Andaimes 3D macroporosos interligados de hastes de microgel

Resumo

Hastes de microgel com grupos reativos complementares são produzidas via microfluídica com a capacidade de se interligar em solução aquosa. Os microgéis anisométricos encravam e se interligam em construções estáveis com poros maiores em comparação com sistemas baseados em esféricos. Microgéis modificados com GRGDS-PC formam construções 3D macroporosas que podem ser usadas para cultura celular.

Resumo

Um sistema de dois componentes de microgéis funcionalizados da microfluídica permite uma rápida interligação em construções macroporosas 3D em soluções aquosas sem mais aditivos. A gelificação contínua fotoiniciada no chip permite a variação da proporção do microgel, que determina as propriedades do bloco de construção para as construções obtidas. Os monômeros de metacrilato de glicidil (GMA) ou metacrilato de 2-aminoetila (AMA) são copolimerizados na rede de microgel com base em polímeros-estrela de polietilenoglicol (PEG) para alcançar a funcionalidade de epóxi ou amina. Um fluxo de óleo de foco é introduzido na estrutura de saída microfluídica para garantir a coleta contínua das hastes de microgel funcionalizadas. Com base em uma publicação recente, construções baseadas em hastes de microgel resultam em poros maiores de várias centenas de micrômetros e, ao mesmo tempo, levam a uma maior estabilidade geral do andaime em comparação com um modelo baseado em esférico. Desta forma, é possível produzir construções de maior volume com mais volume livre, reduzindo a quantidade de material necessário. Os andaimes macroporosos interligados podem ser apanhados e transportados sem danos ou desintegração. Os grupos amina e epóxi não envolvidos na interligação permanecem ativos e podem ser usados independentemente para pós-modificação. Este protocolo descreve um método otimizado para a fabricação de hastes de microgel para formar andaimes macroporosos interligados que podem ser utilizados para experimentos celulares subsequentes.

Introdução

Para estudar o comportamento celular cooperativo complexo em construtos 3D, as plataformas de andaimes precisam mostrar desempenho consistente na reprodutibilidade, ter geometria adequada para a migração celular e, ao mesmo tempo, permitir certa flexibilidade em termos de alteração de parâmetros para investigar sua influência sobre o tecido vivo¹. Nos últimos anos, o conceito de partículas recozidas macroporosas (MAP), descrito pela primeira vez por Segura et al., tornou-se uma plataforma eficiente e versátil para a produção de andaimes 3D². A composição sob medida dos microgéis, que são os blocos de construção do andaime 3D final, predefine propriedades como a rigidez da construção, a reatividade química seletiva da rede de gel e o tamanho final dos poros do andaime 2,3,4,5,6. Os peptídeos adesivos celulares como pistas para interações andaime-célula são incorporados à rede polimérica dos microgéis para permitir a fixação celular e podem ser variados para investigar seus efeitos específicos nas células em cultura. Os andaimes 3D são estabilizados pela interligação dos microgéis injetáveis recozidos devido a ligações covalentes ou supramoleculares, resultando em construtos robustos e definidos para a cultura celular 2,3,5,7,8.

A microfluídica estabeleceu-se como um dos métodos mais precisos e adaptáveis para a preparação de hidrogéis granulares definidos⁹. A possibilidade de produzir maiores quantidades dos blocos de construção necessários em um processo contínuo, mantendo sua monodispersão química, mecânica e física, contribui substancialmente para a adequação desse processo. Além disso, o tamanho e a forma dos microgéis produzidos podem ser manipulados por vários métodos, como emulsões em lote, microfluídica, litografia, pulverização eletrodinâmica ou fragmentação mecânica, que determinam a geometria dos blocos de construção e, assim, a estrutura 3D do andaime final ^1,10.

Recentemente, o conceito de andaimes 3D macroporosos compostos por hastes de microgel funcionalizadas que se interligam rapidamente em soluções aquosas sem mais aditivos tem sido relatado¹¹. A anisotropia das hastes de microgel resultou em maiores porosidades e distribuições de poros com maiores tamanhos de poros em comparação com o emprego de microgéis esféricos neste estudo¹¹. Desta forma, menos material cria poros maiores com uma variedade de diferentes geometrias de poros, mantendo a estabilidade do andaime 3D. O sistema consiste em dois tipos de hastes de microgel com amina primária complementar e grupos funcionais epóxi que são consumidos dentro da reação de interligação quando entram em contato um com o outro. Os grupos funcionais que não participam do processo de interligação permanecem ativos e podem ser utilizados para pós-modificação seletiva com peptídeos adesivos celulares ou outros fatores bioativos. As células fibroblásticas se ligam, se espalham e proliferam quando cultivadas dentro dos andaimes 3D, crescendo primeiro na superfície do microgel e preenchendo a maioria dos macroporos após 5 dias. Um estudo preliminar de cocultura de fibroblastos humanos e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) mostrou resultados promissores para a formação de estruturas semelhantes a vasos dentro dos andaimes 3D interligados¹¹.

Protocolo

1. Material e preparações necessários para microfluídica

1. Para o procedimento microfluídico descrito, use seringas de vidro de 1 mL e 5 mL e bombas de seringa. A formação de gotículas no chip é observada através de um microscópio invertido equipado com uma câmera de alta velocidade.
2. Crie o projeto de chip microfluídico (Figura 1B) usando um software de projeto assistido por computador e produza um modelo mestre, conforme já relatado¹².
3. Obtenha irradiação UV controlada usando um LED UV auto-construído (λ = 365 nm, diâmetro pontual ~ 4,7 mm) fornecendo irradiância a 957 mW/cm² através de um vidro de cobertura de 0,13 mm de espessura.
   NOTA: Leve em conta a possível geração de calor local pelo UV-LED durante a irradiação. Se este for o caso, certifique-se de resfriamento suficiente pelo fluxo de ar externo.

2. Produção de dispositivos microfluídicos

NOTA: A produção de dispositivos microfluídicos é baseada em uma publicação anterior¹³.

1. Preparar 20 g de uma mistura 10:1 (em massa) de polidimetilsiloxano (PDMS) e agente de cura. Misture vigorosamente por 3 min.
2. Misture 60 mg de óleo vermelho O em 2,0 g de tolueno. Adicionar 50 μL de óleo vermelho O em solução de tolueno à mistura PDMS. Misture até que haja uma distribuição de cores homogênea para diminuir o espalhamento de luz indesejado e manter o tamanho do ponto focado durante a gelificação no chip.
3. Remova as bolhas colocando a mistura em um exsicador equipado com uma bomba de vácuo.
4. Projete a mistura PDMS no modelo mestre a uma altura de 5-5,5 mm e desgaseifique novamente.
5. Permita que o PDMS cure por 18 h à temperatura ambiente para evitar a degradação do corante diazo.
6. Recorte a estrutura do PDMS e perfure os orifícios de entrada e saída na estrutura usando uma ferramenta de amostragem de núcleo de linha (0,77 mm de diâmetro interno, 1,07 mm de diâmetro externo).
7. Lave o PDMS e cubra o vidro com isopropanol e água deionizada repetidamente 5x e, posteriormente, remova o líquido através do fluxo de ar ou nitrogênio pressionado após cada etapa de lavagem.
8. Trate o vidro seco e o PDMS juntos em um forno de plasma a 0,2 mbar, com um fluxo de oxigênio de 20 mL / min por 60 s a 100 W, e conecte diretamente para ligar o vidro e o PDMS juntos para formar o dispositivo microfluídico.
   NOTA: Evite dobrar a estrutura do PDMS durante o processo de ligação para minimizar a deformação da estrutura do canal.
9. Para tornar hidrofóbicos os canais do chip microfluídico, coloque o dispositivo juntamente com 50 μL de silano tricloro-(1 H,1 H,2H,2 H-perfluoroctil)-num exsicador sob vácuo durante a noite (feche a ligação à bomba depois de diminuir a pressão de vapor). Lave o exterior do dispositivo com hidrofluoroéter.
   CUIDADO: Execute estas etapas em um exaustor e evite qualquer contato com o perfluoro silano. Use um exsicador a vácuo de vidro selado com graxa. Limpe bem o exsicador antes de usar para outros fins.

3. Preparação da solução para microfluídica

1. Para a fase oleosa contínua, misture o óleo de parafina e o hexadecano (1:1 v/v) e adicione 8% (p/p) de um tensoativo não iônico. Encha uma seringa de vidro de 1 mL (primeiro óleo, Figura 1) e uma de 5 mL (segundo óleo, Figura 1).
2. Preparar as soluções pré-poliméricas para a fase de dispersão em frascos de vidro castanho para evitar a decomposição do fotoiniciador e a gelificação não intencional.
   1. Solução de pré-polímero componente amina contendo GRGDS-PC
      1. Para uma solução de 300 μL, pesar 33,3 mg de estrela-polietilenoglicol-acrilato (sPEG-AC) e 3,03 mg de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de lítio (LAP).
      2. Dissolver 18,74 mg de cloridrato de metacrilato de 2-aminoetilo (AMA) em 1,5 mL de água deionizada e passar a solução através de um filtro de seringa (tamanho de poro de 0,20 μm).
         NOTA: O AMA é higroscópico e deve ser descartado assim que o sólido formar grumos no recipiente de armazenamento.
      3. Preparar alíquotas estéreis de 36 mM GRGDS-PC em água e manter a -20 °C até à sua utilização.
      4. Use 291,7 μL da solução AMA para dissolver sPEG-AC e LAP e adicione 8,3 μL da solução GRGDS-PC. Pegue a solução com uma seringa de vidro de 1 mL e proteja da luz usando papel alumínio.
   2. Solução de pré-polímero de componente epóxi
      1. Para uma solução de 300 μL, pesar 33,3 mg de estrela-polietilenoglicol-acrilato (sPEG-AC), 3,03 mg de LAP e dissolver em 300 μL de água deionizada. Adicionar 2,4 mg de metacrilato de glicidil (GMA).
         NOTA: A agitação vigorosa acelera a dissolução do GMA. Pegue a solução com uma seringa de vidro de 1 mL e proteja da luz usando papel alumínio.

4. Produção e purificação de hastes de microgel funcionalizadas com amina e epóxi

Figura 1: Disposição do conjunto de gelificação microfluídica no chip. (A) Vista frontal e visão angular do arranjo do componente durante a microfluídica. (B) Projeto de chip microfluídico usado para gelificação on-chip de hastes de microgel. (1) Tubo de PE para a primeira entrada de óleo. (2) Tubo de PE protegido contra a luz até a entrada da fase dispersa. (3) Tubo de PE para a segunda entrada de óleo. (4) Tubo de PE da saída para o recipiente de recolha do produto. (5) Localização da lâmpada UV e da irradiação no canal reto de 80 μm perto da tomada. (6) Posição objetiva/de observação do microscópio. (7) Componente PDMS colorido do dispositivo microfluídico. (8) Cubra o vidro colado ao PDMS. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Insira as agulhas nos tubos de PE e remova o gás da seringa e do tubo.
2. Insira um tubo de PE na tomada para a coleta do produto.
3. Coloque todas as seringas de vidro nas bombas de seringas e insira cada extremidade da tubulação na entrada correspondente (Figura 1).
   NOTA: Proteja a tubulação de pré-polímero da luz através de folha de alumínio ou um tubo preto para evitar a gelificação não intencional.
4. Concentre o microscópio na seção transversal óleo-água.
5. Inicie a primeira bomba de seringa de óleo (vazão = 100-200 μL/h) para encher o canal com óleo primeiro para evitar a umectação do canal pela fase de dispersão.
6. Diminua a primeira vazão de óleo para 30 μL/h e inicie a bomba de seringa pré-polimérica (vazão = 100-200 μL/h) até que a fase aquosa dispersa possa ser observada na seção transversal.
7. Ajuste a vazão do pré-polímero para 30 μL/h e foque o microscópio na saída.
8. Inicie a segunda bomba de seringa de óleo (vazão de 300 μL/h) e aguarde até que o regime de fluxo esteja estável.
9. Coloque o tubo de saída em um recipiente de coleta.
   NOTA: Coloque a extremidade do tubo na parte superior do recipiente para evitar um aumento de pressão devido ao acúmulo do produto ao longo do tempo.
10. Ajuste o sistema de irradiação UV de modo que a irradiância esteja na faixa de 900-1000 mW/cm 2 (irradiância usada = 957 mW/cm²) e o ponto de irradiação esteja na parte do canal reto antes da saída (Figura 1B).
    NOTA: Certifique-se de não irradiar perto da seção transversal óleo-água para evitar entupir o canal. Para proteção adicional, cubra as estruturas do canal antes do ponto de irradiação na parte superior da unidade.
11. Antes da irradiação UV, ajuste as taxas de fluxo do pré-polímero e do primeiro óleo para atingir a proporção desejada na faixa de 3,0 a 4,5 e defina o tempo de irradiação da fase dispersa para ~2,3 s, dependendo do tamanho do ponto de irradiação.
12. Inicie a irradiação UV e, se necessário, ajuste as taxas de fluxo novamente de acordo com a subseção anterior.
    NOTA: Observe a produção no início e monitore o comportamento estável do fluxo na saída e a uniformidade das hastes de microgel. O segundo fluxo de óleo pode ser ajustado para otimizar o transporte do produto dentro da saída.
13. Altere o contêiner de coleta e anote a hora de início e as taxas de fluxo da coleta do produto.
    NOTA: Proteja o produto do pó. Pare de recolher antes de qualquer seringa ficar com pouca solução.
14. Para encerrar a coleta, remova o contêiner de coleta, anotando a hora. Pare a irradiação e todas as bombas de seringa.
15. Lave o produto posteriormente 5x cada com n-hexano, isopropanol e água deionizada. Remova o sobrenadante após a sedimentação da haste.
    NOTA: Após cada adição da solução, disperse cuidadosamente o produto e aguarde 10 min antes de substituir o solvente, considerando a difusão molecular. Substitua o isopropanol gradualmente por água para evitar que as hastes flutuem para a superfície do líquido. Várias etapas adicionais de lavagem com água diminuem os vestígios de isopropanol restantes.

5. Formação de andaimes macroporosos

1. Determinar o número de hastes de microgel por volume de dispersão para as amostras funcionalizadas de epóxi e amina.
2. Ajustar o número de amostras funcionalizadas com epóxi e amina por diluição ou concentração para um valor semelhante entre 1.000-5.000 hastes/100 μL.
   NOTA: Use uma centrífuga a ~2.000 x g por 5-10 s para acelerar a sedimentação das hastes de microgel. Se o número de hastes por volume de dispersão for baixo, a interligação de hastes pode resultar em aglomerados de hastes menores em vez de uma construção estável. Se o número de hastes por volume de dispersão for alto, a qualidade de mistura dos dois componentes será comprometida.
3. Transfira a dispersão do primeiro componente (~1.200 hastes) para um frasco cônico transparente de 1,5 mL ou 2 mL.
4. Adicionar o segundo componente de forma controlada e em operação contínua (pipeta de 100 μL). Após a adição, misture o conteúdo diretamente usando a pipeta para absorver o líquido e adicione-o novamente. A estrutura interligada se forma em segundos durante a mistura.
   NOTA: Se vários clusters se formarem em vez de uma estrutura coerente, verifique novamente o número de hastes de microgel por volume ou forneça uma mistura mais controlada dos dois componentes.

6. Adesivo celular pós-modificação

1. Calcular o número teórico de grupos epóxi na estrutura interligada com base na taxa de fluxo da fase polimérica dispersa, o número de microgéis coletados durante um tempo específico e o fator de diluição da dispersão do microgel usado para a formação de andaimes.
   NOTA: Aproximar o número teórico de grupos epóxi por andaime pela seguinte equação.
   
   
   n_th: Quantidade teórica de substância
   c_GMA: concentração de GMA em solução de pré-polímero
   Q: Caudal da solução pré-polimérica
2. Adicionar a solução GRGDS-PC à estrutura interligada para modificar todos os grupos epóxi restantes com o peptídeo adesivo celular contendo uma amina livre e tiol (n[grupos epóxi teóricos]/n[GRGDS-PC] = 1). Deixe à temperatura ambiente durante a noite.
3. Remova as moléculas não reagidas lavando com água deionizada e removendo o sobrenadante.

7. Esterilização e transferência para meios de cultura celular

1. Reduza o nível de água para apenas submergir o andaime interligado.
2. Abra o frasco para injetáveis e irradie com luz UV de λ = 250-300 nm. Feche o frasco para injetáveis e transfira-o para uma bancada limpa. Lave 1x com água estéril.
3. Substitua a água do frasco para injetáveis por meios de cultura celular e deixe o equilíbrio durante 5 minutos. Repita isso com meios de cultura de células frescas 2x.
4. Transfira o andaime macroporoso para uma placa de poço de cultura celular para o experimento derramando ou usando uma espátula.

  

Resultados

Figura 2: Estrutura macroporosa de andaimes reticulados . (A) Projeção 3D de uma pilha Z de microscopia confocal de 500 μm do andaime macroporoso interligado. A barra de escala representa 500 μm. (B) Andaime interligado composto por ~10.000 hastes de microgel em um copo de cobertura retirado diretamente da água...

Discussão

Uma das etapas críticas neste protocolo é a qualidade do metacrilato de 2-aminoetila (AMA) usado como comonômero para a funcionalização primária da amina. O AMA deve ser um pó de grão fino e, de preferência, incolor entregue em um recipiente de vidro marrom à prova de gás. Deve-se evitar o uso de material esverdeado e irregular, pois prejudica significativamente a reação de gelificação e afeta negativamente a reprodutibilidade dos resultados. Em caso de má gelificação e hastes de microgel instáveis, po...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABIL EM 90	Evonik	144243-53-8	non-ionic surfactant
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride	TCI Chemicals	A3413	>98.0%(T)(HPLC)
8-Arm PEG-acrylate 20 kDa	Biochempeg Scientific Inc.	A88009-20K	≥ 95 %
AutoCAD 2019	Autodesk		computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs
CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter	CHROMAFILCarl Roth GmbH+Co.KG	XH49.1	pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV)
Cover glass	Marienfeld-Superior		type No. 1
EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm	Electron Microscopy Sciences		0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter
Ethanol absolut	VWR Chemicals
FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera	FLIR Systems
Fluoresceinamine isomer I	Sigma-Aldrich	201626
Fluorescein isothiocyanate	Thermo Fisher Scientific	46424
25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles	BD Microlance 3
Glycidyl methacrylate	Sigma-Aldrich	779342	≥97.0% (GC)
GRGDS-PC	CPC Scientific	FIBN-015A
Hamilton 1000 Series Gastight syringes	Thermo Fisher Scientific	10772361/10500052	PFTE Luer-Lock
Hexane	Sigma-Aldrich	1,04,367
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate	Sigma-Aldrich	900889	≥95 %
Motic AE2000 trinocular microscope	Ted Pella, Inc.	22443-12
Novec 7100	Sigma-Aldrich	SHH0002
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O9755
Paraffin	VWR Chemicals	24679320
Pavone Nanoindenter Platform	Optics11Life
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade	dropletex		ID 0.38 mm OD 1.09 mm
2-Propanol	Sigma-Aldrich	190764	ACS reagent, ≥99.5%
Protein LoBind Tubes	Eppendorf	30108132
Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus
RPMI 1640 medium	Gibco	11530586
SYLGARD 184 silicone elastomer kit	Dow SYLGARD	634165S
Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane	Sigma-Aldrich	448931
UVC LED sterilizing box	UVLED Optical Technology Co., Ltd.	9S SZH8-S2