Échafaudages 3D macroporeux interconnectés à partir de tiges de microgel

Résumé

Les tiges de microgel avec des groupes réactifs complémentaires sont produites via la microfluidique avec la capacité de s’interconnecter en solution aqueuse. Les microgels anisométriques se coincent et s’interconnectent en constructions stables avec des pores plus grands par rapport aux systèmes sphériques. Les microgels modifiés avec GRGDS-PC forment des constructions 3D macroporeuses qui peuvent être utilisées pour la culture cellulaire.

Résumé

Un système à deux composants de microgels fonctionnalisés issus de la microfluidique permet une interconnexion rapide dans des constructions macroporeuses 3D dans des solutions aqueuses sans autres additifs. La gélification continue sur puce photoinitiée permet de faire varier le rapport d’aspect du microgel, ce qui détermine les propriétés des blocs de construction pour les constructions obtenues. Les monomères de méthacrylate de glycidyle (GMA) ou de méthacrylate de 2-aminoéthyle (AMA) sont copolymérisés dans le réseau de microgels à base de polymères étoilés de polyéthylèneglycol (PEG) pour obtenir une fonctionnalité époxy ou amine. Un flux d’huile de focalisation est introduit dans la structure de sortie microfluidique pour assurer une collecte continue des tiges de microgel fonctionnalisées. Sur la base d’une publication récente, les constructions à base de tiges de microgel entraînent des pores plus grands de plusieurs centaines de micromètres et, en même temps, conduisent à une stabilité globale plus élevée de l’échafaudage par rapport à un modèle sphérique. De cette façon, il est possible de produire des constructions à volume plus élevé avec plus de volume libre tout en réduisant la quantité de matériau nécessaire. Les échafaudages macroporeux interconnectés peuvent être ramassés et transportés sans dommage ni désintégration. Les groupes amine et époxy non impliqués dans l’interconnexion restent actifs et peuvent être utilisés indépendamment pour la post-modification. Ce protocole décrit une méthode optimisée pour la fabrication de tiges de microgel pour former des échafaudages macroporeux interconnectés qui peuvent être utilisés pour des expériences cellulaires ultérieures.

Introduction

Pour étudier le comportement coopératif complexe des cellules dans les constructions 3D, les plates-formes d’échafaudage doivent montrer des performances constantes en termes de reproductibilité, avoir une géométrie appropriée pour la migration cellulaire et, en même temps, permettre une certaine flexibilité en termes d’altération des paramètres pour étudier leur influence sur le tissu vivant¹. Au cours des dernières années, le concept de particules recuites macroporeuses (MAP), décrit pour la première fois par Segura et al., s’est développé en une plate-forme efficace et polyvalente pour la production d’échafaudages 3D². La composition sur mesure des microgels, qui sont les éléments constitutifs de l’échafaudage 3D final, prédéfinit des propriétés telles que la rigidité de la construction, la réactivité chimique sélective du réseau de gel et la taille finale des pores de l’échafaudage 2,3,4,5,6. Les peptides adhésifs cellulaires en tant que signaux pour les interactions échafaudage-cellule sont incorporés dans le réseau polymère des microgels pour permettre la fixation cellulaire et peuvent être modifiés pour étudier leurs effets spécifiques sur les cellules en culture. Les échafaudages 3D sont stabilisés par interconnexion des microgels injectables recuits grâce à des liaisons covalentes ou supramoléculaires, ce qui donne des constructions robustes et définies pour la culture cellulaire 2,3,5,7,8.

La microfluidique s’est imposée comme l’une des méthodes les plus précises et les plus adaptables pour la préparation d’hydrogels granulaires définis⁹. La possibilité de produire de plus grandes quantités des blocs de construction requis dans un processus continu tout en maintenant leur monodispersité chimique, mécanique et physique contribue considérablement à la pertinence de ce processus. De plus, la taille et la forme des microgels produits peuvent être manipulées par diverses méthodes telles que les émulsions discontinues, la microfluidique, la lithographie, la pulvérisation électrodynamique ou la fragmentation mécanique, qui déterminent la géométrie des blocs de construction et, par conséquent, la structure 3D de l’échafaudage final ^1,10.

Récemment, le concept d’échafaudages 3D macroporeux composés de tiges de microgel fonctionnalisées qui s’interconnectent rapidement dans des solutions aqueuses sans autres additifs a été rapporté¹¹. L’anisotropie des tiges de microgel a entraîné des porosités et des distributions de pores plus élevées avec des tailles de pores plus grandes par rapport à l’utilisation de microgels sphériques dans cette étude¹¹. De cette façon, moins de matériau crée des pores plus grands avec une variété de géométries de pores différentes tout en maintenant la stabilité de l’échafaudage 3D. Le système se compose de deux types de tiges de microgel avec des groupes fonctionnels primaires complémentaires d’amine et d’époxy qui sont consommés dans la réaction d’interconnexion lorsqu’ils entrent en contact les uns avec les autres. Les groupes fonctionnels qui ne participent pas au processus d’interconnexion restent actifs et peuvent être utilisés pour une post-modification sélective avec des peptides adhésifs cellulaires ou d’autres facteurs bioactifs. Les cellules fibroblastiques se fixent, se propagent et prolifèrent lorsqu’elles sont cultivées à l’intérieur des échafaudages 3D, se développant d’abord sur la surface du microgel et remplissant la plupart des macropores après 5 jours. Une étude préliminaire de co-culture de fibroblastes humains et de cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines (HUVEC) a montré des résultats prometteurs pour la formation de structures en forme de vaisseaux dans les échafaudages 3D interconnectés¹¹.

Protocole

1. Matériel et préparations nécessaires pour la microfluidique

1. Pour la procédure microfluidique décrite, utiliser des seringues en verre de 1 mL et 5 mL et des pousse-seringues. La formation de gouttelettes sur puce est observée à l’aide d’un microscope inversé équipé d’une caméra à haute vitesse.
2. Créer la conception de la puce microfluidique (Figure 1B) à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur et produire un gabarit maître comme déjà indiqué¹².
3. Obtenez une irradiation UV contrôlée à l’aide d’une LED UV auto-construite (λ = 365 nm, diamètre du spot ~4,7 mm) fournissant un éclairement énergétique à 957 mW/cm² à travers un verre de couverture de 0,13 mm d’épaisseur.
   REMARQUE: Tenez compte de la production de chaleur locale possible par la LED UV pendant l’irradiation. Si tel est le cas, assurez-vous d’un refroidissement suffisant par un flux d’air externe.

2. Production de dispositifs microfluidiques

NOTE: La production de dispositifs microfluidiques est basée sur une publication précédente¹³.

1. Préparer 20 g d’un mélange 10:1 (en masse) de polydiméthylsiloxane (PDMS) et d’agent de durcissement. Mélanger vigoureusement pendant 3 min.
2. Mélanger 60 mg d’Oil Red O dans 2,0 g de toluène. Ajouter 50 μL d’Oil Red O dans une solution de toluène au mélange PDMS. Mélanger jusqu’à ce qu’il y ait une distribution homogène des couleurs pour réduire la diffusion indésirable de la lumière et garder la taille du point concentrée pendant la gélification sur puce.
3. Enlevez les bulles en plaçant le mélange dans un dessiccateur équipé d’une pompe à vide.
4. Lancez le mélange PDMS dans le gabarit maître à une hauteur de 5 à 5,5 mm et dégazez à nouveau.
5. Laisser durcir le PDMS pendant 18 h à température ambiante pour éviter la dégradation du colorant diazoélectrique.
6. Découpez la structure PDMS et percez les trous d’entrée et de sortie dans la structure à l’aide d’un outil d’échantillonnage de carotte de ligne (0,77 mm de diamètre intérieur, 1,07 mm de diamètre extérieur).
7. Lavez le PDMS et couvrez le verre avec de l’isopropanol et de l’eau désionisée à plusieurs reprises 5x et, par la suite, retirez le liquide par un flux d’air sous pression ou d’azote après chaque étape de lavage.
8. Traiter le verre sec et le PDMS ensemble dans une étuve plasma à 0,2 mbar, avec un débit d’oxygène de 20 mL/min pendant 60 s à 100 W, et connecter directement pour lier le verre et le PDMS ensemble pour former le dispositif microfluidique.
   REMARQUE: Évitez de plier la structure PDMS pendant le processus de liaison pour minimiser la déformation de la structure du canal.
9. Pour rendre les canaux de la puce microfluidique hydrophobes, placez le dispositif avec 50 μL de trichloro-(1 H,1 H,2 H,2 H-perfluoroctyl)-silane dans un dessiccateur sous vide pendant une nuit (fermez le raccordement à la pompe après avoir diminué la pression de vapeur). Rincez l’extérieur de l’appareil avec de l’hydrofluoroéther.
   ATTENTION : Effectuez ces étapes dans une hotte et évitez tout contact avec le silane perfluoré. Utilisez un dessiccateur sous vide en verre scellé avec de la graisse. Nettoyez soigneusement le dessiccateur avant de l’utiliser à d’autres fins.

3. Préparation de la solution pour la microfluidique

1. Pour la phase d’huile continue, mélanger l’huile de paraffine et l’hexadécane (1:1 v/v) et ajouter 8 % (p/p) d’un tensioactif non ionique. Remplissez une seringue en verre de 1 mL ( première huile, figure 1) et une seringue en verre de 5 ml (deuxième huile, figure 1).
2. Préparer les solutions de prépolymère pour la phase dispersée dans des flacons en verre brun afin d’éviter la décomposition du photoinitiateur et la gélification involontaire.
   1. Solution de prépolymère de composant amine contenant GRGDS-PC
      1. Pour une solution de 300 μL, peser 33,3 mg d’acrylate de polyéthylène glycol étoilé (sPEG-AC) et 3,03 mg de phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate de lithium (LAP).
      2. Dissoudre 18,74 mg de chlorhydrate de méthacrylate de 2-aminoéthyle (AMA) dans 1,5 mL d’eau désionisée et faire passer la solution à travers un filtre à seringue (taille des pores de 0,20 μm).
         REMARQUE: AMA est hygroscopique et doit être jeté dès que les formes solides grumeaux dans le récipient de stockage.
      3. Préparer des aliquotes stériles de 36 mM GRGDS-PC dans de l’eau et conserver à −20 °C jusqu’à utilisation.
      4. Utiliser 291,7 μL de la solution AMA pour dissoudre sPEG-AC et LAP, et ajouter 8,3 μL de la solution GRGDS-PC. Prenez la solution avec une seringue en verre de 1 mL et protégez-la de la lumière à l’aide d’une feuille d’aluminium.
   2. Solution de prépolymère de composant époxy
      1. Pour une solution de 300 μL, peser 33,3 mg d’acrylate de polyéthylène glycol étoilé (sPEG-AC), 3,03 mg de LAP et dissoudre dans 300 μL d’eau désionisée. Ajouter 2,4 mg de méthacrylate de glycidyle (GMA).
         NOTE: Une secousse vigoureuse accélère la dissolution de GMA. Prenez la solution avec une seringue en verre de 1 mL et protégez-la de la lumière à l’aide d’une feuille d’aluminium.

4. Production et purification de tiges de microgel fonctionnalisées en amine et en époxy

Figure 1 : Disposition de l’ensemble de gélification microfluidique sur puce. (A) Vue de face et vue inclinée de la disposition des composants pendant la microfluidique. (B) Conception de puce microfluidique utilisée pour la gélification sur puce de tiges de microgel. (1) Tube PE jusqu’à la première entrée d’huile. (2) Tube PE protégé contre la lumière jusqu’à l’entrée de la phase dispersée. (3) Tube PE jusqu’à la deuxième entrée d’huile. (4) Tube en PE de la sortie au récipient de collecte du produit. (5) Lampe UV et emplacement d’irradiation sur le canal droit de 80 μm près de la sortie. (6) Position de l’objectif/observation du microscope. (7) Composant PDMS coloré du dispositif microfluidique. (8) Verre de couverture collé au PDMS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Insérez les aiguilles dans les tubes en PE et retirez le gaz de la seringue et du tube.
2. Insérez un tube en PE dans la sortie pour la collecte du produit.
3. Placez toutes les seringues en verre dans les pompes à seringue et insérez chaque extrémité de tube dans l’entrée correspondante (Figure 1).
   REMARQUE: Protégez le tube de prépolymère de la lumière via une feuille d’aluminium ou un tube noir pour éviter une gélification involontaire.
4. Focalisez le microscope sur la section efficace huile-eau.
5. Démarrez la première pompe à seringue d’huile (débit = 100-200 μL/h) pour remplir d’abord le canal d’huile afin d’éviter le mouillage du canal par la phase dispersée.
6. Diminuer le premier débit d’huile à 30 μL/h et démarrer la pompe à seringue prépolymère (débit = 100-200 μL/h) jusqu’à ce que la phase aqueuse dispersée puisse être observée à la section transversale.
7. Réglez le débit du prépolymère à 30 μL/h et focalisez le microscope sur la sortie.
8. Démarrez la deuxième pompe à seringue d’huile (débit de 300 μL/h) et attendez que le régime d’écoulement soit stable.
9. Placez le tube de sortie dans un récipient de collecte.
   NOTE: Placez l’extrémité du tube dans la partie supérieure du récipient pour éviter une augmentation de pression due à l’accumulation du produit au fil du temps.
10. Régler le système d’irradiation UV de telle sorte que l’éclairement énergétique soit compris entre 900 et 1000 mW/^cm2 (irradiance utilisée = 957 mW/cm²) et que la tache d’irradiation se trouve dans la partie du canal droit avant la sortie (figure 1B).
    REMARQUE: Assurez-vous de ne pas irradier près de la section huile-eau pour éviter d’obstruer le canal. Pour une protection supplémentaire, couvrir les structures du canal avant la tache d’irradiation sur le dessus de l’appareil.
11. Avant l’irradiation UV, régler les débits du prépolymère et de la première huile pour obtenir le rapport d’aspect souhaité dans la plage de 3,0 à 4,5, et régler le temps d’irradiation de la phase dispersée à ~2,3 s, en fonction de la taille du point d’irradiation.
12. Démarrez l’irradiation UV et, si nécessaire, ajustez à nouveau les débits conformément à la sous-section précédente.
    REMARQUE: Observez la production au début et surveillez le comportement stable de l’écoulement dans la sortie et l’uniformité des tiges de microgel. Le deuxième débit d’huile peut être ajusté pour optimiser le transport du produit à l’intérieur de la sortie.
13. Modifiez le conteneur de collecte et notez l’heure de début et les débits de la collection de produits.
    REMARQUE: Protégez le produit de la poussière. Arrêtez de prélever avant que la seringue ne soit à court de solution.
14. Pour terminer la collecte, retirez le conteneur de collecte en notant l’heure. Arrêtez l’irradiation et toutes les pompes à seringues.
15. Lavez ensuite le produit 5x chacun avec du n-hexane, de l’isopropanol et de l’eau désionisée. Retirer le surnageant après sédimentation en bâtonnet.
    NOTE: Après chaque ajout de solution, disperser soigneusement le produit et attendre 10 minutes avant de remplacer le solvant, en tenant compte de la diffusion moléculaire. Remplacez progressivement l’isopropanol par de l’eau pour empêcher les bâtonnets de flotter à la surface du liquide. Plusieurs étapes de lavage supplémentaires avec de l’eau diminuent les traces d’isopropanol restantes.

5. Formation d’échafaudage macroporeux

1. Déterminer le nombre de tiges de microgel par volume de dispersion pour les échantillons fonctionnalisés époxy et amine.
2. Ajuster le nombre d’échantillons fonctionnalisés par époxy et amine par dilution ou concentration à une valeur similaire comprise entre 1 000 et 5 000 tiges/100 μL.
   REMARQUE: Utilisez une centrifugeuse à ~2 000 x g pendant 5-10 s pour accélérer la sédimentation des tiges de microgel. Si le nombre de tiges par volume de dispersion est faible, l’interconnexion des tiges peut donner lieu à des grappes de tiges plus petites au lieu d’une construction stable. Si le nombre de tiges par volume de dispersion est élevé, la qualité du mélange des deux composants sera compromise.
3. Transvaser la dispersion du premier composant (~1 200 tiges) dans un flacon transparent de 1,5 ml ou 2 ml.
4. Ajouter le deuxième composant de manière contrôlée en fonctionnement continu (pipette de 100 μL). Après l’ajout, mélangez le contenu directement à l’aide de la pipette pour absorber le liquide et ajoutez-le à nouveau. La structure interconnectée se forme en quelques secondes pendant le mélange.
   REMARQUE: Si plusieurs grappes se forment au lieu d’une structure cohérente, vérifiez à nouveau le nombre de tiges de microgel par volume ou fournissez un mélange plus contrôlé des deux composants.

6. Adhésif cellulaire post-modification

1. Calculer le nombre théorique de groupes époxy dans la structure interconnectée en fonction du débit de la phase polymère dispersée, du nombre de microgels collectés pendant un temps spécifique et du facteur de dilution de la dispersion de microgel utilisée pour la formation d’échafaudages.
   NOTE: Approximez le nombre théorique de groupes époxy par échafaudage par l’équation suivante.
   
   
   n_ième: Quantité théorique de substance
   c GMA: concentration de_GMA dans une solution de prépolymère
   Q: Débit de la solution de prépolymère
2. Ajouter la solution GRGDS-PC à la structure interconnectée pour modifier tous les groupes époxy restants avec le peptide adhésif cellulaire portant une amine et un thiol libres (n[groupes époxy théoriques]/n[GRGDS-PC] = 1). Laisser à température ambiante pendant la nuit.
3. Enlevez les molécules qui n’ont pas réagi en les lavant à l’eau désionisée et en enlevant le surnageant.

7. Stérilisation et transfert dans des milieux de culture cellulaire

1. Réduisez le niveau d’eau pour simplement submerger l’échafaudage interconnecté.
2. Ouvrez le flacon et irradiez avec une lumière UV de λ = 250-300 nm. Fermez le flacon et transférez-le sur un banc propre. Lavez 1x avec de l’eau stérile.
3. Remplacez l’eau du flacon par un milieu de culture cellulaire et laissez l’équilibre pendant 5 min. Répétez cette opération avec des milieux de culture de cellules fraîches 2x.
4. Transférer l’échafaudage macroporeux dans une plaque de puits de culture cellulaire pour l’expérience en versant ou en utilisant une spatule.

  

Résultats

Figure 2 : Structure d’échafaudage macroporeux réticulé. (A) Projection 3D d’une pile Z de microscopie confocale de 500 μm de l’échafaudage macroporeux interconnecté. La barre d’échelle représente 500 μm. (B) Échafaudage interconnecté composé de ~10 000 tiges de microgel sur un verre de couvertur...

Discussion

L’une des étapes critiques de ce protocole est la qualité du méthacrylate de 2-aminoéthyle (AMA) utilisé comme comonomère pour la fonctionnalisation des amines primaires. L’AMA doit être une poudre à grain fin et de préférence incolore livrée dans un récipient en verre brun étanche aux gaz. Il faut éviter d’utiliser un matériau verdâtre et grumeleux, car il altère considérablement la réaction de gélification et affecte négativement la reproductibilité des résultats. En cas de mauvaise gélifi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABIL EM 90	Evonik	144243-53-8	non-ionic surfactant
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride	TCI Chemicals	A3413	>98.0%(T)(HPLC)
8-Arm PEG-acrylate 20 kDa	Biochempeg Scientific Inc.	A88009-20K	≥ 95 %
AutoCAD 2019	Autodesk		computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs
CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter	CHROMAFILCarl Roth GmbH+Co.KG	XH49.1	pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV)
Cover glass	Marienfeld-Superior		type No. 1
EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm	Electron Microscopy Sciences		0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter
Ethanol absolut	VWR Chemicals
FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera	FLIR Systems
Fluoresceinamine isomer I	Sigma-Aldrich	201626
Fluorescein isothiocyanate	Thermo Fisher Scientific	46424
25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles	BD Microlance 3
Glycidyl methacrylate	Sigma-Aldrich	779342	≥97.0% (GC)
GRGDS-PC	CPC Scientific	FIBN-015A
Hamilton 1000 Series Gastight syringes	Thermo Fisher Scientific	10772361/10500052	PFTE Luer-Lock
Hexane	Sigma-Aldrich	1,04,367
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate	Sigma-Aldrich	900889	≥95 %
Motic AE2000 trinocular microscope	Ted Pella, Inc.	22443-12
Novec 7100	Sigma-Aldrich	SHH0002
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O9755
Paraffin	VWR Chemicals	24679320
Pavone Nanoindenter Platform	Optics11Life
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade	dropletex		ID 0.38 mm OD 1.09 mm
2-Propanol	Sigma-Aldrich	190764	ACS reagent, ≥99.5%
Protein LoBind Tubes	Eppendorf	30108132
Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus
RPMI 1640 medium	Gibco	11530586
SYLGARD 184 silicone elastomer kit	Dow SYLGARD	634165S
Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane	Sigma-Aldrich	448931
UVC LED sterilizing box	UVLED Optical Technology Co., Ltd.	9S SZH8-S2