Взаимосвязанные макропористые 3D-каркасы из микрогелевых стержней

Резюме

Микрогелевые стержни с комплементарными реакционноспособными группами получают с помощью микрофлюидики со способностью соединяться в водном растворе. Анизометрические микрогели заклинивают и соединяются в стабильные конструкции с большими порами по сравнению со сферическими системами. Микрогели, модифицированные с помощью GRGDS-PC, образуют макропористые 3D-конструкции, которые могут быть использованы для клеточной культуры.

Аннотация

Двухкомпонентная система функционализированных микрогелей из микрофлюидики позволяет быстро соединяться в 3D макропористые конструкции в водных растворах без дополнительных добавок. Непрерывное фотоиницированное гелеобразование на кристалле позволяет изменять соотношение сторон микрогеля, что определяет свойства строительных блоков для полученных конструкций. Мономеры глицидилметакрилата (GMA) или 2-аминоэтилметакрилата (AMA) сополимеризуются в микрогелевую сеть на основе звездополимеров полиэтиленгликоля (PEG) для достижения эпоксидной или аминной функциональности. Фокусирующий поток масла вводится в микрофлюидную выходную структуру для обеспечения непрерывного сбора функционализированных микрогелевых стержней. Основываясь на недавней публикации, конструкции на основе микрогелевых стержней приводят к увеличению пор в несколько сотен микрометров и, в то же время, приводят к общей более высокой стабильности каркаса по сравнению со сферической моделью. Таким образом, можно производить конструкции большего объема с большим свободным объемом при одновременном уменьшении количества необходимого материала. Взаимосвязанные макропористые каркасы могут быть подобраны и транспортированы без повреждения или распада. Аминная и эпоксидная группы, не участвующие во взаимосвязи, остаются активными и могут использоваться независимо для постмодификации. Этот протокол описывает оптимизированный метод изготовления микрогелевых стержней для формирования макропористых взаимосвязанных каркасов, которые могут быть использованы для последующих клеточных экспериментов.

Введение

Для изучения сложного кооперативного поведения клеток в 3D-конструкциях платформы каркасов должны демонстрировать последовательную производительность в воспроизводимости, иметь подходящую геометрию для миграции клеток и, в то же время, обеспечивать определенную гибкость с точки зрения изменения параметров для исследования их влияния на живую ткань¹. В последние годы концепция макропористых отожженных частиц (MAP), впервые описанная Segura et al., превратилась в эффективную и универсальную платформу для производства 3D-лесов². Индивидуальный состав микрогелей, которые являются строительными блоками конечного 3D-каркаса, предопределяет такие свойства, как жесткость конструкции, селективная химическая реакционная способность гелевой сети и конечный размер пор каркаса 2,3,4,5,6. Клеточные адгезивные пептиды в качестве сигналов для взаимодействия каркаса и клетки включены в полимерную сеть микрогелей, чтобы обеспечить прикрепление клеток, и могут быть изменены для исследования их специфического воздействия на клетки в культуре. 3D-каркасы стабилизируются путем соединения отожженных инъекционных микрогелей за счет ковалентных или супрамолекулярных связей, в результате чего образуются прочные и определенные конструкции для клеточной культуры 2,3,5,7,8.

Микрофлюидика зарекомендовала себя как один из наиболее точных и адаптируемых методов получения определенных гранулированных гидрогелей⁹. Возможность производства большего количества необходимых строительных блоков в непрерывном процессе при сохранении их химической, механической и физической монодисперсности существенно способствует пригодности этого процесса. Кроме того, размером и формой полученных микрогелей можно манипулировать различными методами, такими как периодические эмульсии, микрофлюидика, литография, электродинамическое напыление или механическая фрагментация, которые определяют геометрию строительных блоков и, таким образом, 3D-структуру конечного каркаса ^1,10.

Недавно сообщалось о концепции макропористых 3D-каркасов, состоящих из функционализированных микрогелевых стержней, которые быстро соединяются в водных растворах без дальнейших добавок¹¹. Анизотропия микрогелевых стержней привела к более высокой пористости и распределению пор с большими размерами пор по сравнению с использованием сферических микрогелей в этом исследовании¹¹. Таким образом, меньшее количество материала создает более крупные поры с различными геометриями пор, сохраняя при этом стабильность 3D-каркаса. Система состоит из двух типов микрогелевых стержней с комплементарными первичными аминовыми и эпоксидными функциональными группами, которые потребляются в рамках взаимосвязанной реакции при контакте друг с другом. Функциональные группы, которые не участвуют в процессе взаимосвязи, остаются активными и могут быть использованы для селективной постмодификации с клеточными адгезивными пептидами или другими биологически активными факторами. Клетки фибробластов прикрепляются, распространяются и размножаются при культивировании внутри 3D-каркасов, сначала вырастая на поверхности микрогеля и заполняя большую часть макропор через 5 дней. Предварительное кокультурное исследование фибробластов человека и эндотелиальных клеток пупочных вен человека (HUVECs) показало многообещающие результаты для формирования сосудоподобных структур во взаимосвязанных 3D-каркасах¹¹.

протокол

1. Необходимый материал и препараты для микрофлюидики

1. Для описанной микрофлюидной процедуры используют стеклянные шприцы 1 мл и 5 мл и шприцевые насосы. Образование капель на чипе наблюдается с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного высокоскоростной камерой.
2. Создайте микрофлюидную конструкцию чипа (рисунок 1B) с помощью программного обеспечения для автоматизированного проектирования и создайте главный шаблон, как уже сообщалось¹².
3. Достигайте контролируемого УФ-облучения с помощью собственного УФ-светодиода (λ = 365 нм, диаметр пятна ~ 4,7 мм), обеспечивающего излучение при 957 мВт/^см2 через покровное стекло толщиной 0,13 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывайте возможную локальную выработку тепла УФ-светодиодом во время облучения. В этом случае обеспечьте достаточное охлаждение внешним воздушным потоком.

2. Производство микрофлюидных устройств

ПРИМЕЧАНИЕ: Производство микрофлюидных устройств основано на предыдущей публикации¹³.

1. Готовят 20 г смеси полидиметилсилоксана (PDMS) и отверждающего агента 10:1 (по массе). Энергично перемешать в течение 3 мин.
2. Смешайте 60 мг масла Red O с 2,0 г толуола. Добавьте 50 мкл масла Red O в растворе толуола в смесь PDMS. Перемешивайте до однородного распределения цвета, чтобы уменьшить нежелательное рассеяние света и сохранить размер пятна сфокусированным во время гелеобразования на чипе.
3. Удалите пузырьки, поместив смесь в осушитель, оснащенный вакуумным насосом.
4. Отлить смесь PDMS в мастер-шаблон на высоту 5-5,5 мм и снова дегазировать.
5. Дайте PDMS отверждаться в течение 18 ч при комнатной температуре, чтобы избежать деградации диазокрасителя.
6. Вырежьте структуру PDMS и продувите входные и выходные отверстия в конструкции с помощью инструмента для отбора проб линейного керна (внутренний диаметр 0,77 мм, наружный диаметр 1,07 мм).
7. Промыть PDMS и покрыть стекло изопропанолом и деионизированной водой несколько раз в 5 раз и, впоследствии, удалить жидкость через поток напорного воздуха или азота после каждого этапа промывки.
8. Обработайте сухое стекло и PDMS вместе в плазменной печи при 0,2 мбар, с потоком кислорода 20 мл / мин в течение 60 с при 100 Вт, и соедините непосредственно, чтобы связать стекло и PDMS вместе, чтобы сформировать микрофлюидное устройство.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте изгиба структуры PDMS во время процесса связывания, чтобы свести к минимуму деформацию структуры канала.
9. Чтобы сделать каналы микрофлюидного чипа гидрофобными, поместите устройство вместе с 50 мкл трихлор-(1H,1 H,2 H,2 H-перфторктил)-силана в осушитель под вакуумом на ночь (закройте соединение с насосом после снижения давления паров). Промыть внешнюю часть прибора гидрофторэфиром.
   ВНИМАНИЕ: Выполните эти шаги в вытяжной вытяжке и избегайте любого контакта с перфторсиланом. Используйте стеклянный вакуумный осушитель, герметичный смазкой. Тщательно очистите осушитель перед использованием в других целях.

3. Приготовление раствора для микрофлюидики

1. Для непрерывной масляной фазы смешайте парафиновое масло и гексадекан (1:1 об/об) и добавьте 8% (мас./мас.) неионного поверхностно-активного вещества. Наполните один стеклянный шприц 1 мл (первое масло, рисунок 1) и один стеклянный шприц объемом 5 мл (второе масло, рисунок 1).
2. Подготовьте растворы преполимеров для дисперсной фазы во флаконах из коричневого стекла для предотвращения разложения фотоинициатора и непреднамеренного гелеобразования.
   1. Раствор аминного компонента преполимера, содержащий GRGDS-PC
      1. Для раствора 300 мкл взвесьте 33,3 мг звездо-полиэтиленгликоль-акрилата (sPEG-AC) и 3,03 мг фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфината лития (LAP).
      2. Растворить 18,74 мг 2-аминоэтилметакрилата гидрохлорида (АМА) в 1,5 мл деионизированной воды и пропустить раствор через шприцевой фильтр (размер пор 0,20 мкм).
         ПРИМЕЧАНИЕ: АМА является гигроскопичной и должна быть выброшена, как только твердое вещество образует комочки в контейнере для хранения.
      3. Приготовьте стерильные 36 мМ аликвоты GRGDS-PC в воде и держите при температуре −20 °C до использования.
      4. Используйте 291,7 мкл раствора АМА для растворения sPEG-AC и LAP и добавьте 8,3 мкл раствора GRGDS-PC. Возьмите раствор стеклянным шприцем объемом 1 мл и защитите от света с помощью алюминиевой фольги.
   2. Раствор преполимера эпоксидных компонентов
      1. Для приготовления раствора 300 мкл взвесьте 33,3 мг звездчатого полиэтиленгликоля-акрилата (sPEG-AC), 3,03 мг LAP и растворите в 300 мкл деионизированной воды. Добавьте 2,4 мг глицидилметакрилата (GMA).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Сильное встряхивание ускоряет растворение ГМА. Возьмите раствор стеклянным шприцем объемом 1 мл и защитите от света с помощью алюминиевой фольги.

4. Производство и очистка аминных и эпоксидных функционализированных микрогелевых стержней

Рисунок 1: Расположение микрофлюидного узла гелеобразования на кристалле. (A) Вид спереди и угловой вид расположения компонентов во время микрофлюидики. (B) Микрофлюидная конструкция чипа, используемая для гелеобразования микрогелевых стержней. (1) Полиэтиленовая трубка к первому входному отверстию масла. (2) Светонепроницаемая полиэтиленовая трубка на входе дисперсной фазы. (3) Полиэтиленовая трубка ко второму входному отверстию масла. (4) Полиэтиленовая трубка от выхода до контейнера для сбора продукта. (5) УФ-лампа и место облучения на прямом канале 80 мкм вблизи выходного отверстия. (6) Объективная/наблюдательная позиция микроскопа. (7) Цветной компонент PDMS микрофлюидного устройства. (8) Закройте стекло, прикрепленное к PDMS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Вставьте иглы в полиэтиленовые трубки и удалите газ из шприца и трубки.
2. Вставьте полиэтиленовую трубку в розетку для сбора продукта.
3. Поместите все стеклянные шприцы в шприцевые насосы и вставьте каждый конец трубки в соответствующее входное отверстие (рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите трубку преполимера от света с помощью алюминиевой фольги или черной трубки, чтобы избежать непреднамеренного гелеобразования.
4. Наведите микроскоп на поперечное сечение масло-вода.
5. Запустите первый масляный шприцевой насос (расход = 100-200 мкл/ч), чтобы сначала заполнить канал маслом, чтобы предотвратить смачивание канала дисперсной фазой.
6. Уменьшите первый расход масла до 30 мкл/ч и запустите шприцевый насос преполимера (расход = 100-200 мкл/ч) до тех пор, пока дисперсная водная фаза не будет наблюдаться на поперечном сечении.
7. Установите скорость потока преполимера на 30 мкл/ч и сфокусируйте микроскоп на выходе.
8. Запустите второй масляный шприцевой насос (расход 300 мкл/ч) и подождите, пока режим потока стабилизируется.
9. Поместите выпускную трубку в контейнер для сбора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите конец трубки в верхнюю часть контейнера, чтобы избежать повышения давления из-за накопления продукта с течением времени.
10. Установите систему УФ-облучения таким образом, чтобы интенсивность излучения находилась в диапазоне 900-1000 мВт/^см2 (используемое излучение = 957 мВт/^см2), а пятно облучения находилось в прямой канальной части перед выходом (рисунок 1В).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы не облучаете вблизи поперечного сечения масла и воды, чтобы избежать засорения канала. Для дополнительной защиты накройте канальные конструкции перед местом облучения в верхней части блока.
11. Перед УФ-облучением отрегулируйте скорость потока преполимера и первого масла для достижения желаемого соотношения сторон в диапазоне от 3,0 до 4,5, и установите время облучения дисперсной фазы на ~2,3 с, в зависимости от размера точки облучения.
12. Начните УФ-облучение и при необходимости снова отрегулируйте скорость потока в соответствии с предыдущим подразделом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за производством в начале и следите за стабильным поведением потока на выходе и однородностью микрогелевых стержней. Второй поток масла может быть отрегулирован для оптимизации транспортировки продукта в пределах выхода.
13. Измените контейнер сбора и запишите время начала сбора продукта и скорость потока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите продукт от пыли. Прекратите собирать до того, как какой-либо шприц закончится раствором.
14. Чтобы завершить сбор, удалите контейнер коллекции, отметив время. Остановите облучение и все шприцевые насосы.
15. Затем промыть продукт по 5 раз н-гексаном, изопропанолом и деионизированной водой. Удалить надосадочный наполнитель после стержневого осаждения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После каждого добавления раствора тщательно диспергируйте продукт и подождите 10 мин перед заменой растворителя, учитывая молекулярную диффузию. Постепенно заменяйте изопропанол водой, чтобы стержни не всплывали на поверхность жидкости. Несколько дополнительных этапов промывки водой уменьшают оставшиеся следы изопропанола.

5. Формирование макропористых лесов

1. Определите количество микрогелевых стержней на объем дисперсии для эпоксидных и аминно-функционализированных образцов.
2. Отрегулируйте количество эпоксидных и аминных функционализированных образцов путем разбавления или концентрации до аналогичного значения между 1000-5000 стержней на 100 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте центрифугу при ~2000 х г в течение 5-10 с, чтобы ускорить осаждение микрогелевых стержней. Если количество стержней на объем дисперсии низкое, взаимосвязь стержней может привести к меньшим кластерам стержней вместо одной стабильной конструкции. Если количество стержней на объем дисперсии велико, качество смешивания двух компонентов будет нарушено.
3. Перенесите дисперсию первого компонента (~1 200 стержней) в конический прозрачный флакон объемом 1,5 мл или 2 мл.
4. Добавьте второй компонент контролируемым образом в непрерывной работе (пипетка 100 мкл). После добавления перемешайте содержимое непосредственно с помощью пипетки, чтобы взять жидкость и добавить ее снова. Взаимосвязанная структура образуется в течение нескольких секунд во время смешивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если вместо одной когерентной структуры образуется несколько кластеров, перепроверьте количество микрогелевых стержней на объем или обеспечьте более контролируемое смешивание двух компонентов.

6. Клеточный клей после модификации

1. Рассчитать теоретическое число эпоксидных групп во взаимосвязанной структуре на основе расхода дисперсной полимерной фазы, количества микрогелей, собранных в течение определенного времени, и коэффициента разбавления дисперсии микрогеля, используемой для формирования каркаса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аппроксимируйте теоретическое число эпоксидных групп на каркас по следующему уравнению.
   
   
   n_th: Теоретическое количество вещества
   c_GMA: концентрация ГМА в растворе преполимера
   Q: Расход раствора преполимера
2. Добавить раствор GRGDS-PC во взаимосвязанную структуру для изменения всех оставшихся эпоксидных групп клеточным адгезивным пептидом, содержащим свободный амин и тиол (n[теоретические эпоксидные группы]/n[GRGDS-PC] = 1). Оставить при комнатной температуре на ночь.
3. Удалите непрореагировавшие молекулы, промыв деионизированной водой и удалив супернатант.

7. Стерилизация и перенос в клеточные питательные среды

1. Уменьшите уровень воды, чтобы просто погрузить взаимосвязанные леса.
2. Открыть флакон и облучить ультрафиолетовым светом λ = 250-300 нм. Закройте флакон и переложите флакон на чистую скамейку. Промыть 1x стерильной водой.
3. Замените воду во флаконе средой для культивирования клеток и обеспечьте уравновешивание в течение 5 минут. Повторите это со свежими клеточными культуральными средами 2x.
4. Переложите макропористый каркас в пластину колодца клеточной культуры для эксперимента путем заливки или с помощью шпателя.

  

Результаты

Рисунок 2: Макропористая сшитая структура каркаса. (A) 3D-проекция 500 мкм конфокальной микроскопии Z-стека взаимосвязанного макропористого каркаса. Шкала представляет собой 500 мкм. (

Обсуждение

Одним из критических шагов в этом протоколе является качество 2-аминоэтилметакрилата (АМА), используемого в качестве сомономера для функционализации первичного амина. АМА должен представлять собой мелкозернистый и предпочтительно бесцветный порошок, поставляемый в газонепроницаемо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABIL EM 90	Evonik	144243-53-8	non-ionic surfactant
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride	TCI Chemicals	A3413	>98.0%(T)(HPLC)
8-Arm PEG-acrylate 20 kDa	Biochempeg Scientific Inc.	A88009-20K	≥ 95 %
AutoCAD 2019	Autodesk		computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs
CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter	CHROMAFILCarl Roth GmbH+Co.KG	XH49.1	pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV)
Cover glass	Marienfeld-Superior		type No. 1
EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm	Electron Microscopy Sciences		0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter
Ethanol absolut	VWR Chemicals
FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera	FLIR Systems
Fluoresceinamine isomer I	Sigma-Aldrich	201626
Fluorescein isothiocyanate	Thermo Fisher Scientific	46424
25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles	BD Microlance 3
Glycidyl methacrylate	Sigma-Aldrich	779342	≥97.0% (GC)
GRGDS-PC	CPC Scientific	FIBN-015A
Hamilton 1000 Series Gastight syringes	Thermo Fisher Scientific	10772361/10500052	PFTE Luer-Lock
Hexane	Sigma-Aldrich	1,04,367
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate	Sigma-Aldrich	900889	≥95 %
Motic AE2000 trinocular microscope	Ted Pella, Inc.	22443-12
Novec 7100	Sigma-Aldrich	SHH0002
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O9755
Paraffin	VWR Chemicals	24679320
Pavone Nanoindenter Platform	Optics11Life
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade	dropletex		ID 0.38 mm OD 1.09 mm
2-Propanol	Sigma-Aldrich	190764	ACS reagent, ≥99.5%
Protein LoBind Tubes	Eppendorf	30108132
Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus
RPMI 1640 medium	Gibco	11530586
SYLGARD 184 silicone elastomer kit	Dow SYLGARD	634165S
Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane	Sigma-Aldrich	448931
UVC LED sterilizing box	UVLED Optical Technology Co., Ltd.	9S SZH8-S2