마이크로젤 로드의 상호 연결된 거대 다공성 3D 스캐폴드

요약

상보적인 반응성 그룹을 갖는 마이크로겔 로드는 수용액에서 상호 연결될 수 있는 능력을 가진 마이크로유체공학을 통해 생산됩니다. 아니소메트릭 마이크로젤은 구형 기반 시스템에 비해 더 큰 기공을 가진 안정적인 구조물로 막히고 상호 연결됩니다. GRGDS-PC로 변형 된 마이크로 겔은 세포 배양에 사용할 수있는 거대 다공성 3D 구조물을 형성합니다.

초록

미세유체공학의 기능화된 마이크로겔의 2액형 시스템은 추가 첨가제 없이 수용액에서 3D 거대 다공성 구조물로 빠르게 상호 연결할 수 있습니다. 연속적인 광개시 온칩 겔화는 마이크로겔 종횡비의 변동을 가능하게 하며, 이는 수득된 구축물에 대한 빌딩 블록 특성을 결정한다. 글리시딜 메타크릴레이트(GMA) 또는 2-아미노에틸 메타크릴레이트(AMA) 단량체는 에폭시 또는 아민 작용기를 달성하기 위해 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 스타 폴리머를 기반으로 하는 마이크로겔 네트워크로 공중합됩니다. 집속 오일 흐름은 기능화된 마이크로겔 로드의 연속 수집을 보장하기 위해 마이크로유체 출구 구조로 도입됩니다. 최근 간행물에 따르면 마이크로겔 로드 기반 구조체는 수백 마이크로미터의 더 큰 기공을 생성하는 동시에 구형 기반 모델에 비해 전반적으로 더 높은 스캐폴드 안정성을 제공합니다. 이러한 방식으로, 필요한 재료의 양을 줄이면서 더 많은 자유 부피를 갖는 더 많은 양의 구조물을 생산할 수 있습니다. 상호 연결된 거대 다공성 스캐폴드는 손상이나 분해 없이 픽업하고 운반할 수 있습니다. 상호 결합에 관여하지 않는 아민 및 에폭시기는 활성 상태를 유지하며 사후 변형을 위해 독립적으로 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 후속 세포 실험에 활용할 수 있는 거대다공성 상호 연결된 스캐폴드를 형성하기 위해 마이크로겔 막대를 제조하기 위한 최적화된 방법을 설명합니다.

서문

3D 구조에서 복잡한 협력 세포 거동을 연구하려면 스캐폴드 플랫폼이 재현성에서 일관된 성능을 보여주고, 세포 이동에 적합한 형상을 가져야 하며, 동시에^{생체 조직에 미치는} 영향을 조사하기 위해 매개변수 변경 측면에서 특정 유연성을 허용해야 합니다1. 최근 몇 년 동안 Segura et al.에 의해 처음 기술된 거대다공성 어닐링 입자(MAP)의 개념은 3D 비^{계 생산을 위한} 효율적이고 다양한 플랫폼으로 발전했습니다2. 최종 3D 스캐폴드의 빌딩 블록인 마이크로겔의 맞춤형 구성은 구조물의 강성, 겔 네트워크의 선택적 화학적 반응성 및 스캐폴드 2,3,4,5,6의 최종 공극 크기와 같은 특성을 미리 정의합니다. 스캐폴드-세포 상호작용을 위한 단서로서의 세포 접착 펩티드는 마이크로겔의 중합체 네트워크에 통합되어 세포 부착을 허용하고 배양에서 세포에 대한 이들의 특이적 효과를 조사하기 위해 다양화될 수 있다. 3D 스캐폴드는 공유 결합 또는 초분자 결합으로 인해 어닐링된 주사 가능한 마이크로겔의 상호 결합에 의해 안정화되어 세포 배양 2,3,5,7,8을 위한 견고하고 정의된 구조를 생성합니다.

Microfluidics는 정의 된 과립 하이드로 겔의 제조를위한 가장 정확하고 적응력있는 방법 중 하나로 자리 매김했습니다⁹. 화학적, 기계적 및 물리적 단분산성을 유지하면서 연속 공정에서 필요한 빌딩 블록을 더 많이 생산할 수 있는 가능성은 이 공정의 적합성에 크게 기여합니다. 더욱이, 생성된 마이크로겔의 크기 및 형상은 배치 에멀젼, 마이크로유체공학, 리소그래피, 전기역학적 분무 또는 기계적 단편화와 같은 다양한 방법에 의해 조작될 수 있으며, 이는 빌딩 블록의 기하학적 구조 및 따라서 최종 스캐폴드(^1,10)의 3D 구조를 결정한다.

최근에, 추가 첨가제없이 수용액에서 신속하게 상호 연결되는 기능화 된 마이크로 겔 막대로 구성된 거대 다공성 3D 스캐 폴드의 개념이보고되었다¹¹. 마이크로겔 막대의 이방성은^{이 연구에서 구}형 마이크로겔을 사용하는 것과 비교하여 더 큰 기공 크기를 가진 더 높은 다공성 및 기공 분포를 가져왔습니다11. 이러한 방식으로 재료가 적을수록 3D 스캐폴드의 안정성을 유지하면서 다양한 기공 형상을 가진 더 큰 기공이 생성됩니다. 이 시스템은 서로 접촉 할 때 상호 연결 반응 내에서 소비되는 상보적인 1 차 아민 및 에폭시 작용기를 가진 두 가지 유형의 마이크로 겔 막대로 구성됩니다. 상호 결합 과정에 참여하지 않는 작용기는 활성 상태를 유지하며 세포 접착 펩티드 또는 기타 생리 활성 인자를 사용한 선택적 사후 변형에 사용할 수 있습니다. 섬유아세포는 3D 스캐폴드 내부에서 배양될 때 부착, 확산 및 증식하며, 먼저 마이크로젤 표면에서 성장하고 5일 후에 대부분의 매크로 기공을 채웁니다. 인간 섬유아세포 및 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에 대한 예비 공동배양 연구는 상호 연결된 3D 스캐폴드(¹¹) 내에서 혈관-유사 구조의 형성에 대한 유망한 결과를 보여주었다.

프로토콜

1. 미세 유체 공학에 필요한 재료 및 준비

1. 설명 된 미세 유체 절차의 경우 1mL 및 5mL 유리 주사기 및 주사기 펌프를 사용하십시오. 온칩 액적 형성은 고속 카메라가 장착된 도립 현미경을 통해 관찰됩니다.
2. 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어를 사용하여 마이크로유체 칩 설계(도 1B)를 생성하고 이미 보고된 바와 같이 마스터 템플릿을 생성한다(^{도 12}).
3. 0.13mm 두께의 커버 유리를 통해 957mW/^cm2의 방사조도를 제공하는 자체 제작 UV-LED(λ = 365nm, 스폿 직경 ~4.7mm)를 사용하여 제어된 UV 조사를 달성합니다.
   알림: 조사 중에 UV-LED에 의한 가능한 국소 열 생성을 고려하십시오. 이 경우 외부 공기 흐름에 의한 충분한 냉각을 보장하십시오.

2. 미세 유체 장치 생산

참고: 마이크로유체 장치 제조는 이전 간행물¹³에 기초한다.

1. 폴리디메틸실록산(PDMS)과 경화제의 10:1(질량 기준) 혼합물 20g을 준비합니다. 3 분 동안 격렬하게 혼합하십시오.
2. 2.0g의 톨루엔에 60mg의 오일 레드 O를 섞는다. 톨루엔 용액 중 50μL의 오일 레드 O를 PDMS 혼합물에 첨가한다. 균일한 색상 분포가 있을 때까지 혼합하여 원치 않는 광산란을 줄이고 온칩 겔화 중에 스폿 크기에 초점을 맞춥니다.
3. 혼합물을 진공 펌프가 장착 된 데시케이터에 넣어 기포를 제거하십시오.
4. PDMS 혼합물을 마스터 템플릿에 5-5.5 mm 높이로 캐스팅하고 다시 가스를 제거하십시오.
5. PDMS가 실온에서 18시간 동안 경화되도록 하여 디아조 염료 분해를 방지합니다.
6. PDMS 구조를 잘라내고 라인 코어 샘플링 도구(내경 0.77mm, 외경 1.07mm)를 사용하여 구조물에 입구 및 출구 구멍을 펀칭합니다.
7. PDMS를 세척하고 유리 덮개를 이소프로판올과 탈이온수로 5회 반복하고, 이어서 각 세척 단계 후에 압력 공기 또는 질소 흐름을 통해 액체를 제거합니다.
8. 건조 유리와 PDMS를 0.2mbar의 플라즈마 오븐에서 100W에서 60초 동안 20mL/분의 산소 흐름으로 처리하고 유리와 PDMS를 함께 결합하여 미세 유체 장치를 형성하기 위해 직접 연결합니다.
   참고: 채널 구조 변형을 최소화하기 위해 바인딩 프로세스 중에 PDMS 구조를 구부리지 마십시오.
9. 미세 유체 칩의 채널을 소수성으로 만들려면 장치를 50μL의 트리클로로-(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)-실란과 함께 진공 상태에서 밤새 데시케이터에 놓습니다(증기압을 감소시킨 후 펌프에 대한 연결을 닫습니다). 장치 외부를 하이드로 플루오로 에테르로 헹굽니다.
   주의 : 흄 후드에서이 단계를 수행하고 퍼플 루오로 실란과의 접촉을 피하십시오. 그리스로 밀봉 된 유리 진공 건조기를 사용하십시오. 다른 용도로 사용하기 전에 데시케이터를 철저히 청소하십시오.

3. 미세 유체 공학을위한 용액 준비

1. 연속 오일상의 경우 파라핀 오일과 헥사데칸(1:1 v/v)을 혼합하고 비이온성 계면활성제 8%(w/w)를 추가합니다. 1mL(첫 번째 오일, 그림 1)와 5mL(두 번째 오일, 그림 1) 유리 주사기 하나를 채웁니다.
2. 광개시제 분해 및 의도하지 않은 겔화를 방지하기 위해 갈색 유리 바이알에 분산 단계를 위한 프리폴리머 용액을 준비합니다.
   1. GRGDS-PC를 포함하는 아민 성분 프레폴리머 용액
      1. 300μL 용액의 경우 33.3mg의 스타-폴리에틸렌 글리콜-아크릴레이트(sPEG-AC)와 3.03mg의 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP)를 칭량합니다.
      2. 18.74mg의 2-아미노에틸 메타크릴레이트 염산염(AMA)을 1.5mL의 탈이온수에 녹이고 용액을 주사기 필터(0.20μm 공극 크기)에 통과시킵니다.
         알림: AMA는 흡습성이 있으므로 보관 용기에 고체가 덩어리를 형성하는 즉시 폐기해야 합니다.
      3. 멸균 36mM GRGDS-PC 분취량을 물에 준비하고 사용할 때까지 -20 ° C에서 유지하십시오.
      4. 291.7 μL의 AMA 용액을 사용하여 sPEG-AC 및 LAP를 용해시키고 8.3 μL의 GRGDS-PC 용액을 첨가하십시오. 1mL 유리 주사기로 용액을 꺼내 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하십시오.
   2. 에폭시 성분 프리폴리머 용액
      1. 300μL 용액의 경우 스타-폴리에틸렌 글리콜-아크릴레이트(sPEG-AC) 33.3mg, LAP 3.03mg을 칭량하고 300μL의 탈이온수에 용해합니다. 글리시 딜 메타 크릴 레이트 (GMA) 2.4mg을 첨가하십시오.
         알림: 격렬한 흔들림은 GMA 용해를 가속화합니다. 1mL 유리 주사기로 용액을 꺼내 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하십시오.

4. 아민 및 에폭시 기능화 마이크로 겔 막대의 생산 및 정제

그림 1: 마이크로유체 온칩 겔화 어셈블리 의 배열. (A) 미세유체공학 동안 성분 배열의 전면도 및 각진 보기. (B) 마이크로겔 로드의 온칩 겔화에 사용되는 미세유체 칩 설계. (1) 첫 번째 오일 입구에 PE 튜브. (2) 분산상 입구에 대한 광 보호 PE 튜브. (3) 두 번째 오일 입구에 PE 튜브. (4) 콘센트에서 제품 수집 용기까지의 PE 튜브. (5) UV 램프 및 출구 근처의 직선 80μm 채널에 조사 위치. (6) 현미경 대물 렌즈 / 관찰 위치. (7) 미세유체 장치의 착색된 PDMS 성분. (8) PDMS에 접착된 커버 유리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 바늘을 PE 튜브에 삽입하고 주사기와 튜브에서 가스를 제거합니다.
2. 제품 수집을 위해 PE 튜브를 콘센트에 삽입합니다.
3. 모든 유리 주사기를 주사기 펌프에 넣고 각 튜브 끝을 해당 흡입구에 삽입합니다(그림 1).
   알림: 의도하지 않은 겔화를 방지하기 위해 알루미늄 호일 또는 검은색 튜브를 통해 프리폴리머 튜브를 빛으로부터 보호하십시오.
4. 현미경을 기름-물 단면에 초점을 맞춥니다.
5. 첫 번째 오일 시린지 펌프(유량 = 100-200μL/h)를 시작하여 먼저 채널에 오일을 채워 분산 단계에 의한 채널 습윤을 방지합니다.
6. 첫 번째 오일 유량을 30μL/h로 낮추고 단면에서 분산된 수성상이 관찰될 때까지 프리폴리머 시린지 펌프(유량 = 100-200μL/h)를 시작합니다.
7. 프리폴리머 유속을 30μL/h로 설정하고 출구에 현미경의 초점을 맞춥니다.
8. 두 번째 오일 실린지 펌프(유량 300μL/h)를 시작하고 유량이 안정될 때까지 기다립니다.
9. 배출 튜브를 수집 용기에 넣으십시오.
   알림: 시간이 지남에 따라 제품이 축적되어 압력이 증가하는 것을 방지하기 위해 튜브의 끝을 용기 상단에 놓습니다.
10. 방사 조도가 900-1000mW/cm2(사용된 방사조도 = 957mW/^cm2) 범위에 있고 조사 지점이 배출구 앞의 직선 채널 부분에 있도록 UV 조사 시스템을 설정합니다(그림 1B).
    알림: 채널이 막히지 않도록 오일-물 단면 근처에서 조사하지 마십시오. 추가 보호를 위해 장치 상단의 조사 지점 전에 채널 구조를 덮으십시오.
11. UV 조사 전에 프리폴리머와 제1 오일의 유량을 조정하여 3.0에서 4.5 범위의 원하는 종횡비를 달성하고 조사 지점의 크기에 따라 분산상의 조사 시간을 ~2.3초로 설정합니다.
12. UV 조사를 시작하고 필요한 경우 이전 하위 섹션에 따라 유량을 다시 조정하십시오.
    알림: 처음에 생산을 관찰하고 배출구의 안정적인 흐름 거동과 마이크로겔 로드의 균일성을 모니터링합니다. 두 번째 오일 흐름을 조정하여 배출구 내에서 제품 운송을 최적화할 수 있습니다.
13. 수집 컨테이너를 변경하고 제품 수집 시작 시간 및 유량을 기록해 둡니다.
    알림: 먼지로부터 제품을 보호하십시오. 주사기의 용액이 부족하기 전에 수집을 중지하십시오.
14. 수집을 종료하려면 시간을 기록하면서 컬렉션 컨테이너를 제거합니다. 방사선 조사 및 모든 주사기 펌프를 중지하십시오.
15. 이후 제품을 n-헥산, 이소프로판올 및 탈이온수로 각각 5배 세척합니다. 막대 침강 후 상청액을 제거하십시오.
    알림: 각 용액을 첨가한 후 제품을 조심스럽게 분산시키고 분자 확산을 고려하여 용매를 교체하기 전에 10분 동안 기다리십시오. 막대가 액체 표면으로 뜨는 것을 방지하기 위해 이소프로판올을 물로 서서히 교체하십시오. 물로 여러 번 추가로 세척하면 남은 이소프로판올 흔적이 줄어 듭니다.

5. 거대 다공성 비계 형성

1. 에폭시 및 아민 기능화 샘플에 대한 분산 부피당 마이크로겔 막대의 수를 결정합니다.
2. 희석 또는 농도에 의한 에폭시 및 아민 기능화 샘플의 수를 1,000-5,000 rods/100 μL 사이의 유사한 값으로 조정합니다.
   알림: ~2,000 x g에서 5-10초 동안 원심분리기를 사용하여 마이크로겔 막대의 침강 속도를 높입니다. 분산 부피당 막대 수가 적 으면 막대 상호 연결로 인해 하나의 안정적인 구조 대신 막대 클러스터가 작아 질 수 있습니다. 분산량당 막대 수가 많으면 두 성분의 혼합 품질이 저하됩니다.
3. 첫 번째 성분(~1,200개 로드) 분산액을 원뿔형 1.5mL 또는 2mL 투명 바이알에 옮깁니다.
4. 제2 성분을 연속 작동(100 μL 피펫)으로 제어된 방식으로 첨가한다. 또한 피펫을 사용하여 내용물을 직접 혼합하여 액체를 흡수하고 다시 첨가하십시오. 상호 연결된 구조는 혼합하는 동안 몇 초 내에 형성됩니다.
   참고: 하나의 일관된 구조 대신 여러 클러스터가 형성되는 경우 부피당 마이크로겔 막대 수를 다시 확인하거나 두 구성 요소의 보다 제어된 혼합을 제공하십시오.

6. 세포 접착제 후 수정

1. 분산된 폴리머 상의 유속, 특정 시간 동안 수집된 마이크로겔의 수 및 스캐폴드 형성에 사용되는 마이크로겔 분산액의 희석 계수를 기반으로 상호 연결된 구조에서 에폭시기의 이론적 수를 계산합니다.
   알림: 다음 방정식으로 스캐폴드당 이론적인 에폭시기 수를 근사화합니다.
   
   
   n_번째 : 물질의 이론적 양
   c GMA : 프리폴리머 용액의_GMA 농도
   Q: 프레폴리머 용액의 유량
2. GRGDS-PC 용액을 상호 연결된 구조에 추가하여 유리 아민과 티올(n[이론적 에폭시기]/n[GRGDS-PC] = 1)을 포함하는 세포 접착 펩타이드로 나머지 모든 에폭시기를 수정합니다. 실온에서 밤새 방치하십시오.
3. 탈이온수로 세척하고 상청액을 제거하여 미반응 분자를 제거한다.

7. 살균 및 세포 배양 배지로 옮김

1. 수위를 낮추어 연결된 비계를 잠수하십시오.
2. 바이알을 열고 λ = 250-300 nm의 자외선을 조사하십시오. 바이알을 닫고 바이알을 깨끗한 벤치로 옮깁니다. 멸균 된 물로 1 번 씻으십시오.
3. 바이알의 물을 세포 배양 배지로 교체하고 5분 동안 평형을 유지합니다. 새로운 세포 배양 배지 2배로 이 단계를 반복합니다.
4. 거대 다공성 스캐폴드를 주입하거나 주걱을 사용하여 실험을 위해 세포 배양 웰 플레이트로 옮깁니다.

  

결과

그림 2: 거대다공성 가교 스캐폴드 구조. (A) 상호 연결된 거대 다공성 스캐폴드의 500μm 컨포칼 현미경 Z 스택의 3D 투영. 스케일 바는 500 μm를 나타냅니다. (B) 물에서 직접 꺼낸 커버 유리에 ~ 10,000 개의 마이크로 겔 막대로 구성된 상호 연결된...

토론

이 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 1차 아민 기능화를 위한 공단량체로 사용되는 2-아미노에틸 메타크릴레이트(AMA)의 품질입니다. AMA는 기밀 갈색 유리 용기에 전달되는 미세하고 바람직하게는 무색 분말이어야 합니다. 녹색을 띠고 울퉁불퉁 한 물질을 사용하면 겔화 반응이 크게 손상되고 결과의 재현성에 부정적인 영향을 미치므로 사용하지 않아야합니다. 겔화가 불량하고 마이크로 겔 막대...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABIL EM 90	Evonik	144243-53-8	non-ionic surfactant
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride	TCI Chemicals	A3413	>98.0%(T)(HPLC)
8-Arm PEG-acrylate 20 kDa	Biochempeg Scientific Inc.	A88009-20K	≥ 95 %
AutoCAD 2019	Autodesk		computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs
CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter	CHROMAFILCarl Roth GmbH+Co.KG	XH49.1	pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV)
Cover glass	Marienfeld-Superior		type No. 1
EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm	Electron Microscopy Sciences		0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter
Ethanol absolut	VWR Chemicals
FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera	FLIR Systems
Fluoresceinamine isomer I	Sigma-Aldrich	201626
Fluorescein isothiocyanate	Thermo Fisher Scientific	46424
25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles	BD Microlance 3
Glycidyl methacrylate	Sigma-Aldrich	779342	≥97.0% (GC)
GRGDS-PC	CPC Scientific	FIBN-015A
Hamilton 1000 Series Gastight syringes	Thermo Fisher Scientific	10772361/10500052	PFTE Luer-Lock
Hexane	Sigma-Aldrich	1,04,367
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate	Sigma-Aldrich	900889	≥95 %
Motic AE2000 trinocular microscope	Ted Pella, Inc.	22443-12
Novec 7100	Sigma-Aldrich	SHH0002
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O9755
Paraffin	VWR Chemicals	24679320
Pavone Nanoindenter Platform	Optics11Life
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade	dropletex		ID 0.38 mm OD 1.09 mm
2-Propanol	Sigma-Aldrich	190764	ACS reagent, ≥99.5%
Protein LoBind Tubes	Eppendorf	30108132
Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus
RPMI 1640 medium	Gibco	11530586
SYLGARD 184 silicone elastomer kit	Dow SYLGARD	634165S
Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane	Sigma-Aldrich	448931
UVC LED sterilizing box	UVLED Optical Technology Co., Ltd.	9S SZH8-S2