Ein stabil etabliertes Zwei-Punkt-Injektionsmodell für Lysophosphatidylcholin-induziertes fokales Demyelin-Modell bei Mäusen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Zwei-Punkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin über einen stereotaktischen Rahmen, um ein stabiles und reproduzierbares Demyelinmodell in Mäusen zu erzeugen.

Zusammenfassung

Die rezeptorvermittelte Lysophospholipid-Signalgebung trägt zur Pathophysiologie verschiedener neurologischer Erkrankungen, insbesondere der Multiplen Sklerose (MS), bei. Lysophosphatidylcholin (LPC) ist ein endogenes Lysophospholipid, das mit Entzündungen assoziiert ist, und es könnte eine schnelle Schädigung mit Toxizität für Myelinlipide induzieren, was zu einer fokalen Demyelinisierung führt. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die stereotaktische Zwei-Punkt-LPC-Injektion vorgestellt, die eine schwere Demyelinisierung direkt verursachen und die experimentelle Demyelinisierungsverletzung bei Mäusen durch chirurgische Eingriffe schnell und stabil replizieren könnte. Somit ist dieses Modell für Demyelinisierungserkrankungen, insbesondere MS, von hoher Relevanz und kann dazu beitragen, die damit verbundene klinisch relevante Forschung voranzutreiben. Auch Immunfluoreszenz- und Luxol-Schnellblaufärbungsmethoden wurden verwendet, um den zeitlichen Verlauf der Demyelinisierung im Corpus callosum von Mäusen, denen LPC injiziert wurde, darzustellen. Darüber hinaus wurde die Verhaltensmethode verwendet, um die kognitive Funktion von Mäusen nach der Modellierung zu bewerten. Insgesamt ist die Zwei-Punkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin über einen stereotaktischen Rahmen eine stabile und reproduzierbare Methode, um ein Demyelinisierungsmodell in Mäusen für weitere Studien zu generieren.

Einleitung

Die rezeptorvermittelte Lysophospholipid-Signalgebung umfasst verschiedene physiologische Prozesse fast aller Organsysteme¹. Im zentralen Nervensystem (ZNS) spielt diese Signalübertragung eine entscheidende Rolle bei den Erregern autoimmuner neurologischer Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose (MS). Multiple Sklerose ist eine chronische immunvermittelte Erkrankung, die durch pathologische Demyelinisierung und Entzündungsreaktion gekennzeichnet ist und neurologische Dysfunktion und kognitive Beeinträchtigung verursacht ^2,3. Nach kontinuierlichem Rezidiv und Remittieren während der frühen Erkrankung gelangen die meisten Patienten schließlich in das sekundär-progressive Stadium, das irreversible Schäden am Gehirn und eine daraus resultierende Behinderung verursachen kann⁴. Es wird angenommen, dass das pathologische Kennzeichen des sekundär-progressiven Verlaufs demyelinisierende Plaques sind, die durch entzündliche Läsionen verursacht werden⁵. Bestehende Behandlungen für MS können das Risiko eines Rückfalls signifikant reduzieren. Es gibt jedoch immer noch keine wirksame Therapie für langfristige demyelinisierende Schäden, die durch progressive MS⁶ verursacht werden. Daher ist ein stabil etabliertes und leicht reproduzierbares Modell erforderlich, um präklinische Therapeutika zu untersuchen, die sich auf die Degeneration der weißen Substanz konzentrieren.

Demyelinisierung und Remyelinisierung sind zwei wichtige pathologische Prozesse bei der Entwicklung von Multipler Sklerose. Demyelinisierung ist der Verlust von Myelinscheide um Axone, die durch Mikroglia mit proinflammatorischen Phänotypen⁷ induziert werden, und es führt zu einer langsamen Leitung von Nervenimpulsen und führt zum Verlust von Neuronen und neurologischen Störungen. Remyelinisierung ist eine endogene Reparaturreaktion, die durch Oligodendrozyten vermittelt wird, wo Störungen zu Neurodegeneration und kognitiven Beeinträchtigungen führen können⁸. Die Entzündungsreaktion ist entscheidend für den gesamten Prozess und beeinflusst sowohl den Grad der Myelinschädigung als auch die Reparatur.

Daher ist ein stabiles Tiermodell der persistierenden entzündlichen Demyelinisierung für die weitere Erforschung therapeutischer Strategien für MS von Bedeutung. Aufgrund der Komplexität von MS wurden verschiedene Arten von Tiermodellen etabliert, um demyelinisierende Läsionen in vivo nachzuahmen, einschließlich experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE), toxisch-demyelinisierender Modelle, Cuprizon (CPZ) und Lysophosphatidylcholin (LPC)⁹ . LPC ist ein endogenes Lysophospholipid, das mit Entzündungen assoziiert ist, und es könnte schnelle Schäden mit Toxizität für Myelinlipide induzieren, was zu einer fokalen Demyelinisierung führt. Basierend auf früheren Berichten und Forschungsergebnissen^10,11 wird ein detailliertes Protokoll der Zweipunktinjektion mit einigen Modifikationen bereitgestellt. Im Allgemeinen erzeugt das klassische Einpunkt-LPC-Injektionsmodell nur eine lokale Demyelinisierung an der Injektionsstelle und wird oft von einer spontanen Remyelinisierung^{begleitet 12,13}. Das Zwei-Punkt-Injektions-LPC-Modell kann jedoch zeigen, dass der LPC eine Demyelinisierung im Mouse Corpus callosum direkt induzieren und eine dauerhaftere Demyelinisierung mit geringer Myelinregeneration verursachen kann.

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Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom Institute of Animal Care Committee des Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China, genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden erwachsene männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse (Wildtyp, WT; 20-25 g; 8-10 Wochen alt) verwendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle). Die Mäuse wurden in einer speziellen pathogenfreien (SPF) Tieranlage untergebracht, in der Wasser und Nahrung ad libitum geliefert wurden. Sie wurden in einer abwechselnden 12-stündigen Periode von Hell-Dunkel-Zyklus unter den Standardbedingungen von 22 ° C Temperatur und relativer Luftfeuchtigkeit von 55% -60% gehalten.

1. LPC-Lösungsvorbereitung

1. 25 mg LPC-Pulver (siehe Materialtabelle) werden mit 250 μL Chloroform- und Methanolmischlösung (1:1) gelöst, um eine 10%ige LPC-Lösung herzustellen, und sie in ein 500-μL-Zentrifugenröhrchen überführen.
   HINWEIS: Wenn der LPC nicht vollständig gelöst ist, legen Sie das Zentrifugenröhrchen in einen Ultraschallreiniger und Ultraschall bei 40 kHz für ~ 1 h, um eine gleichmäßige Lösung zu erhalten.
2. Teilen Sie die Lösung in 3 μL/Röhrchen und lagern Sie sie bei −80 °C.
   HINWEIS: Die Lösung kann für ~ 2 Jahre gelagert werden.
3. Vor der Operation wird die Lösung (Schritt 1.2.) mit 27 μL 0,9%iger NaCl-Lösung verdünnt und in einem Wasserbad mit konstanter Temperatur bei 37 °C aufbewahrt.
   HINWEIS: Bereiten Sie die Lösung kurz vor Beginn der Injektion vor.

2. Chirurgische Vorbereitung

1. Verwenden Sie eine 32 G, 2 in Nadel, um eine 5 μL Spritze anzuschließen (siehe Tabelle der Materialien). Stellen Sie sicher, dass die Mikroliterspritze ungehindert ist. Zur Vorbereitung der Injektion werden 5 μL LPC-Lösung entnommen.
2. Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer, die mit einem Isofluran-Verdampfer verbunden ist, mit 3% Isofluran, gemischt mit 100% Sauerstoff mit einer Rate von etwa 0,3 l / min.
3. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen eines Zehenkneifreflexes, während die Atmung glatt ist.
4. Rasieren Sie den Kopf der Maus mit einem elektrischen Rasierer zwischen den Ohren. Tragen Sie schmierende Augentropfen auf, um Hornhauttrockenheit während des Eingriffs zu verhindern.
5. Positionieren Sie dann die Maus in einem stereotaktischen Rahmen (siehe Materialtabelle) mit der dorsalen Seite nach oben und sichern Sie den Kopf mit Nasenkonus und Zahnklemme. Halten Sie die Anästhesie mit 1,2% -1,6% Isofluran durch die Nase aufrecht.
   HINWEIS: Die Isoflurankonzentration kann entsprechend dem Atmungsstatus der Mäuse eingestellt werden.

3. Chirurgischer Eingriff

HINWEIS: Die Tiere werden während aller Eingriffe auf ein Heizkissen gelegt.

1. Befestigen Sie die Maus mit bilateralen Ohrstangen am stereotaktischen Gerät. Stellen Sie sicher, dass die Ohrstangen eben und der Kopf horizontal und stabil ist.
2. Desinfizieren Sie die Haut auf dem Kopf, indem Sie mehrmals mit Jodophor abwischen, gefolgt von Alkohol in kreisförmiger Bewegung. Verwenden Sie dann ein Skalpell, um einen kleinen Schnitt von etwa 1,5 cm entlang der Mittellinie der Kopfhaut zu schneiden, um den Schädel freizulegen.
3. Wischen Sie den Schädel mit einem Wattestäbchen ab, das in 1% Wasserstoffperoxid getaucht ist, bis die Bregma, Lambda und die hintere Fontanelle freigelegt sind. Legen Sie die Spritze auf das stereotaktische Gerät.
   HINWEIS: Verwenden Sie Wasserstoffperoxid mit Vorsicht und vermeiden Sie es, das umgebende Gewebe zu berühren.
4. Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Tieres horizontal positioniert wird (sowohl vorne als auch hinten und links und rechts).
   1. Stellen Sie den Z-Achsenknopf des stereotaktischen Rahmens so ein, dass sich die Nadelspitze und der Schädel einfach berühren, ohne sich zu biegen, und messen Sie dann die Z-Achsenkoordinate. Überprüfen Sie die Z-Koordinaten von bregma und posterior fontanelle.
   2. Stellen Sie die Ohrstange so ein, dass die Differenz zwischen den Z-Koordinaten von bregma und hinterer Fontanelle nicht mehr als 0,02 mm beträgt. Befolgen Sie dann die gleiche Methode, um die Z-Koordinaten der entsprechenden Positionen auf der linken und rechten Seite der Mittellinie zu messen. Passen Sie die Ohrstange an, um sicherzustellen, dass sich die linke und rechte Seite auf der gleichen Höhe befinden.
5. Suchen Sie das Corpus callosum. Setzen Sie den XYZ-Ursprung auf bregma.
   HINWEIS: Die erste Injektionsstelle ist 1,0 mm lateral zum Bregma entfernt, 2,4 mm tief und 1,1 mm vorne. Die zweite Injektionsstelle ist 1,0 mm seitlich zum Bregma entfernt, 2,1 mm tief und 0,6 mm vorne. Zum Beispiel ist die Koordinate des Bregmas (0,0,0). Messen Sie die Z-Koordinate der entsprechenden Position, die als (-1, 1,1, X) und (-1, 0,6, Y) gekennzeichnet ist. Es kann bestimmt werden, dass die erste Injektionsstellenkoordinate des Corpus callosum (-1, 1,1, −[X + 2,4]) und die zweite Injektionsstelle (-1, 0,6, −[Y + 2,1]) ist.
6. Sobald die Injektionsstelle bestimmt ist, machen Sie eine Markierung mit einem sterilen Marker auf dem Schädel und notieren Sie die Koordinaten.
7. Bohren Sie die markierte Stelle vorsichtig mit einem Schädelbohrer (siehe Materialtabelle). Achten Sie darauf, Blutungen zu vermeiden.
8. Bewegen Sie die Nadel langsam zu den angegebenen Koordinaten und starten Sie die Injektion. Um eine Demyelinisierung des Corpus callosum zu induzieren, werden an jeder Injektionsstelle (Schritt 3.5.) 2 μL LPC-Lösung (Schritt 1.) mit einer Rate von 0,4 μL/min injiziert.
9. Nach der Injektion die Nadel an jeder Stelle für weitere 10 Minuten aufbewahren.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Intervall von zwei Injektionen nicht mehr als 20 Minuten beträgt.
10. Nähen Sie die Haut mit einer 4-0-Naht und warten Sie, bis das Tier innerhalb von 10 Minuten aufwacht. Verabreichen Sie Analgetika postoperativ in Übereinstimmung mit den institutionellen Tierpflegevorschriften.
    HINWEIS: Die empfohlene Zeit für die Euthanasie kann entsprechend dem Zweck des Experiments bestimmt werden.

4. Probenextraktion zur fokalen Demyelinisierung

HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Schritt finden Sie im zuvor veröffentlichten Bericht¹⁴.

1. Neutraler roter Farbstoff (siehe Materialtabelle) in einer 1%igen Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auflösen.
2. Stunden vor dem Opfern der Mäuse (Einzelheiten siehe vorherige Referenz¹⁰) injizieren Sie 500 μL 1% neutralen roten Farbstoff in PBS durch intraperitoneale Injektion für jede Maus.
3. Führen Sie eine Herzperfusion¹² mit 30 ml 0,1% PBS vorgekühlt bei 4 °C durch.
4. Schneiden Sie das Gehirn mit einer Gehirnform in 1 mm (siehe Tabelle der Materialien).
5. Visualisieren Sie die mit neutralem Rot gefärbte Läsion unter dem Mikroskop und dissoziieren Sie die Läsion.
   HINWEIS: Entfernen Sie so viel umgebendes normales Gewebe wie möglich, um die Genauigkeit der nachfolgenden Analyse zu verbessern. Das Läsionsgewebe kann mit RT-PCR, Elektronenmikroskopie und Western-Blot-Analysen untersucht werden.

5. Histologische Färbung und Immunfluoreszenz

1. Für histologische Färbung und Immunfluoreszenz 12 entfernen Sie nach der Herzperfusion (Schritt 4.3.) das Gehirn¹⁰, fixieren Sie 4% PFA über Nacht (bei 4 ° C) und dehydrieren Sie vollständig in³⁰% Saccharose.
2. Mit einem^{gefrorenen Slicer 10 bei konstanter} Temperatur (−20 °C) in 20 mm koronale Hirnschnitte schneiden.
3. Verwenden Sie die Scheiben für Luxol Fast Blue (LFB) Färbung, Immunfluoreszenz und Western Blot¹⁰.

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Ergebnisse

Die Zwei-Punkt-Injektion des LPC führte zu einer dauerhafteren Demyelinisierung
LPC führt hauptsächlich zu schnellen Schäden mit Toxizität für Myelin und Spaltung der Axonintegrität¹⁵. Der Tag der Injektion wurde als Tag 0 angesehen. Die Mäuse wurden über einen Zeitraum von 10-28 Tagen (10 dpi und 28 dpi) gehalten. Luxol Fast Blue (LFB) Färbung¹⁰ wurde verwendet, um den Bereich der Demyelinisierung bei Mäusen zu diesen Zeitpunkten zu bewerten....

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Diskussion

MS, eine chronisch demyelinisierende Erkrankung des ZNS, ist eine der häufigsten Ursachen für neurologische Funktionsstörungen bei jungen Erwachsenen²⁰ Jahren. Klinisch erleben etwa 60%-80% der MS-Patienten den Zyklus von Rückfällen und Remissionen, bevor sie eine sekundär-progrediente MS 21,22 entwickeln^, und es führt schließlich zu kumulativen Bewegungsstörungen und kognitiven Defiziten im Laufe der Zeit²³.

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk	Sigma-Aldrich	L4129-25MG
32 gauge Needle	HAMILTON	7762-05
10 μl syringe	HAMILTON	80014
high speed skull drill	strong,korea	strong204
drill	Hager & Meisinger, Germany	REF 500 104 001 001 005
Matrx Animal Aneathesia Ventilator	MIDMARK	VMR
Portable Stereotaxic Instrument for Mouse	Reward	68507
Micro syringe	Reward	KDS LEGATO 130
Isoflurane	VETEASY
Paraformaldehyde	Servicebio	G1101
Phosphate buffer	BOSTER	PYG0021
LuxoL fast bLue	Servicebio	G1030-100ML
Suture	FUSUNPHARMA	20152021225
Brain mold	Reward	68707
Electron microscope fixative	Servicebio	G1102-100ML
Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain	Sigma-Aldrich	1.01376
Anti-Myelin Basic Protein Antibody	Millipore	#AB5864
Anti-GST-P pAb	MBL	#311
Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15)	Thermo Fisher Scientific	14-5698-95
Beta Actin Monoclonal Antibody	Proteintech	66009-1-Ig
Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody	Proteintech	10458-1-AP
OLIG2 Polyclonal Antibody	Proteintech	13999-1-AP
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)	YEASEN	34206ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)	YEASEN	34412ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	YEASEN	34212ES60
HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	abclonal	AS014
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	abclonal	AS003
Adult C57BL/6 male and female mice	Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd