来自微凝胶棒的互连大孔3D支架

摘要

具有互补反应基团的微凝胶棒通过微流体生产，具有在水溶液中相互连接的能力。与基于球形的系统相比，各向测量微凝胶可卡住并相互连接成具有更大孔的稳定结构。用GRGDS-PC修饰的微凝胶形成可用于细胞培养的大孔3D构建体。

摘要

来自微流体的双组分功能化微凝胶系统允许在水溶液中快速互连成3D大孔结构，而无需进一步的添加剂。连续的光引发片上凝胶可以改变微凝胶纵横比，这决定了所获得的构建体的构建块特性。甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）或甲基丙烯酸2-氨基乙酯（AMA）单体被共聚合到基于聚乙二醇（PEG）星形聚合物的微凝胶网络中，以实现环氧或胺官能团。将聚焦油流引入微流体出口结构，以确保功能化微凝胶棒的连续收集。根据最近的出版物，基于微凝胶棒的构建体会产生数百微米的更大孔隙，同时与基于球形的模型相比，导致整体更高的支架稳定性。通过这种方式，可以生产具有更多自由体积的大批量结构，同时减少所需的材料量。相互连接的大孔支架可以拾取和运输，而不会损坏或分解。不参与互连的胺和环氧基团保持活性，可以独立用于后改性。该协议描述了一种优化的方法，用于制造微凝胶棒以形成可用于后续细胞实验的大孔互连支架。

引言

为了研究 3D 构建体中复杂的协作细胞行为，支架平台需要在可重复性方面表现出一致的性能，具有适合细胞迁移的几何形状，同时在参数改变方面具有一定的灵活性，以研究它们对^{活组织的影响}1。近年来，由Segura等人首次描述的大孔退火颗粒（MAP）概念发展成为3D脚手架生产的高效多功能平台²。微凝胶的定制组成是最终3D支架的构建块，预定义了诸如结构的刚度，凝胶网络的选择性化学反应性以及支架的最终孔径2，³，⁴，^5，6等特性。细胞粘附肽作为支架-细胞相互作用的线索被掺入微凝胶的聚合物网络中以允许细胞附着，并且可以改变以研究它们对培养细胞的特异性影响。3D支架通过共价或超分子键使退火的可注射微凝胶相互连接而稳定，从而为^{细胞培养2}，³，⁵，^7，8提供稳健且明确的构建体。

微流体已成为制备确定的颗粒水凝胶的最准确和适应性最强的方法^之一9。在连续过程中生产大量所需构建块的可能性，同时保持其化学、机械和物理单分散性，大大有助于该工艺的适用性。此外，生产的微凝胶的大小和形状可以通过各种方法进行操作，例如批量乳液，微流体，光刻，电动喷涂或机械碎裂，这些方法决定了构建块的几何形状，从而决定了最终支架^的3D结构1^，10。

最近，已经报道了由功能化微凝胶棒组成的大孔3D支架的概念，该支架在水溶液中快速互连而无需进一步的添加剂¹¹。与在本研究中使用球形微凝胶相比，微凝胶棒的各向异性导致更高的孔隙率和孔分布以及更大的孔径¹¹。通过这种方式，更少的材料会产生具有各种不同孔隙几何形状的较大孔隙，同时保持 3D 脚手架的稳定性。该系统由两种类型的微凝胶棒组成，具有互补的伯胺和环氧官能团，当它们相互接触时，它们在相互连接的反应中消耗。不参与互连过程的官能团保持活性，可用于细胞粘附肽或其他生物活性因子的选择性后修饰。成纤维细胞在3D支架内培养时附着，扩散和增殖，首先在微凝胶表面上生长，并在5天后填充大部分大孔。人成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的初步共培养研究表明，在相互连接的3D支架¹¹内形成血管样结构的结果很有希望。

研究方案

1. 微流控所需的材料和准备

1. 对于所描述的微流体程序，请使用 1 mL 和 5 mL 玻璃注射器和注射泵。通过配备高速相机的倒置显微镜观察片上液滴的形成。
2. 使用计算机辅助设计软件创建微流控芯片设计（图1B），并生成已报告^{的主模板12}。
3. 使用自制的 UV-LED（λ = 365 nm，光斑直径 ~4.7 mm）实现受控的紫外线照射，通过 0.13 mm 厚的盖板玻璃提供 957 mW/cm² 的辐照度。
   注意:考虑到紫外线-LED在照射过程中可能产生的局部热量。如果是这种情况，请确保通过外部气流进行足够的冷却。

2. 微流控装置生产

注意:微流体装置的生产基于先前的出版物¹³。

1. 准备20克10:1（质量）的聚二甲基硅氧烷（PDMS）和固化剂混合物。剧烈搅拌3分钟。
2. 将60毫克油红O与2.0克甲苯混合。向PDMS混合物中加入50 μL油红O甲苯溶液。混合直至颜色分布均匀，以减少不需要的光散射，并在片上凝胶化过程中保持光斑尺寸聚焦。
3. 通过将混合物放入配备真空泵的干燥器中来去除气泡。
4. 将 PDMS 混合物浇注到主模板中至 5-5.5 mm 的高度，然后再次脱气。
5. 让PDMS在室温下固化18小时，以避免重氮染料降解。
6. 切出PDMS结构，并使用线芯采样工具（0.77 mm内径，1.07 mm外径）在结构中打孔和出口孔。
7. 用异丙醇和去离子水反复清洗PDMS和盖玻片5次，随后在每个洗涤步骤后通过加压空气或氮气流除去液体。
8. 将干玻璃和PDMS一起在0.2mbar的等离子炉中处理，氧气流量为20mL / min，在100W下持续60秒，并直接连接以将玻璃和PDMS结合在一起以形成微流体装置。
   注意:在绑定过程中避免弯曲PDMS结构，以最大程度地减少通道结构变形。
9. 为了使微流控芯片的通道具有疏水性，请将设备与50μL三氯-（1 H，1 H，2H，2H-全氟辛基）-硅烷一起置于真空干燥器中过夜（降低蒸气压后关闭与泵的连接）。用氢氟醚冲洗设备外部。
   注意:在通风橱中执行这些步骤，避免与全氟硅烷接触。使用用油脂密封的玻璃真空干燥器。在用于其他目的之前，请彻底清洁干燥器。

3. 微流体溶液制备

1. 对于连续油相，混合石蜡油和十六烷（1:1 v / v），并加入8%（w / w）的非离子表面活性剂。填充一个1 mL（第一种油， 图1）和一个5 mL（第二种油， 图1）玻璃注射器。
2. 为棕色玻璃小瓶中的分散相制备预聚物溶液，以防止光引发剂分解和意外凝胶化。
   1. 含有GRGDS-PC的胺组分预聚物溶液
      1. 对于 300 μL 溶液，称取 33.3 mg 星形聚乙二醇丙烯酸酯 （sPEG-AC） 和 3.03 mg 苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰次膦酸锂 （LAP）。
      2. 将18.74mg甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐（AMA）溶解在1.5mL去离子水中，并将溶液通过注射器过滤器（0.20μm孔径）。
         注意:AMA具有吸湿性，一旦固体在储存容器中形成结块，应立即丢弃。
      3. 在水中制备无菌36mM GRGDS-PC等分试样，并保持在-20°C直至使用。
      4. 使用 291.7 μL 的 AMA 溶液溶解 sPEG-AC 和 LAP，并加入 8.3 μL 的 GRGDS-PC 溶液。用 1 mL 玻璃注射器取出溶液，并使用铝箔避光。
   2. 环氧组分预聚物解决方案
      1. 对于 300 μL 溶液，称取 33.3 mg 星形聚乙二醇丙烯酸酯 （sPEG-AC）、3.03 mg LAP 并溶解在 300 μL 去离子水中。加入2.4毫克甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）。
         注意:剧烈摇晃会加速GMA溶解。用 1 mL 玻璃注射器取出溶液，并使用铝箔避光。

4. 胺和环氧功能化微凝胶棒的生产与纯化

图 1:微流控片上凝胶组件的 布置。 （A）微流体过程中组件布置的前视图和角度视图。（B）用于微凝胶棒芯片芯片凝胶的微流控芯片设计。（1）PE管至第一进油口。（2）用PE管向分散相入口处透光。（3）PE管至第二进油口。（4）PE管从出口到产品收集容器。（5）紫外灯和照射位置在出口附近的直线80μm通道上。（6）显微镜物镜/观察位置。（7）微流控装置的彩色PDMS组件。（8） 粘合到PDMS上的盖板玻璃。 请点击此处查看此图的大图。

1. 将针头插入PE管中，并从注射器和管中取出气体。
2. 将 PE 管插入产品收集的插座。
3. 将所有玻璃注射器放入注射泵中，并将每个管端插入相应的入口（图1）。
   注意:通过铝箔或黑色管保护预聚物管免受光照，以避免意外凝胶化。
4. 将显微镜聚焦在油水横截面上。
5. 启动第一个油注射泵（流速 = 100-200 μL/h）以首先向通道填充油，以防止分散相润湿通道。
6. 将第一油流速降低至 30 μL/h，然后启动预聚物注射泵（流速 = 100-200 μL/h），直到在横截面处观察到分散的水相。
7. 将预聚物流速设置为 30 μL/h，并将显微镜聚焦在出口上。
8. 启动第二个油注射泵（流速为 300 μL/h）并等待流态稳定。
9. 将出口管放入收集容器中。
   注意:将管子的末端放在容器的上部，以避免由于产品随着时间的推移而增加压力。
10. 设置紫外线照射系统，使辐照度在900-1000 mW / cm 2范围内（使用的辐照度= 957 mW / cm²），并且照射点位于出口之前的直通道部分中（图1B）。
    注意:确保不要在油水横截面附近照射，以免堵塞通道。为了获得额外的保护，请在设备顶部的辐照点之前覆盖通道结构。
11. 在紫外线照射之前，调整预聚物和第一油的流速，以在3.0至4.5的范围内达到所需的纵横比，并将分散相的照射时间设置为~2.3s，具体取决于照射点的大小。
12. 开始紫外线照射，如有必要，根据上一节再次调整流速。
    注意:在开始时观察生产并监测出口中的稳定流动行为和微凝胶棒的均匀性。可以调节第二个油流量，以优化出口内的产品运输。
13. 更改收集容器并记下产品收集开始时间和流速。
    注意:保护产品免受灰尘侵害。在任何注射器的溶液不足之前停止收集。
14. 若要结束收集，请删除收集容器，并记下时间。停止照射和所有注射泵。
15. 随后用正己烷、异丙醇和去离子水洗涤产品 5 次。杆沉降后除去上清液。
    注意:每次加入溶液后，考虑到分子扩散，小心分散产品并等待10分钟后更换溶剂。用水逐渐更换异丙醇，以防止棒漂浮到液体表面。多次用水洗涤步骤可减少剩余的异丙醇痕迹。

5. 大孔支架形成

1. 确定环氧树脂和胺功能化样品的每个分散体积的微凝胶棒数量。
2. 通过稀释或浓缩将环氧树脂和胺功能化样品的数量调整为 1，000-5，000 棒/100 μL 之间的相似值。
   注意:使用~2，000 x g 离心机5-10秒以加速微凝胶棒的沉降。如果每个分散体积的杆数较低，则杆互连可能会导致较小的杆簇而不是一个稳定的结构。如果每个分散体积的棒数很高，则两种组分的混合质量将受到影响。
3. 将第一组分（~1，200 棒）分散液转移到锥形 1.5 mL 或 2 mL 透明小瓶中。
4. 在连续操作（100 μL移液器）中以受控方式添加第二种组分。添加后，使用移液管直接混合内容物以吸收液体并再次添加。在混合过程中，在几秒钟内形成相互连接的结构。
   注意:如果形成多个簇而不是一个相干结构，请重新检查每体积的微凝胶棒数量或提供两种组分的更受控混合。

6. 电池胶粘剂后改性

1. 根据分散聚合物相的流速、特定时间内收集的微凝胶数以及用于支架形成的微凝胶分散体的稀释因子，计算互连结构中环氧基团的理论数量。
   注意:通过以下公式近似每个支架的环氧基团的理论数量。
   
   
   _第n:理论物质量
   c GMA:预聚物溶液中的_GMA浓度
   Q:预聚物溶液的流速
2. 将GRGDS-PC溶液添加到互连结构中，用含有游离胺和硫醇的细胞粘附肽修饰所有剩余的环氧基团（n[理论环氧基团]/n[GRGDS-PC] = 1）。在室温下放置过夜。
3. 通过用去离子水洗涤并除去上清液来除去未反应的分子。

7. 灭菌并转移到细胞培养基中

1. 降低水位以淹没相互连接的脚手架。
2. 打开小瓶并用 λ = 250-300nm的紫外线照射。关闭小瓶并将小瓶转移到干净的工作台上。用无菌水清洗1次。
3. 用细胞培养基替换小瓶中的水，并允许平衡5分钟。用新鲜细胞培养基2x重复此操作。
4. 通过倾倒或使用刮刀将大孔支架转移到细胞培养孔板中进行实验。

  

结果

图2:大孔交联支架结构 。 （A）互连的大孔支架的500μm共聚焦显微镜Z堆栈的3D投影。比例尺代表 500 μm。 （B） 由直接从水中取出的盖玻片上的~10，000个微凝胶棒组成的互连支架。比例尺代表 5 毫米。

讨论

该方案中的关键步骤之一是用作伯胺官能化的共聚单体的2-氨基乙基甲基丙烯酸酯（AMA）的质量。AMA应该是细粒的，最好是无色的粉末，装在气密的棕色玻璃容器中。应避免使用绿色和块状材料，因为它会显着损害凝胶反应并对结果的可重复性产生负面影响。如果凝胶化不良和微凝胶棒不稳定，可以考虑更换供应商。

如果胺和环氧微凝胶棒的混合导致多个相互连接的团簇而不...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABIL EM 90	Evonik	144243-53-8	non-ionic surfactant
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride	TCI Chemicals	A3413	>98.0%(T)(HPLC)
8-Arm PEG-acrylate 20 kDa	Biochempeg Scientific Inc.	A88009-20K	≥ 95 %
AutoCAD 2019	Autodesk		computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs
CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter	CHROMAFILCarl Roth GmbH+Co.KG	XH49.1	pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV)
Cover glass	Marienfeld-Superior		type No. 1
EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm	Electron Microscopy Sciences		0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter
Ethanol absolut	VWR Chemicals
FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera	FLIR Systems
Fluoresceinamine isomer I	Sigma-Aldrich	201626
Fluorescein isothiocyanate	Thermo Fisher Scientific	46424
25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles	BD Microlance 3
Glycidyl methacrylate	Sigma-Aldrich	779342	≥97.0% (GC)
GRGDS-PC	CPC Scientific	FIBN-015A
Hamilton 1000 Series Gastight syringes	Thermo Fisher Scientific	10772361/10500052	PFTE Luer-Lock
Hexane	Sigma-Aldrich	1,04,367
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate	Sigma-Aldrich	900889	≥95 %
Motic AE2000 trinocular microscope	Ted Pella, Inc.	22443-12
Novec 7100	Sigma-Aldrich	SHH0002
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O9755
Paraffin	VWR Chemicals	24679320
Pavone Nanoindenter Platform	Optics11Life
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade	dropletex		ID 0.38 mm OD 1.09 mm
2-Propanol	Sigma-Aldrich	190764	ACS reagent, ≥99.5%
Protein LoBind Tubes	Eppendorf	30108132
Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus
RPMI 1640 medium	Gibco	11530586
SYLGARD 184 silicone elastomer kit	Dow SYLGARD	634165S
Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane	Sigma-Aldrich	448931
UVC LED sterilizing box	UVLED Optical Technology Co., Ltd.	9S SZH8-S2