포유류 종에 걸쳐 상당히 유비쿼터스이지만, 동물 모델은식이 요법과 운동 요법을 정확하게 제어 할 수있는 이점을 제공하는 동시에 뇌, 간, 심장 및 골격근과 같은 몸 전체의 전체 조직을 수집 할 수 있습니다.

설치류에 사용하기 위해 많은 저항 훈련 모델이 개발되었습니다 : 상승 적 절제², 전기 자극^3,4, 가중 사다리 등반^5, 가중 썰매 당기기⁶ 및 캔버스 쪼그리고 앉기⁷. 이러한 모든 모델이 올바르게 수행되면 비대와 같은 골격근 적응을 유도하는 효과적인 모델이 될 수 있음이 분명합니다. 그러나 이러한 모델의 단점은 대부분 비자발적이며 정상적인 설치류 행동의 일부가 아니며 시간 / 노동 집약적이며 침습적이라는 것입니다.

다행히도 많은 마우스와 쥐 균주는 달리는 바퀴에 접근 할 수있을 때 자발적으로 장거리를 달립니다. 또한, 자유 달리기 휠 (FWR) 운동 모델은 운동이나 근육 활동을 강요하기 위해 광범위한 컨디셔닝, 긍정적 / 부정적 강화 또는 마취에 의존하지 않습니다 ^8,9. 달리기 활동은 마우스 긴장, 성별, 연령 및 개인에 따라 크게 달라집니다. Lightfoot et al. 15 개의 다른 마우스 균주의 달리기 활동을 비교 한 결과 일일 달리기 거리는 2.93km에서 7.93km 사이이며 C57BL / 6 마우스는 성별에 관계없이 가장 멀리 달리는 것으로 나타났습니다¹⁰. FWR은 일반적으로 골격 및 심장 근육에서 지구력 적응을 유도하기위한 우수한 모델로 받아 들여집니다 11,12,13,14,15,16; 그러나 저항 훈련 모델에서 휠 러닝을 활용하는 것은 덜 일반적으로 조사됩니다.

의심할 수 있듯이, 휠 러닝의 비대 효과는 로드 휠 러닝(LWR)이라고 하는 러닝 휠에 저항을 추가하여 증가할 수 있으므로 저항 훈련을 보다 가깝게 모방하기 위해 휠에서 달리는 데 더 많은 노력이 필요합니다. 다양한 하중 적용 방법을 사용하여 이전 연구에서는 쥐와 생쥐를 활용한 LWR 모델이 일상적으로 5-30주 만에 6%-8%의 사지 근육량 증가를 나타냄을 보여주었습니다 17,18,19,20,21. 또한, D'hulst 등은 LWR의 단일 시합이 FWR²²에 비해 단백질 합성 신호 전달 경로의 활성화를 50% 더 크게 증가시킨다는 것을 입증했습니다. 휠 저항은 마찰 기반의 일정한 하중 방법에 의해 가장 일반적으로 적용되었으며, 이에 따라 마그네틱 브레이크 또는 텐션 볼트를 사용하여 휠 저항 12,19,23,24를 적용합니다. 마찰 기반의 일정한 하중 방법의 한 가지주의 사항은 중간에서 높은 저항이 적용될 때 동물이 높은 저항을 극복하여 바퀴의 움직임을 시작할 수 없어 효과적으로 훈련을 중단한다는 것입니다. 가장 중요한 것은 설치류 주행 휠 모델에 사용되는 많은 케이지 및 휠 시스템이 비용이 많이 들고 특수 장비가 필요하다는 것입니다.

최근 Dungan 등은 휠의 한 측면에 부착 된 외부 질량을 통해 비대칭 적으로 휠에 하중을 가하는 점진적 가중 휠 러닝 (PoWeR) 모델을 개발했습니다. PoWeR 모델의 불균형 휠 하중 및 가변 저항은 지속적인 달리기 활동을 장려하고 마우스에서 적재 된 휠 달리기의 더 짧은 파열을 촉진하여 저항 훈련¹⁷로 수행 된 세트 및 반복을보다 밀접하게 모방하는 것으로 생각됩니다. 평균 달리기 거리가 하루 10-12km임에도 불구하고 PoWeR 모델은 발바닥근 습윤 질량과 섬유 단면적(CSA)이 각각 16% 및 17% 증가했습니다. 많은 실용적인 이점에도 불구하고 LWR의 PoWeR 모델에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 저자가 인식한 바와 같이, PoWeR 모델은 보다 엄격한 저항 운동 기반 모델과 달리 혼합된 지구력/저항 운동 모델(즉, 인간에 대한 동시 훈련)을 반영하는 대용량 "하이브리드" 자극으로, 잠재적으로 간섭 효과를 도입하고 덜 뚜렷한 비대 또는 비대가 유도되는 다른 메커니즘에 기여합니다.²⁵ . 저항 운동 훈련 모델로 의도 된 것에서 동시 훈련 현상이 발생하지 않도록하는 것이 필수적입니다. 따라서 PoWeR 모델은 저항 훈련 모델과 더 유사하게 이전에 사용된 것보다 더 높은 부하를 활용하는 LWR 모델을 개발하도록 수정되었습니다. 본원에서, C57BL/6 마우스에서의 간단하고 저렴한 9주 진행적 저항 훈련 LWR 모델에 대한 세부사항이 제공된다.

프로토콜

이 연구는 애팔래치아 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(#22-05)의 승인을 받았습니다.

1. 동물

1. 사내 마우스 콜로니에서 C57BL/6 마우스를 조달합니다.
   참고: 연구 시작 시 5-8개월령의 수컷 마우스를 사용했습니다. 일일 달리기 활동은²⁶세에 약 9-10주에 최고조에 달하고 정체됩니다. 이전 연구에 따르면 늙은 쥐 (22-24 개월)도로드 된 휠 러닝²⁷을 수행 할 것입니다.
2. 철사 뚜껑이 있는 표준 설치류 케이지에 마우스를 개별적으로 수용하고 케이지를 통제된 환경(20:24 h 빛:어두운 주기로 12-12 °C)에 보관하십시오.
3. 표준 설치류 차우 와 물을 자유롭게 제공하십시오.

2. 러닝 휠 장치

1. 러닝 휠 설정:
   알림: 러닝 휠은 1g 또는 2.5g 하중 자석을 추가하는 것을 제외하고 모든 실행 프로토콜에 대해 유사하게 조립/설정됩니다.
   1. 단일 1g 센서 자석을 주행 휠의 바깥쪽 중간 둘레에 붙입니다(그림 1).
   2. 이 휠을 단일 1g 센서 자석과 함께 사용하여 휠 적응 첫 주 동안만 사용하십시오.
   3. 로드된 휠 실행(LWR, PoWeR¹⁷과 동일한 로딩 프로토콜): 2.1.4-2.1.6단계를 따릅니다.
   4. LWR의 2주차에는 2g의 부하가 필요합니다(표 1 참조).
   5. 두 개의 1g 자석을 휠의 외부 원주에 나란히 붙입니다(그림 2A).
      알림: 여기에서는 접착제가 단단히 마를 때까지 테이프를 사용하여 자석을 제자리에 고정하는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 센서 자석에 끌려 빠질 수 있습니다.
   6. 이미 존재하는 자석 중 하나 위에 다른 1g 자석을 놓아 3, 4, 6주에 추가 하중을 가합니다.
      알림: 자석이 서로 단단히 부착되므로 접착제가 필요하지 않습니다. 예를 들어, 6주차에 6g의 하중이 가해지면 자석은 각각 3개 높이로 쌓이게 됩니다(그림 2B).
   7. 고부하 휠 러닝(HLWR): 2.1.8-2.1.11단계를 따릅니다.
      알림: HLWR 프로토콜에는 세 세트의 휠이 필요합니다. 다른 바퀴 세트를 조립하면 연구자가 바퀴를 철저히 청소하고 소독하면 다른 마우스의 바퀴 설정을 재사용할 수 있습니다(각 세트의 수는 코호트/그룹 크기에 따라 연구원이 결정해야 함).
   8. 첫 번째 휠 세트(2주차에만 필요)에는 단일 2.5g 자석이 있습니다. 접착제(아래 참고 사항 참조) 2.5g 자석을 휠의 외부 둘레에 꽂습니다(그림 3A).
   9. 두 번째 휠 세트(3주차에만 필요)에는 2.5g 자석 2개가 있습니다. 접착제(아래 참고 사항 참조) 2.5g 자석 2개를 휠의 바깥쪽 둘레에 나란히 놓습니다(그림 3B).
   10. 세 번째 휠 세트(4주차 이상에 필요)에는 3개의 2.5g 자석이 나란히 있습니다. 접착제(아래 참고 사항 참조) 2.5g 자석 3개를 휠의 외주에 나란히 놓습니다(그림 3C).
   11. 이미 존재하는 자석 중 하나 위에 다른 2.5g 자석을 놓아 6주와 8주에 추가 하중을 가합니다(그림 3D, E).

그림 1: 휠의 중간 외주에 단일 1g 센서 자석이 접착된 기본 러닝 휠. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 센서 자석과 1g 하중 자석이 있는 적재 러닝 휠(LWR). (A) 2g의 하중의 예, 휠의 바깥쪽 가장자리에 나란히 접착된 2개의 1g 자석; (B) 6g의 하중의 예, 2개의 1g 자석이 추가로 4g의 하중이 가해진 상태에서 휠의 바깥쪽 가장자리에 나란히 접착됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 센서 자석과 2.5g 하중 자석이 있는 고하중 주행 휠(HLWR). (A) 2.5g 하중의 예, 휠의 바깥쪽 가장자리에 접착된 2.5g 자석 1개; (b) 5g의 하중의 예, 휠의 바깥쪽 가장자리에 나란히 접착된 2개의 2.5g 자석; (c) 7.5g의 하중, 휠의 바깥쪽 가장자리에 나란히 접착된 3개의 2.5g 자석의 예; (D) 10g의 하중, 3개의 2.5g 자석이 휠의 바깥쪽 가장자리에 나란히 접착되고 추가로 2.5g의 하중이 가해지는 예; (E) 12.5g의 하중의 예, 3개의 2.5g 자석이 휠의 바깥쪽 가장자리에 나란히 접착되고 추가로 5g의 하중이 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 케이지 조립

1. 디지털 자전거 컴퓨터가 장착된 케이지를 사용하여 러닝 휠을 조립하여 운동 시간(h)과 이동 거리(km)를 모니터링합니다. 평균 속도(km/h)는 산술적으로 파생됩니다.
   1. 조립하기 전에 새 배터리가 자전거 컴퓨터에 삽입되었는지 확인하십시오.
   2. 초기 자전거 컴퓨터 프로그래밍 중에 휠 크기를 설정하십시오 (제조업체 지침 참조). 주행 휠의 외주를 측정함으로써 회전 당 거리를 계산한다(예를 들어, 본 명세서에서 사용되는 휠 타입의 경우 3,580mm).
2. 자전거 컴퓨터 센서를 케이지 덮개 외부의 단단한 표면, 바퀴의 센서 자석이 있는 위치 바로 위에 놓습니다. 모든 컴퓨터 및 센서 구성 요소가 케이지 외부의 단단한 장벽 내에 포함되어 있는지 확인하여 마우스가 구성 요소를 씹지 않도록하십시오.
   1. 마그네틱 자전거 센서가 상주할 수 있도록 작은 직사각형이 잘린 빈 피펫 팁 상자의 뚜껑과 상자의 주요 부분(팁 랙 그리드가 제거된 상태)을 활용하여 자전거 컴퓨터와 와이어를 고정합니다(그림 4A).
   2. 단단한 표면의 모서리에 두 개의 구멍을 뚫어 마그네틱 자전거 센서와 러닝 휠 스탠드를 케이지 외부의 제자리에 고정합니다(그림 4A).
3. 케이지 뚜껑의 틈새를 통해 러닝 휠 베이스를 거꾸로 삽입하되 3.2단계에서 설명한 단단한 표면 위에 삽입합니다(그림 4B).
   1. 휠 베이스와 컴퓨터 센서를 하드웨어로 케이지 상단에 고정합니다(그림 4C, D).
4. 바퀴 움직임을 적절하게 기록할 수 있도록 센서 자석과 컴퓨터 센서가 1cm 이상 떨어져 있지 않은지 확인하십시오(대부분의 표준 자전거 컴퓨터 센서는 양방향이며 양쪽 회전 방향에서 양의 바퀴 움직임을 기록합니다).
5. 케이지 덮개 내부에서 휠베이스에 적절한 주행 휠 (위에서 설명한대로)을 부착하고 덮개를 케이지에 단단히 놓습니다 (그림 4E, F).
6. 휠을 케이지 뚜껑에 매달아 케이지 바닥에서 최소 2.5cm의 간격을 두십시오. 케이지에 최소한의 침구 재료를 넣어 바퀴가 자유롭게 회전하지만 침구가 쌓여서 방해받지 않도록하십시오.
7. 실험 중에 정확한 활동 모니터링을 보장하기 위해 일관된 간격 일정으로 자전거 컴퓨터의 데이터를 기록하십시오.
   1. 생쥐는 야행성 종이라는 것을 인식하십시오. 따라서 대부분의 자연 케이지 활동 (휠 러닝 포함)은 빛주기의 어두운 시간 동안 수행됩니다.

그림 4: 러닝 휠 케이지 어셈블리. (A) 단단한 표면/트레이에 놓인 자전거 컴퓨터 및 자기 센서; (B) 단단한 표면/트레이 및 센서 상단에 배치된 거꾸로 된 휠 베이스(평면도, 하드웨어로 베이스를 케이지 리드에 고정하기 위한 센서 표면/트레이의 두 구멍 참고), (C) 하드웨어가 조립된 거꾸로 된 휠 베이스(하단 뷰); (D) 하드웨어가 조립된 역 휠 베이스(평면도); (E) 전체 케이지 조립체 (평면도); 및 (F) 전체 케이지 어셈블리 (측면도). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 운동 훈련 로딩 프로토콜

1. 개별적으로 앉아있는(SED) 마우스를 임의의 달리기를 방지하기 위해 잠긴 달리기 바퀴를 함유하는 케이지에 9주 동안 집한다.
   참고: 표 1은 실험 설계에 사용된 LWR(PoWeR) 및 HLWR 프로토콜에 대한 로드 일정을 제공합니다.
2. 필요한 경우 LWR 및 HLWR 그룹에 대한 부하를 줄여 마우스가 전체 9주 프로토콜 동안 계속 운동할 수 있도록 합니다.

		주
		1	2	3	4	5	6	7	8	9
LWR (n = 4)	하중 (g)	0.0	2.0	3.0	4.0	5.0	5.0	6.0	6.0	6.0
	%BM	--	8%	11%	15%	19%	19%	23%	23%	23%
HLWR (n = 7)	하중 (g)	0.0	2.5	5.0	7.5	7.5	10.0	10.0	12.5	12.5
	%BM	--	10%	19%	28%	28%	38%	38%	48%	48%

표 1. 로드된 휠 실행 프로토콜

5. 현장 근육 기능 테스트, 조직 수확 및 조직 분석

1. 9주간의 훈련 중재 후, 흡입된 이소플루란(4% 유도, 2% 유지)을 사용하여 마우스를 보충 산소로 마취시키고 절차 전반에 걸쳐 적절한 마취 평면 모니터링을 보장합니다.
2. 등척성 근력을 테스트하기 위해 비복근, 족저근, 솔레우스(GPS) 복합체에 대한 현장 근육 기능 테스트를 수행합니다²⁸. 1-300Hz 사이의 11개의 오름차순 주파수에서 27G 전극 바늘로 좌골 신경을 직접 자극하여 힘-주파수 곡선을 설정하고 파상풍 수축은 약 100-150hz²⁹에서 발생합니다.
3. 근육 기능 검사 직후 자궁 경부 탈구를 통해 마우스를 안락사시키고 심장을 제거하여 안락사를 확인합니다. 발바닥과 솔레 우스 근육을 조심스럽게 절제하고 젖은 조직 덩어리를 기록하십시오.
4. 각 근육 샘플을 매립 매체(OCT)에 코팅하고 코르크에 장착합니다. 액체 질소 냉각 이소 펜탄에 동결시키고 근육 조직 섹션 (80μm 두께)에 대해 추가 면역 조직 화학 (IHC) 분석이 수행 될 때까지 -10 ° C에서 보관하십시오.
5. 라미닌에 대한 면역 형광법을 사용하여 근육 섬유 CSA를 분석합니다. 자동 이미지 정량화 플랫폼(³⁰)을 사용하여 광섬유 CSA를 측정합니다.

6. 통계 분석

1. 모든 데이터를 SD± 평균으로 표현합니다.
2. 유의성이 p ≤ 0.05로 설정된 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
3. 휠 달리기 및 훈련 볼륨 데이터를 반복 측정 양방향 분산 분석과 비교합니다.
4. 체질량, 조직 질량, CSA 및 근육 기능을 일원 분산 분석과 비교합니다. 유의한 F-비율이 발견되면 Fisher LSD 사후 분석을 사용하여 그룹 내 차이를 비교합니다.
5. 효과 크기를 계산한 다음 소형, 중형 및 대형 효과 크기에 대해 각각 0.01, 0.06 및 0.14로 해석합니다.

결과

이 연구에서, 24마리의 C57BL/6 마우스(이 연구 시작 시 6.3 ± 0.7개월)를 좌식(SED), 로드휠 러닝(LWR; Dungan et ^al.17에 의해 기술된 PoWeR과 동일) 또는 높은 LWR(HLWR)의 세 가지 치료 그룹 중 하나에 무작위로 할당한 다음, 각각의 9주 프로토콜을 완료했습니다. 적응 주(1주차) 이후에는 달리기 거리 또는 훈련량에 그룹 또는 그룹 x 시간 차이가 없었습니다(그림 5).

토론

설치류의 기존 저항 운동 모델은 골격근 연구에 매우 귀중한 것으로 입증되었습니다. 그러나 이러한 모델 중 상당수는 침습적, 비자발적 및/또는 시간 및 노동 집약적입니다. LWR은 잘 받아 들여지는 다른 저항 운동 훈련 모델에서 관찰 된 것과 유사한 근육 적응을 유도 할뿐만 아니라 연구자의 최소한의 시간 / 노동 투입으로 동물에게 만성적이고 스트레스가 적은 운동 자극을 제공하는 우수한 모?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 g disc neodymium magnets	Applied Magnets	ND018-6	Used for all sensor magnets and 1 g increments of wheel loading
2.5 g disc neodymium magnets	Applied Magnets	ND022	Used for 2.5 g increments of wheel loading
8-32 x 1" stainless steel screws	Amazon		https://www.amazon.com/gp/product/B07939RS23/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
8-32 Wing Nuts	Amazon		https://www.amazon.com/gp/product/B07YYWW2SB/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1
10 µL pipette tip box (empty)	Thermo Scientific	2140	We used empty ART Pipette tip boxes, but any similar sized boxes/trays would suffice
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Laminin primary antibody	Novus Biologicals	NB300-144AF647	primary antibody conjugated with AF657; 1:200 in PBS containing 10% normal goat serum
Lithium 3 V battery	n/a	CR2032
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