Простая и недорогая модель бегового колеса для прогрессивной тренировки с отягощениями у мышей

Резюме

Эта процедура описывает переводимую модель тренировки сопротивления бегового колеса с прогрессивной нагрузкой на мышах. Основным преимуществом этой модели тренировок с отягощениями является то, что она полностью добровольная, что снижает стресс для животных и нагрузку на исследователя.

Аннотация

Ранее разработанные модели упражнений, основанные на сопротивлении грызунов, включая синергетическую абляцию, электрическую стимуляцию, подъем по лестнице с весом и совсем недавно вытягивание саней с утяжеленным весом, очень эффективны в обеспечении гипертрофического стимула для индуцирования адаптации скелетных мышц. Хотя эти модели оказались бесценными для исследований скелетных мышц, они являются либо инвазивными, либо непроизвольными и трудоемкими. К счастью, многие штаммы грызунов добровольно бегут на большие расстояния, когда им предоставляется доступ к беговому колесу. Модели нагруженного колесного бега (LWR) у грызунов способны вызывать адаптации, обычно наблюдаемые при тренировках с отягощениями у людей, такие как увеличение мышечной массы и гипертрофия волокон, а также стимуляция синтеза мышечного белка. Тем не менее, добавление умеренной нагрузки на колеса либо не может удержать мышей от бега на большие расстояния, что больше отражает модель тренировки выносливости / сопротивления, либо мыши прекращают бег почти полностью из-за метода применения нагрузки. Поэтому для мышей, где применяется внешнее сопротивление и постепенно увеличивается, была разработана новая модель работы с высоконагруженным колесом (HLWR), позволяющая мышам продолжать работать с гораздо более высокими нагрузками, чем ранее. Предварительные результаты этой новой модели HLWR показывают, что она обеспечивает достаточный стимул для индуцирования гипертрофических адаптаций в течение 9-недельного протокола обучения. Здесь описываются конкретные процедуры для выполнения этой простой, но недорогой прогрессивной модели тренировок на основе сопротивления на мышах.

Введение

Масса скелетных мышц составляет примерно 40% массы тела у взрослых людей; таким образом, поддержание массы скелетных мышц на протяжении всей жизни имеет решающее значение. Скелетная мышечная масса играет неотъемлемую роль в энергетическом обмене, поддержании температуры тела и глюкозного гомеостаза¹. Поддержание скелетных мышц представляет собой баланс между синтезом белка и деградацией белка, но все еще существует много пробелов в понимании сложных молекулярных механизмов, которые управляют этими процессами. Для изучения молекулярных механизмов, регулирующих поддержание и рост мышечной массы, исследовательские модели людей часто используют вмешательства на основе упражнений с отягощениями, поскольку механические стимулы играют неотъемлемую роль в регуляции массы скелетных мышц. В то время как исследования на людях были успешными, время, необходимое для проявления адаптации и этических проблем в отношении инвазивных процедур (т. Е. Биопсия мышц), ограничивает количество данных, которые могут быть получены. В то время как адаптация к упражнениям с отягощениями довольно распространена среди видов млекопитающих, животные модели обеспечивают преимущество в том, что они могут точно контролировать диету и режим упражнений, а также позволяют собирать целые ткани по всему телу, такие как мозг, печень, сердце и скелетные мышцы.

Многие модели тренировок с отягощениями были разработаны для использования у грызунов: синергетическая абляция², электрическая стимуляция ^3,4, утяжеленное подъем по лестнице⁵, утяжеленное тяги саней⁶ и приседание с холстом⁷. Очевидно, что все эти модели, если все эти модели сделаны правильно, могут быть эффективными моделями для индуцирования адаптации скелетных мышц, такой как гипертрофия. Однако недостатки этих моделей заключаются в том, что они в основном непроизвольные, не являются частью нормального поведения грызунов, трудоемкими и инвазивными.

К счастью, многие штаммы мышей и крыс добровольно бегут на большие расстояния, когда им предоставляется доступ к беговому колесу. Кроме того, модели упражнений со свободным колесом (FWR) не полагаются на обширное кондиционирование, положительное / отрицательное подкрепление или анестезию для принудительного движения или мышечной активности ^8,9. Беговая деятельность сильно зависит от напряжения мыши, пола, возраста и индивидуальной основы. Lightfoot et al. сравнили беговую активность 15 различных штаммов мышей и обнаружили, что ежедневная дистанция бега колеблется от 2,93 км до 7,93 км, причем мыши C57BL / 6 бегут дальше всех, независимо от пола¹⁰. FWR обычно считается отличной моделью для стимуляции адаптации выносливости в скелетных и сердечных мышцах 11,12,13,14,15,16; однако использование колесного бега в моделях тренировок с отягощениями исследуется реже.

Как можно было бы подозревать, гипертрофический эффект бега колеса может быть усилен путем добавления сопротивления беговому колесу, называемому бегом нагруженного колеса (LWR), что требует больших усилий для бега на колесе, чтобы более точно имитировать тренировку сопротивления. Используя различные методы применения нагрузки, предыдущие исследования показали, что модель LWR, использующая крыс и мышей, обычно демонстрировала увеличение мышечной массы конечностей на 5%-30% в течение 6-8 недель 17,18,19,20,21. Кроме того, D'hulst et al. продемонстрировали, что один приступ LWR привел к увеличению активации сигнального пути синтеза белка на 50% по сравнению с FWR²². Сопротивление колеса чаще всего применяется методом постоянной нагрузки, основанным на трении, при котором магнитный тормоз или натяжной болт используется для применения сопротивления колеса 12,19,23,24. Одно из предостережений метода постоянной нагрузки, основанного на трении, заключается в том, что при применении умеренного и высокого сопротивления животное не может преодолеть высокое сопротивление, чтобы инициировать движение колеса, эффективно прекращая обучение. Самое главное, что многие из клеточных и колесных систем, используемых для моделей ходовых колес грызунов, довольно дорогостоящие и требуют специализированного оборудования.

Недавно Dungan et al. разработали прогрессивную модель с утяжеленным колесом (PoWeR), которая применяет нагрузку на колесо асимметрично через внешние массы, прикрепленные к одной стороне колеса. Считается, что несбалансированная нагрузка на колеса и переменное сопротивление модели PoWeR способствуют продолжению беговой активности и способствуют более коротким всплескам нагруженного колеса, работающих на мышах, более точно имитируя сеты и повторения, выполняемые с тренировкой с отягощениями¹⁷. Несмотря на то, что средняя дистанция бега составляла 10-12 км в день, модель PoWeR дала увеличение влажной массы мышц плантариса на 16% и 17% и площади поперечного сечения волокон (CSA) соответственно. Несмотря на многие практические преимущества, модель PoWeR LWR имеет некоторые ограничения. Как признают авторы, модель PoWeR представляет собой «гибридный» стимул большого объема, который отражает смешанную модель упражнений на выносливость / сопротивление (т. Е. Параллельные тренировки у людей), в отличие от более строгой модели, основанной на упражнениях с отягощениями, потенциально вводя эффект интерференции и способствуя менее выраженной гипертрофии или различным механизмам, с помощью которых гипертрофия индуцируется²⁵ . Обеспечение того, чтобы явление параллельной тренировки не происходило в том, что должно быть моделью тренировки с отягощениями, является обязательным. Поэтому модель PoWeR была модифицирована для разработки модели LWR, которая использует более высокие нагрузки, чем ранее, чтобы больше напоминать модель тренировки сопротивления. Здесь приведены подробные сведения о простой и недорогой 9-недельной модели LWR с прогрессивной тренировкой с отягощениями у мышей C57BL/6.

протокол

Это исследование было одобрено Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Аппалачского государственного университета (No 22-05).

1. Животные

1. Добывайте мышей C57BL/6 из собственной колонии мышей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использовались самцы мышей в возрасте 5-8 месяцев в начале исследования. Ежедневная беговая активность достигает пика и плато примерно в 9-10 недель в возрасте^{26 лет}. Предыдущие исследования показали, что старые мыши (22-24 месяца) также будут выполнять нагруженное колесо, работающее²⁷.
2. Поместите мышей по отдельности в стандартную клетку для грызунов с проволочной крышкой и держите клетку в контролируемой среде (20-24 ° C с циклом 12: 12 ч света: темнота).
3. Обеспечьте стандартным чау-чау для грызунов и водой ad libitum.

2. Ходовой колесный аппарат

1. Настройка ходового колеса:
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ходовые колеса собираются/настраиваются аналогично для всех протоколов работы, за исключением добавления нагрузочных магнитов 1 g или 2,5 g.
   1. Приклейте один магнит датчика 1 g к внешней средней окружности ходового колеса (рисунок 1).
   2. Используйте это колесо с одним магнитом датчика 1 g только в течение первой недели акклиматизации колеса.
   3. Работа на нагруженном колесе (LWR; протокол загрузки идентичен PoWeR¹⁷): Выполните шаги 2.1.4-2.1.6.
   4. Неделя 2 для LWR требует 2 г нагрузки (см. таблицу 1).
   5. Приклейте два магнита по 1 г бок о бок на внешнюю окружность колеса (рисунок 2А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь полезно использовать ленту, чтобы удерживать магниты на месте, пока клей не высохнет; в противном случае они могут притягиваться к магниту датчика и смещаться.
   6. Примените дополнительную нагрузку в течение недель 3, 4 и 6, поместив еще один магнит весом 1 г поверх любого из уже присутствующих магнитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клей не требуется, так как магниты прочно прилипают друг к другу. Например, при 6 г нагрузки на 6-й неделе каждый из магнитов будет укладываться в три раза (рисунок 2B).
   7. Ход высоконагруженных колес (HLWR): Выполните шаги 2.1.8-2.1.11.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол HLWR требует трех комплектов колес. Сборка различных наборов колес позволяет исследователю повторно использовать колесные установки для других мышей после того, как колесо тщательно очищено и продезинфицировано (количество каждого набора должно быть определено исследователем на основе размера когорты / группы).
   8. Первый комплект колес (требуется только для недели 2) будет иметь один магнит весом 2,5 г; приклеить (см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже Этап 2.1.5) одним магнитом весом 2,5 г на внешнюю окружность колеса (рис. 3А).
   9. Второй комплект колес (требуется только для недели 3) будет иметь два магнита по 2,5 г; приклеить (см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже на этапе 2.1.5) два магнита весом 2,5 г бок о бок на внешнюю окружность колеса (рис. 3В).
   10. Третий комплект колес (требуется для недели 4 и далее) будет иметь три магнита по 2,5 г бок о бок; приклеить (см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже Этап 2.1.5) три магнита весом 2,5 г бок о бок на внешнюю окружность колеса (рис. 3С).
   11. Применяйте дополнительную нагрузку в течение недель 6 и 8, поместив еще один магнит весом 2,5 г поверх любого из уже присутствующих магнитов (рисунки 3D, E).

Рисунок 1: Базовое ходовое колесо с одним магнитом датчика 1 g, приклеенным к средней внешней окружности колеса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Нагруженное ходовое колесо (LWR) с магнитом датчика и нагрузочными магнитами 1 g. (A) Пример 2 g нагрузки, два магнита 1 g, приклеенные бок о бок к внешнему краю колеса; (B) пример нагрузки 6 г, два магнита по 1 г, приклеенные бок о бок к внешнему краю колеса с дополнительной нагрузкой 4 г. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Высоконагруженное ходовое колесо (HLWR) с магнитом датчика и нагрузочными магнитами 2,5 г. (А) пример 2,5 г нагрузки, один магнит 2,5 г, приклеенный к внешнему краю колеса; (B) пример нагрузки 5 г, два магнита по 2,5 г, приклеенные бок о бок к внешнему краю колеса; (C) пример нагрузки 7,5 г, три магнита по 2,5 г, приклеенные бок о бок к внешнему краю колеса; (D) пример 10 г нагрузки, три магнита по 2,5 г, приклеенных бок о бок к внешнему краю колеса, с дополнительными 2,5 г нагрузки; (E) пример нагрузки 12,5 г, три магнита по 2,5 г, приклеенные бок о бок к внешнему краю колеса, с дополнительными 5 г нагрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Сборка клетки

1. Соберите ходовые колеса с помощью клетки, оснащенной цифровым велосипедным компьютером для мониторинга времени тренировки (ч) и пройденного расстояния (км). Средняя скорость (км/ч) выводится арифметически.
   1. Убедитесь, что перед сборкой в велосипедный компьютер вставлена свежая батарея.
   2. Установить размер колеса при первоначальном компьютерном программировании велосипеда (см. инструкцию производителя); рассчитать расстояние за оборот путем измерения внешней окружности ходового колеса (например, 3 580 мм для типа колеса, используемого в настоящем документе).
2. Поместите компьютерный датчик велосипеда в твердую поверхность на внешней стороне крышки клетки, непосредственно над тем местом, где расположен магнит датчика колеса. Убедитесь, что все компоненты компьютера и датчика содержатся в твердом барьере за пределами клетки, чтобы мыши не жевали компоненты.
   1. Используйте крышку пустой коробки с наконечником пипетки с небольшим прямоугольником, вырезанным для размещения магнитного датчика велосипеда, и основную часть коробки (со снятой сеткой стойки наконечника) для хранения велосипедного компьютера и провода (рисунок 4A).
   2. Просверлите два отверстия через углы твердой поверхности, чтобы закрепить магнитный датчик велосипеда и рабочее колесо на месте снаружи клетки (рисунок 4A).
3. Вставьте текущую колесную базу вверх ногами через зазоры в крышке сепаратора, но поверх твердой поверхности, описанной на этапе 3.2 (рисунок 4B).
   1. Закрепите колесную базу и датчик компьютера в верхней части клетки с помощью аппаратного обеспечения (рисунок 4C, D).
4. Убедитесь, что магнит датчика и компьютерный датчик расположены на расстоянии не более 1 см друг от друга, чтобы обеспечить надлежащую регистрацию движения колеса (большинство стандартных компьютерных датчиков велосипеда являются двунаправленными и будут записывать положительное движение колеса в любом направлении вращения).
5. Прикрепите соответствующее ходовое колесо (как описано выше) к колесной базе с внутренней стороны крышки сепаратора и надежно поместите крышку на сепаратор (рисунок 4E, F).
6. С колесом, свисающим с крышки клетки, обеспечьте не менее 2,5 см зазора от пола клетки. Поместите минимальное количество подстилающего материала в клетку, чтобы колесо свободно вращалось, но не становилось препятствием из-за накопления подстилки.
7. Во время экспериментов записывайте данные с велосипедного компьютера с последовательным интервальным графиком, чтобы обеспечить точный мониторинг активности.
   1. Признать, что мыши являются ночным видом; поэтому большая часть их естественной активности в клетке (включая работу колес) будет выполняться в темные часы светового цикла.

Рисунок 4: Сепаратор ходового колеса в сборе. (A) Велосипедный компьютер и магнитный датчик размещены в твердой поверхности / лотке; (B) перевернутая колесная база, размещенная поверх твердой поверхности/лотка и датчика (вид сверху; обратите внимание на два отверстия в поверхности датчика/лотке для крепления основания к крышке сепаратора с помощью оборудования), (C) перевернутая колесная база с собранным оборудованием (вид снизу); (D) перевернутая колесная база с оборудованием в собранном виде (вид сверху); (E) полный сепаратор в сборе (вид сверху); и F) полный сепаратор в сборе (вид сбоку). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Протоколы тренировки по нагрузке

1. Индивидуально размещать сидячих (SED) мышей в течение 9 недель в клетке, содержащей запертое беговое колесо, чтобы предотвратить любой бег.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 приведен график загрузки протоколов LWR (PoWeR) и HLWR, используемых при экспериментальном проектировании.
2. Уменьшите нагрузку для групп LWR и HLWR, если это необходимо, чтобы мыши продолжали тренироваться в течение всего 9-недельного протокола.

		Неделя
		1	2	3	4	5	6	7	8	9
LWR (n = 4)	Нагрузка (г)	0.0	2.0	3.0	4.0	5.0	5.0	6.0	6.0	6.0
	%БМ	--	8%	11%	15%	19%	19%	23%	23%	23%
ВАО (n =7)	Нагрузка (г)	0.0	2.5	5.0	7.5	7.5	10.0	10.0	12.5	12.5
	%БМ	--	10%	19%	28%	28%	38%	38%	48%	48%

Таблица 1. Протоколы работы нагруженных колес

5. Тестирование мышечной функции in situ , сбор тканей и анализ тканей

1. После 9-недельного обучающего вмешательства обезболивайте мышей, используя ингаляционный изофлуран (4% индукция; 2% поддержание) дополнительным кислородом, и обеспечьте надлежащий мониторинг анестезирующей плоскости на протяжении всей процедуры.
2. Выполните тест функции мышц in situ на комплексе икроножной крупы, плантариса, камбалы (GPS) для проверки изометрической мышечной силы²⁸. Установите кривую силы-частоты путем прямой стимуляции седалищного нерва с помощью 27 G-электродных игл на 11 восходящих частотах между 1-300 Гц, с тетаническими сокращениями, происходящими около 100-150 Гц²⁹.
3. Сразу после теста мышечной функции усыплите мышей через вывих шейки матки и подтвердите эвтаназию, удалив сердце. Тщательно иссекните подошвенные и камбаловидные мышцы и запишите влажную тканевую массу.
4. Покройте каждый образец мышцы в встраиваемой средой (OCT) и установите его на пробку. Заморозьте его в жидком азотоохлаждаемом изопентане и храните при -80 °C до дальнейшего иммуногистохимического (IHC) анализа на участках мышечной ткани (толщиной 10 мкм).
5. Анализ мышечного волокна CSA с использованием иммунофлуоресценции для ламинина. Измерьте оптоволоконный CSA с помощью платформы³⁰ автоматической количественной оценки изображений.

6. Статистический анализ

1. Выражайте все данные как среднее ± SD.
2. Выполняйте статистический анализ с использованием программного обеспечения для статистического анализа со значимостью, установленной на уровне p ≤ 0,05.
3. Сравните данные о пробеге колес и объеме тренировок с повторными измерениями двусторонней ANOVA.
4. Сравните массу тела, массу тканей, CSA и мышечную функцию с односторонней ANOVA. Если обнаружены значимые F-соотношения, сравните внутригрупповые различия, используя пост-специальный анализ ЛСД Фишера.
5. Рассчитайте размеры эффектов, а затем интерпретируйте их как 0,01, 0,06 и 0,14 для малых, средних и больших размеров эффектов соответственно.

Результаты

В этом исследовании 24 мыши C57BL/6 (6,3 ± 0,7 месяца в начале этого исследования) были случайным образом распределены в одну из трех групп лечения: сидячий образ жизни (SED), бег на нагруженных колесах (LWR; такой же, как PoWeR, описанный Dungan et ^al.17), или высокий LWR (HLWR), а затем завершили свой с...

Обсуждение

Существующие модели упражнений с отягощениями у грызунов оказались бесценными для исследований скелетных мышц; однако многие из этих моделей являются инвазивными, непроизвольными и/или трудоемкими и трудоемкими. LWR является отличной моделью, которая не только вызывает аналогичные мы...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 g disc neodymium magnets	Applied Magnets	ND018-6	Used for all sensor magnets and 1 g increments of wheel loading
2.5 g disc neodymium magnets	Applied Magnets	ND022	Used for 2.5 g increments of wheel loading
8-32 x 1" stainless steel screws	Amazon		https://www.amazon.com/gp/product/B07939RS23/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
8-32 Wing Nuts	Amazon		https://www.amazon.com/gp/product/B07YYWW2SB/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1
10 µL pipette tip box (empty)	Thermo Scientific	2140	We used empty ART Pipette tip boxes, but any similar sized boxes/trays would suffice
Extreme Liquid Glue	Loctite
Laminin primary antibody	Novus Biologicals	NB300-144AF647	primary antibody conjugated with AF657; 1:200 in PBS containing 10% normal goat serum
Lithium 3 V battery	n/a	CR2032
M10 (3/16" x 1 1/4") stainless steel fender washers	Amazon		https://www.amazon.com/gp/product/B00OHUHEU8/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1
MyoVision: Automated Image Quantification Platform	Wen et al. (2017)	v1.0	https://www.uky.edu/chs/center-for-muscle-biology/myovision
Polycarbonate rodent cage (430 mm L x 290 mm W x 201 mm H), with narrow width stainless steel wired bar lid	Orchid Scientific	Polycarbonate Rat Cage Type II	https://orchidscientific.com/product/rat-cage/ - 1519974600758-c29bc1c5-6dfa
Sigma Sport 509 Bike Computer	Sigma Sport		Does not need to be this model in particular, but must have distance and time monitoring capabilities
Silent Spinner Running Wheel (mini 11.4 cm)	Kaytee	SKU# 100079369	https://www.kaytee.com/all-products/small-animal/silent-spinner-wheel