Mikrojel Çubuklardan Birbirine Bağlı Makrogözenekli 3D İskeleler

Özet

Tamamlayıcı reaktif gruplara sahip mikrojel çubuklar, sulu çözeltide birbirine bağlanma kabiliyetine sahip mikroakışkanlar yoluyla üretilir. Anizometrik mikrojeller, küresel tabanlı sistemlere kıyasla daha büyük gözeneklere sahip kararlı yapılara sıkışır ve birbirine bağlanır. GRGDS-PC ile modifiye edilmiş mikrojeller, hücre kültürü için kullanılabilecek makrogözenekli 3D yapılar oluşturur.

Özet

Mikroakışkanlardan gelen iki bileşenli işlevselleştirilmiş mikrojel sistemi, başka katkı maddeleri olmadan sulu çözeltilerde 3D makrogözenekli yapılara hızlı bir şekilde bağlanmayı sağlar. Sürekli foto-başlatılan çip üstü jelasyon, elde edilen yapılar için yapı taşı özelliklerini belirleyen mikrojel en boy oranının varyasyonunu sağlar. Glisidil metakrilat (GMA) veya 2-aminoetil metakrilat (AMA) monomerleri, epoksi veya amin işlevselliği elde etmek için polietilen glikol (PEG) yıldız polimerlerine dayanan mikrojel ağına kopolimerize edilir. İşlevselleştirilmiş mikrojel çubukların sürekli toplanmasını sağlamak için mikroakışkan çıkış yapısına bir odaklama yağı akışı getirilir. Yakın tarihli bir yayına dayanarak, mikrojel çubuk bazlı yapılar birkaç yüz mikrometrelik daha büyük gözeneklerle sonuçlanır ve aynı zamanda küresel tabanlı bir modele kıyasla genel olarak daha yüksek iskele stabilitesine yol açar. Bu sayede ihtiyaç duyulan malzeme miktarını azaltırken daha fazla serbest hacimli daha yüksek hacimli yapılar üretmek mümkündür. Birbirine bağlı makrogözenekli iskeleler hasar görmeden veya parçalanmadan toplanabilir ve taşınabilir. Birbirine bağlanmada yer almayan amin ve epoksi grupları aktif kalır ve modifikasyon sonrası için bağımsız olarak kullanılabilir. Bu protokol, sonraki hücre deneyleri için kullanılabilecek makrogözenekli birbirine bağlı iskeleler oluşturmak için mikrojel çubukların üretimi için optimize edilmiş bir yöntemi açıklamaktadır.

Giriş

3D yapılarda karmaşık işbirlikçi hücre davranışını incelemek için, iskele platformlarının tekrarlanabilirlikte tutarlı performans göstermesi, hücre göçü için uygun geometriye sahip olması ve aynı zamanda canlı doku üzerindeki etkilerini araştırmak için parametre değişikliği açısından belirli bir esnekliğe izin vermesi gerekir¹. Son yıllarda, ilk olarak Segura ve ark. tarafından tanımlanan makrogözenekli tavlanmış parçacıklar (MAP) kavramı, 3D iskele üretimi için verimli ve çok yönlü bir platform haline geldi². Son 3D iskelenin yapı taşları olan mikrojellerin özel bileşimi, yapının sertliği, jel ağının seçici kimyasal reaktivitesi ve iskelenin son gözenek boyutu 2,3,4,5,6 gibi özellikleri önceden tanımlar. İskele-hücre etkileşimleri için ipuçları olarak hücre yapışkan peptitleri, hücre bağlanmasına izin vermek için mikrojellerin polimer ağına dahil edilir ve kültürdeki hücreler üzerindeki spesifik etkilerini araştırmak için değiştirilebilir. 3D iskeleler, kovalent veya supramoleküler bağlar nedeniyle tavlanmış enjekte edilebilir mikrojellerin birbirine bağlanmasıyla stabilize edilir ve hücre kültürü 2,3,5,7,8 için sağlam ve tanımlanmış yapılar elde edilir.

Mikroakışkanlar, tanımlanmış granüler hidrojellerin hazırlanması için en doğru ve uyarlanabilir yöntemlerden biri olarak kendini kanıtlamıştır⁹. Kimyasal, mekanik ve fiziksel monodispersitelerini korurken sürekli bir süreçte gerekli yapı taşlarının daha büyük miktarlarda üretilmesi olasılığı, bu işlemin uygunluğuna önemli ölçüde katkıda bulunur. Ayrıca, üretilen mikrojellerin boyutu ve şekli, yapı taşlarının geometrisini ve dolayısıyla son iskele^1,10'un 3D yapısını belirleyen toplu emülsiyonlar, mikroakışkanlar^, litografi, elektrodinamik püskürtme veya mekanik parçalanma gibi çeşitli yöntemlerle manipüle edilebilir.

Son zamanlarda, başka katkı maddesi olmadan sulu çözeltilerde hızla birbirine bağlanan işlevselleştirilmiş mikrojel çubuklardan oluşan makrogözenekli 3D iskeleler kavramı bildirilmiştir¹¹. Mikrojel çubukların anizotropisi, bu çalışmada küresel mikrojellerin kullanılmasına kıyasla daha yüksek gözeneklilikler ve daha büyük gözenek boyutlarına sahip gözenek dağılımları ile sonuçlanmıştır¹¹. Bu şekilde, daha az malzeme, 3D iskelenin stabilitesini korurken çeşitli gözenek geometrilerine sahip daha büyük gözenekler oluşturur. Sistem, birbiriyle temas ettiğinde birbirine bağlanma reaksiyonu içinde tüketilen tamamlayıcı primer amin ve epoksi fonksiyonel gruplarına sahip iki tip mikrojel çubuktan oluşur. Birbirine bağlanma sürecine katılmayan fonksiyonel gruplar aktif kalır ve hücre yapışkan peptitleri veya diğer biyoaktif faktörlerle seçici post-modifikasyon için kullanılabilir. Fibroblast hücreleri, 3D iskelelerin içinde kültürlendiğinde bağlanır, yayılır ve çoğalır, ilk önce mikrojel yüzeyinde büyür ve 5 gün sonra makrogözeneklerin çoğunu doldurur. İnsan fibroblastları ve insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC'ler) ön ko-kültür çalışması, birbirine bağlı 3D iskelelerde damar benzeri yapıların oluşumu için umut verici sonuçlar göstermiştir¹¹.

Protokol

1. Mikroakışkanlar için gerekli malzeme ve preparatlar

1. Tarif edilen mikroakışkan prosedür için, 1 mL ve 5 mL cam şırıngalar ve şırınga pompaları kullanın. Çip üzerinde damlacık oluşumu, yüksek hızlı bir kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop aracılığıyla gözlemlenir.
2. Bilgisayar destekli bir tasarım yazılımı kullanarak mikroakışkan çip tasarımını (Şekil 1B) oluşturun ve daha önce bildirildiği gibi bir ana şablon üretin¹².
3. 0,13 mm kalınlığında bir kapak camı aracılığıyla 957 mW/^cm2'de ışıma sağlayan, kendi kendine oluşturulmuş bir UV-LED (λ = 365 nm, nokta çapı ~4,7 mm) kullanarak kontrollü UV ışınlaması elde edin.
   NOT: Işınlama sırasında UV-LED ile olası yerel ısı üretimini dikkate alın. Bu durumda, harici hava akımı ile yeterli soğutmayı sağlayın.

2. Mikroakışkan cihaz üretimi

NOT: Mikroakışkan cihaz üretimi önceki bir yayına dayanmaktadır¹³.

1. 20 g 10:1 (kütle ile) polidimetilsiloksan (PDMS) ve kürleme maddesi karışımı hazırlayın. 3 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın.
2. 2.0 g tolüen içinde 60 mg Yağ Kırmızı O karıştırın. PDMS karışımına toluen çözeltisine 50 μL Yağ Kırmızı O ekleyin. İstenmeyen ışık saçılımını azaltmak ve çip üzerinde jelasyon sırasında spot boyutunu odaklanmış halde tutmak için homojen renk dağılımı olana kadar karıştırın.
3. Karışımı vakum pompası ile donatılmış bir kurutucuya yerleştirerek kabarcıkları çıkarın.
4. PDMS karışımını ana şablona 5-5,5 mm yüksekliğe kadar dökün ve tekrar gazdan arındırın.
5. Diyazo boya bozulmasını önlemek için PDMS'nin oda sıcaklığında 18 saat kürlenmesine izin verin.
6. PDMS yapısını kesin ve bir hat çekirdeği örnekleme aleti (0,77 mm iç çap, 1,07 mm dış çap) kullanarak yapıya giriş ve çıkış delikleri delin.
7. PDMS'yi yıkayın ve camı tekrar tekrar izopropanol ve deiyonize suyla 5x örtün ve daha sonra her yıkama adımından sonra sıvıyı basınçlı hava veya azot akışı yoluyla çıkarın.
8. Kuru cam ve PDMS'yi 0,2 mbar'da bir plazma fırında, 100 W'ta 60 s boyunca 20 mL/dak oksijen akışıyla birlikte işleyin ve mikroakışkan cihazı oluşturmak üzere camı ve PDMS'yi birbirine bağlamak için doğrudan bağlayın.
   NOT: Kanal yapısı deformasyonunu en aza indirmek için bağlama işlemi sırasında PDMS yapısını bükmekten kaçının.
9. Mikroakışkan çipin kanallarını hidrofobik hale getirmek için, cihazı 50 μL trikloro-(1 H, 1 H, 2 H, 2 H-perfloroktil)-silan ile birlikte gece boyunca vakum altında bir kurutucuya yerleştirin (buhar basıncını düşürdükten sonra pompa bağlantısını kapatın). Cihazın dışını hidrofloroeter ile durulayın.
   DİKKAT: Bu adımları bir duman davlumbazında uygulayın ve perfloro silan ile herhangi bir temastan kaçının. Gres ile kapatılmış bir cam vakumlu kurutucu kullanın. Başka amaçlar için kullanmadan önce kurutucuyu iyice temizleyin.

3. Mikroakışkanlar için çözelti hazırlama

1. Sürekli yağ fazı için, parafin yağı ve hekzadekan (1: 1 v / v) karıştırın ve% 8 (w / w) iyonik olmayan bir yüzey aktif madde ekleyin. Bir adet 1 mL (birinci yağ, Şekil 1) ve bir adet 5 mL (ikinci yağ, Şekil 1) cam şırıngayı doldurun.
2. Fotobaşlatıcı ayrışmasını ve istenmeyen jelleşmeyi önlemek için kahverengi cam şişelerde dağılım fazı için prepolimer çözeltileri hazırlayın.
   1. GRGDS-PC içeren amin komponent prepolimer çözeltisi
      1. 300 μL'lik bir çözelti için, 33.3 mg yıldız-polietilen glikol-akrilat (sPEG-AC) ve 3.03 mg lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat (LAP) tartın.
      2. 18.74 mg 2-aminoetil metakrilat hidroklorürü (AMA) 1.5 mL deiyonize suda çözün ve çözeltiyi bir şırınga filtresinden (0.20 μm gözenek boyutu) geçirin.
         NOT: AMA higroskopiktir ve katı formlar saklama kabında topaklanır toplanmaz atılmalıdır.
      3. Steril 36 mM GRGDS-PC alikotları suda hazırlayın ve kullanıma kadar -20 ° C'de tutun.
      4. sPEG-AC ve LAP'yi çözmek için 291,7 μL AMA çözeltisi kullanın ve GRGDS-PC çözeltisinden 8,3 μL ekleyin. Çözeltiyi 1 mL cam şırınga ile alın ve alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun.
   2. Epoksi komponent prepolimer çözeltisi
      1. 300 μL'lik bir çözelti için, 33.3 mg yıldız-polietilen glikol-akrilat (sPEG-AC), 3.03 mg LAP tartın ve 300 μL deiyonize suda çözün. 2.4 mg glisidil metakrilat (GMA) ekleyin.
         NOT: Güçlü sarsıntı, GMA'nın çözünmesini hızlandırır. Çözeltiyi 1 mL cam şırınga ile alın ve alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun.

4. Amin ve epoksi işlevselleştirilmiş mikrojel çubukların üretimi ve saflaştırılması

Şekil 1: Mikroakışkan çip üstü jelasyon tertibatının düzenlenmesi . (A) Mikroakışkanlar sırasında bileşen düzenlemesinin önden görünümü ve açılı görünümü. (B) Mikrojel çubukların çip üzerinde jelleştirilmesi için kullanılan mikroakışkan çip tasarımı. (1) İlk yağ girişine PE tüpü. (2) Dispers faz girişine ışık korumalı PE tüpü. (3) İkinci yağ girişine PE tüpü. (4) PE tüpü çıkıştan ürün toplama kabına. (5) UV lambası ve çıkışın yakınındaki düz 80 μm kanalda ışınlama konumu. (6) Mikroskop objektif/gözlem pozisyonu. (7) Mikroakışkan cihazın renkli PDMS bileşeni. (8) PDMS'ye bağlı kapak camı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. İğneleri PE tüplerine yerleştirin ve gazı şırıngadan ve tüpten çıkarın.
2. Ürün toplama için çıkışa bir PE tüp yerleştirin.
3. Tüm cam şırıngaları şırınga pompalarına yerleştirin ve her boru ucunu ilgili girişe yerleştirin (Şekil 1).
   NOT: İstenmeyen jelleşmeyi önlemek için prepolimer boruyu alüminyum folyo veya siyah bir tüp aracılığıyla ışıktan koruyun.
4. Mikroskopu yağ-su kesitine odaklayın.
5. Dispers fazında kanalın ıslanmasını önlemek için kanalı önce yağ ile doldurmak için ilk yağ şırınga pompasını (akış hızı = 100-200 μL / s) çalıştırın.
6. İlk yağ akış hızını 30 μL/s'ye düşürün ve dağılmış sulu faz enine kesitte gözlemlenene kadar prepolimer şırınga pompasını (akış hızı = 100-200 μL/h) çalıştırın.
7. Prepolimer akış hızını 30 μL / s'ye ayarlayın ve mikroskobu çıkışa odaklayın.
8. İkinci yağ şırınga pompasını çalıştırın (akış hızı 300 μL / s) ve akış rejimi stabil olana kadar bekleyin.
9. Çıkış tüpünü bir toplama kabına yerleştirin.
   NOT: Ürünün zamanla birikmesi nedeniyle basınç artışını önlemek için tüpün ucunu kabın üst kısmına yerleştirin.
10. UV ışınlama sistemini, ışıma 900-1000 mW/cm2 aralığında olacak şekilde ayarlayın (kullanılan ışıma = 957 mW/^cm2) ve ışınlama noktası çıkıştan önceki düz kanal kısmında olacak şekilde ayarlayın (Şekil 1B).
    NOT: Kanalın tıkanmasını önlemek için yağ-su kesitinin yakınında ışınlama yapmadığınızdan emin olun. Ek koruma için, ünitenin üstündeki ışınlama noktasından önce kanal yapılarını örtün.
11. UV ışınlamasından önce, istenen en boy oranını 3,0 ila 4,5 aralığında elde etmek için prepolimerin ve ilk yağın akış hızlarını ayarlayın ve ışınlama noktasının boyutuna bağlı olarak dağılmış fazın ışınlama süresini ~ 2,3 s'ye ayarlayın.
12. UV ışınlamasını başlatın ve gerekirse akış hızlarını önceki alt bölüme göre tekrar ayarlayın.
    NOT: Başlangıçta üretimi gözlemleyin ve çıkıştaki kararlı akış davranışını ve mikrojel çubukların homojenliğini izleyin. İkinci yağ akışı, çıkış içindeki ürün taşınmasını optimize etmek için ayarlanabilir.
13. Koleksiyon kapsayıcısını değiştirin ve ürün koleksiyonu başlangıç saatini ve akış hızlarını not edin.
    NOT: Ürünü tozdan koruyun. Herhangi bir şırınga çözelti azalmadan önce toplamayı bırakın.
14. Koleksiyonu sonlandırmak için, saati not ederek koleksiyon kapsayıcısını kaldırın. Işınlamayı ve tüm şırınga pompalarını durdurun.
15. Ürünü daha sonra her biri 5 kat n-hekzan, izopropanol ve deiyonize su ile yıkayın. Çubuk çökelmesinden sonra süpernatantı çıkarın.
    NOT: Her çözelti ilavesinden sonra, ürünü dikkatlice dağıtın ve moleküler difüzyonu göz önünde bulundurarak çözücüyü değiştirmeden önce 10 dakika bekleyin. Çubukların sıvının yüzeyine yüzmesini önlemek için izopropanolü yavaş yavaş suyla değiştirin. Su ile birden fazla ek yıkama adımı, kalan izopropanol izlerini azaltır.

5. Makrogözenekli iskele oluşumu

1. Epoksi ve amin işlevselleştirilmiş numuneler için dispersiyon hacmi başına mikrojel çubuk sayısını belirleyin.
2. Seyreltme veya konsantrasyon yoluyla epoksi ve amin işlevselleştirilmiş numunelerin sayısını 1.000-5.000 çubuk/100 μL arasında benzer bir değere ayarlayın.
   NOT: Mikrojel çubukların çökelmesini hızlandırmak için 5-10 s boyunca ~2.000 x g'de bir santrifüj kullanın. Dağılım hacmi başına çubuk sayısı düşükse, çubuk birbirine bağlanma tek bir kararlı yapı yerine daha küçük çubuk kümelerine neden olabilir. Dağılım hacmi başına çubuk sayısı yüksekse, iki bileşenin karıştırma kalitesi tehlikeye girer.
3. İlk bileşen (~ 1.200 çubuk) dağılımını konik 1,5 mL veya 2 mL şeffaf bir şişeye aktarın.
4. İkinci bileşeni kontrollü bir şekilde sürekli bir çalışmada ekleyin (100 μL pipet). Ekledikten sonra, sıvı almak için içeriği doğrudan pipeti kullanarak karıştırın ve tekrar ekleyin. Birbirine bağlı yapı, karıştırma sırasında saniyeler içinde oluşur.
   NOT: Tek bir tutarlı yapı yerine birden fazla küme oluşursa, hacim başına mikrojel çubuk sayısını yeniden kontrol edin veya iki bileşenin daha kontrollü bir şekilde karıştırılmasını sağlayın.

6. Modifikasyon sonrası hücre yapıştırıcısı

1. Dağılmış polimer fazının akış hızına, belirli bir süre boyunca toplanan mikrojellerin sayısına ve iskele oluşumu için kullanılan mikrojel dispersiyonunun seyreltme faktörüne bağlı olarak birbirine bağlı yapıdaki epoksi gruplarının teorik sayısını hesaplayın.
   NOT: İskele başına epoksi gruplarının teorik sayısını aşağıdaki denklemle yaklaşık olarak belirleyin.
   
   
   _n'inci: Teorik madde miktarı
   c_GMA: Prepolimer çözeltisindeki GMA konsantrasyonu
   S: Prepolimer çözeltisinin akış hızı
2. Kalan tüm epoksi gruplarını serbest amin ve tiol taşıyan hücre yapışkan peptidi ile değiştirmek için birbirine bağlı yapıya GRGDS-PC çözeltisi ekleyin (n [teorik epoksi grupları] / n [GRGDS-PC] = 1). Gece boyunca oda sıcaklığında bırakın.
3. Deiyonize su ile yıkayarak ve süpernatanı çıkararak reaksiyona girmemiş molekülleri çıkarın.

7. Sterilizasyon ve hücre kültürü ortamına transfer

1. Birbirine bağlı iskeleyi suya batırmak için su seviyesini azaltın.
2. Şişeyi açın ve λ = 250-300 nm UV ışığı ile ışınlayın. Şişeyi kapatın ve şişeyi temiz bir tezgaha aktarın. 1x'i steril suyla yıkayın.
3. Şişedeki suyu hücre kültürü ortamı ile değiştirin ve 5 dakika boyunca dengeye izin verin. Bunu taze hücre kültürü ortamı ile 2x tekrarlayın.
4. Makrogözenekli iskeleye, bir spatula dökerek veya kullanarak deney için bir hücre kültürü kuyu plakasına aktarın.

  

Sonuçlar

Resim 2: Makrogözenekli çapraz bağlı iskele yapısı. (A) Birbirine bağlı makrogözenekli iskelenin 500 μm konfokal mikroskopi Z-yığınının 3D projeksiyonu. Ölçek çubuğu 500 μm'yi temsil eder. (B) Doğrudan sudan alınan bir kapak camı üzerinde ~ 10.000 mikrojel çubuktan oluşan birbirine bağlı ...

Tartışmalar

Bu protokoldeki kritik adımlardan biri, birincil amin fonksiyonelleştirmesi için komonomer olarak kullanılan 2-aminoetil metakrilatın (AMA) kalitesidir. AMA, gaz geçirmez kahverengi bir cam kapta verilen ince taneli ve tercihen renksiz bir toz olmalıdır. Yeşilimsi ve topaklı malzeme kullanmaktan kaçınılmalıdır, çünkü jelasyon reaksiyonunu önemli ölçüde bozar ve sonuçların tekrarlanabilirliğini olumsuz yönde etkiler. Zayıf jelleşme ve kararsız mikrojel çubuklar durumunda, tedarikçiyi değiş...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABIL EM 90	Evonik	144243-53-8	non-ionic surfactant
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride	TCI Chemicals	A3413	>98.0%(T)(HPLC)
8-Arm PEG-acrylate 20 kDa	Biochempeg Scientific Inc.	A88009-20K	≥ 95 %
AutoCAD 2019	Autodesk		computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs
CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter	CHROMAFILCarl Roth GmbH+Co.KG	XH49.1	pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV)
Cover glass	Marienfeld-Superior		type No. 1
EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm	Electron Microscopy Sciences		0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter
Ethanol absolut	VWR Chemicals
FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera	FLIR Systems
Fluoresceinamine isomer I	Sigma-Aldrich	201626
Fluorescein isothiocyanate	Thermo Fisher Scientific	46424
25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles	BD Microlance 3
Glycidyl methacrylate	Sigma-Aldrich	779342	≥97.0% (GC)
GRGDS-PC	CPC Scientific	FIBN-015A
Hamilton 1000 Series Gastight syringes	Thermo Fisher Scientific	10772361/10500052	PFTE Luer-Lock
Hexane	Sigma-Aldrich	1,04,367
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate	Sigma-Aldrich	900889	≥95 %
Motic AE2000 trinocular microscope	Ted Pella, Inc.	22443-12
Novec 7100	Sigma-Aldrich	SHH0002
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O9755
Paraffin	VWR Chemicals	24679320
Pavone Nanoindenter Platform	Optics11Life
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade	dropletex		ID 0.38 mm OD 1.09 mm
2-Propanol	Sigma-Aldrich	190764	ACS reagent, ≥99.5%
Protein LoBind Tubes	Eppendorf	30108132
Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus
RPMI 1640 medium	Gibco	11530586
SYLGARD 184 silicone elastomer kit	Dow SYLGARD	634165S
Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane	Sigma-Aldrich	448931
UVC LED sterilizing box	UVLED Optical Technology Co., Ltd.	9S SZH8-S2