一种稳定建立的溶血磷脂酰胆碱诱导的小鼠局灶性脱髓鞘模型的两点注射

摘要

本方案描述了 通过 立体定位框架两点注射溶血磷脂酰胆碱以在小鼠中产生稳定且可重复的脱髓鞘模型。

摘要

受体介导的溶血磷脂信号传导有助于各种神经系统疾病的病理生理学，尤其是多发性硬化症（MS）。溶血磷脂酰胆碱（LPC）是一种与炎症相关的内源性溶血磷脂，可诱发快速损伤，对髓鞘脂质有毒性，导致局灶性脱髓鞘。本文给出了立体定向两点LPC注射的详细方案，可直接导致严重脱髓鞘，并通过外科手术在小鼠中快速稳定地复制实验性脱髓鞘损伤。因此，该模型与脱髓鞘疾病，特别是MS高度相关，并且可以促进相关的临床相关研究的进展。此外，使用免疫荧光和Luxol快速蓝色染色方法来描述注射LPC的小鼠胼胝体中脱髓鞘的时间过程。此外，该行为方法用于评估建模后小鼠的认知功能。总体而言， 通过 立体定位框架两点注射溶血磷脂酰胆碱是一种稳定且可重复的方法，可在小鼠中生成脱髓鞘模型以进行进一步研究。

引言

受体介导的溶血磷脂信号传导涉及几乎所有器官系统的不同生理过程¹.在中枢神经系统（CNS）中，这种信号传导在自身免疫性神经系统疾病（如多发性硬化症（MS））的发病机制中起着关键作用。多发性硬化症是一种慢性免疫介导的疾病，其特征是病理性脱髓鞘和炎症反应，导致神经系统功能障碍和认知障碍^2，3。在疾病早期持续复发和缓解后，大多数患者最终进展到继发性进展阶段，这可能对大脑造成不可逆转的损害并导致残疾⁴。据信，继发性进展病程的病理标志是由炎症性病变引起的脱髓鞘斑块⁵。现有的MS治疗方法可以显着降低复发的风险。然而，对于进行性MS⁶引起的长期脱髓鞘损伤，仍然没有有效的治疗方法。因此，需要一个稳定建立且易于重现的模型来研究专注于白质变性的临床前治疗。

脱髓鞘和髓鞘再生是发展为多发性硬化症的两个主要病理过程。脱髓鞘是由促炎表型⁷的小胶质细胞诱导的轴突周围髓鞘的丧失，它导致神经冲动的缓慢传导并导致神经元和神经系统疾病的丧失。髓鞘再生是由少突胶质细胞介导的内源性修复反应，其中疾病可能导致神经变性和认知障碍⁸。炎症反应对整个过程至关重要，影响髓鞘损伤和修复的程度。

因此，持续的炎症性脱髓鞘的稳定动物模型对于进一步探索MS的治疗策略具有重要意义，由于MS的复杂性，已经建立了各种类型的动物模型来模拟 体内脱髓鞘病变，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），毒性脱髓鞘模型，铜绿素（CPZ）和溶酶磷脂酰胆碱（LPC）⁹.LPC是一种与炎症相关的内源性溶血磷脂，可诱发快速损伤，对髓鞘脂质有毒性，导致局灶性脱髓鞘。根据以前的报告和研究^10，11，提供了具有一些修改的两点注射的详细方案。通常，经典的单点LPC注射模型仅在注射部位产生局部脱髓鞘，并且通常伴有自发性髓鞘再生^12，13。然而，两点注射LPC模型可以证明LPC可以直接诱导小鼠胼胝体脱髓鞘，并导致更持久的脱髓鞘，髓鞘再生很少。

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研究方案

所有动物程序均经中国华中科技大学同济医学院动物护理委员会批准。本研究使用成年C57BL / 6雄性和雌性小鼠（野生型，WT;20-25g;8-10周龄）。小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。将小鼠饲养在特定的无病原体（SPF）动物设施中 ，随意提供水和食物。在22 °C温度和55%~60%相对湿度的标准条件下，将它们保持在12 h交替的明暗循环中。

1. 液相色谱溶液制备

1. 将25mg LPC粉末（见 材料表）与250μL氯仿和甲醇混合溶液（1:1）溶解，制成10%LPC溶液并将其转移到500μL离心管中。
   注意:如果LPC未完全溶解，请将离心管置于超声波清洗机中，并在40 kHz下超声处理〜1小时以获得均匀的溶液。
2. 将溶液分成3μL /管并储存在-80°C。
   注意:该溶液可以储存约2年。
3. 手术前，用27μL0.9%NaCl溶液稀释溶液（步骤1.2），并将溶液保持在37°C的恒温水浴中。
   注意:在开始注射之前准备溶液。

2. 手术准备

1. 使用32 G，2英寸针头连接到5μL注射器（参见 材料表）。确保微升注射器畅通无阻。取出5μL LPC溶液用于制备注射液。
2. 在连接到异氟醚汽化器的感应室中麻醉小鼠，其中3%异氟醚与100%氧以约0.3 L / min的速率混合。
3. 在呼吸顺畅时，通过缺乏脚趾捏反射来确认麻醉的深度。
4. 使用电动剃须刀剃须耳朵之间的鼠标头部。在手术过程中涂抹润滑眼药水以防止角膜干燥。
5. 然后，将鼠标置于立体定位框架（参见 材料表），背侧朝上，并用鼻锥和齿夹固定头部。通过鼻子用1.2%-1.6%的异氟醚维持麻醉。
   注意:异氟醚浓度可以根据小鼠的呼吸状态进行调整。

3. 外科手术

注意:在所有过程中，动物都被放在加热垫上。

1. 将鼠标固定在带有双侧耳条的立体定位装置上。确保耳杆水平，头部水平稳定。
2. 用碘伏擦拭几次，然后以圆周运动的方式擦拭酒精，对头部皮肤进行消毒。然后用手术刀沿着头皮中线切开一个约1.5厘米的小切口，露出头骨。
3. 用蘸有1%过氧化氢的棉签擦拭头骨，直到囟、锉和后囟门暴露出来。将注射器放在立体定位装置上。
   注意:请小心使用过氧化氢，避免接触周围组织。
4. 确保动物头部的水平位置（前后、左右）。
   1. 调整立体定位框架的Z轴旋钮，使针尖和颅骨只需接触而不弯曲，然后测量Z轴坐标。检查囟门和后囟门的Z坐标。
   2. 调整耳条，使囟门和后囟门的Z坐标之差不超过0.02毫米。然后，按照相同的方法测量中线左侧和右侧相应位置的 Z 坐标。调整耳条以确保左右两侧处于同一水平。
5. 找到胼胝体。将 XYZ 原点设置为"短整型"。
   注意:第一个注射部位位于前圃外侧1.0 mm，深2.4 mm，前部1.1 mm。第二个注射部位为前坩外侧1.0 mm，深2.1 mm，前部0.6 mm。例如，角坨的坐标为 （0，0，0）。测量标记为 （-1， 1.1， X） 和 （-1， 0.6， Y） 的相应位置的 Z 坐标。可以确定胼胝体的第一个注射位点坐标是（-1， 1.1， −[X + 2.4]），第二个注射位点是（-1， 0.6， −[Y + 2.1]）。
6. 一旦确定了注射部位，在颅骨上用无菌标记标记并记录坐标。
7. 用颅骨钻轻轻钻出标记的部位（参见 材料表）。注意避免任何出血。
8. 慢慢地将针头移动到给定的坐标并开始注射。为了诱导胼胝脱髓鞘，在每个注射部位（步骤3.5）以0.4μL / min的速率注入2μL LPC溶液（步骤1.）。
9. 注射后，将针头在每个部位再保持10分钟。
   注意:确保两次注射的间隔不超过20分钟。
10. 用4-0缝合线缝合皮肤，等待动物在10分钟内醒来。术后按照机构动物护理规定给予镇痛药。
    注意:建议安乐死的时间可以根据实验的目的来确定。

4. 用于局灶性脱髓鞘的样品提取

注意:有关此步骤的详细信息，请参阅以前发布的报告¹⁴。

1. 将中性红色染料（见 材料表）溶解在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的1%溶液中。
2. 在牺牲小鼠之前几个小时（有关详细信息，请参阅先前的参考文献¹⁰），通过腹膜内注射为每只小鼠在PBS中注射500μL1%中性红色染料。
3. 用30 mL 0.1%PBS在4°C下预冷进行心脏灌注¹² 。
4. 用脑模将大脑切成1毫米（见 材料表）。
5. 在显微镜下观察染有中性红色的病变并解离病变。
   注意:尽可能多地去除周围的正常组织，以提高后续分析的准确性。病变组织可通过 RT-PCR、电子显微镜检查和免疫印迹分析进行检查。

5. 组织学染色和免疫荧光

1. 对于组织学染色和免疫荧光¹²，在心脏灌注（步骤4.3.）后，取出大脑¹⁰，固定在4%PFA中过夜（在4°C），并在30%蔗糖中完全脱水。
2. 在恒定温度（-20°C）下使用冷冻切片机^10切成20 毫米的冠状脑切片。
3. 将切片用于卢克索快速蓝 （LFB） 染色、免疫荧光和蛋白质印迹¹⁰。

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结果

LPC的两点注射导致更持久的脱髓鞘
LPC主要导致快速损伤，对髓鞘有毒性，轴突完整性¹⁵断裂。注射当天被视为第0天。将小鼠保存10-28天（10 dpi和28 dpi）。使用卢克索快速蓝（LFB）染色¹⁰来评估这些时间点小鼠脱髓鞘的区域。在两点注射模型中，与假组相比，10 dpi上存在显着的脱髓鞘，表明局部注射LPC可以成功地脱髓胼胝体。在28 dpi处仍然存在相对...

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讨论

MS是中枢神经系统的慢性脱髓鞘疾病，是年轻人神经系统功能障碍的最常见原因之一²⁰.临床上，大约60%-80%的MS患者在发展为继发性进行性MS^21，22之前经历复发和缓解的^{周期，并且}最终导致累积的运动障碍和认知缺陷²³。目前，没有一个单一的实验模型涵盖了该疾病²⁴的各种临床、病理或免疫学特征。?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk	Sigma-Aldrich	L4129-25MG
32 gauge Needle	HAMILTON	7762-05
10 μl syringe	HAMILTON	80014
high speed skull drill	strong,korea	strong204
drill	Hager & Meisinger, Germany	REF 500 104 001 001 005
Matrx Animal Aneathesia Ventilator	MIDMARK	VMR
Portable Stereotaxic Instrument for Mouse	Reward	68507
Micro syringe	Reward	KDS LEGATO 130
Isoflurane	VETEASY
Paraformaldehyde	Servicebio	G1101
Phosphate buffer	BOSTER	PYG0021
LuxoL fast bLue	Servicebio	G1030-100ML
Suture	FUSUNPHARMA	20152021225
Brain mold	Reward	68707
Electron microscope fixative	Servicebio	G1102-100ML
Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain	Sigma-Aldrich	1.01376
Anti-Myelin Basic Protein Antibody	Millipore	#AB5864
Anti-GST-P pAb	MBL	#311
Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15)	Thermo Fisher Scientific	14-5698-95
Beta Actin Monoclonal Antibody	Proteintech	66009-1-Ig
Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody	Proteintech	10458-1-AP
OLIG2 Polyclonal Antibody	Proteintech	13999-1-AP
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)	YEASEN	34206ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)	YEASEN	34412ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	YEASEN	34212ES60
HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	abclonal	AS014
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	abclonal	AS003
Adult C57BL/6 male and female mice	Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd