JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает двухточечную инъекцию лизофосфатидилхолина через стереотаксическую рамку для создания стабильной и воспроизводимой модели демиелинизации у мышей.

Аннотация

Рецептор-опосредованная лизофосфолипидная сигнализация способствует патофизиологии различных неврологических заболеваний, особенно рассеянного склероза (РС). Лизофосфатидилхолин (LPC) является эндогенным лизофосфолипидом, связанным с воспалением, и он может вызывать быстрое повреждение с токсичностью липидов миелина, что приводит к очаговому демиелинизации. Здесь представлен подробный протокол стереотаксической двухточечной инъекции LPC, которая может непосредственно вызвать тяжелую демиелинизацию и быстро и стабильно воспроизвести экспериментальную демиелинизацию у мышей с помощью хирургической процедуры. Таким образом, эта модель очень актуальна для демиелинических заболеваний, особенно РС, и она может способствовать соответствующему продвижению клинически значимых исследований. Кроме того, иммунофлуоресценция и методы быстрого синего окрашивания Luxol были использованы для изображения временного хода демиелинизации в мозолистом теле мышей, которым вводили LPC. Кроме того, поведенческий метод использовался для оценки когнитивной функции мышей после моделирования. В целом, двухточечная инъекция лизофосфатидилхолина через стереотаксическую рамку является стабильным и воспроизводимым методом создания модели демиелинизации у мышей для дальнейшего изучения.

Введение

Рецептор-опосредованная передача лизофосфолипидов включает в себя разнообразные физиологические процессы практически всех систем органов1. В центральной нервной системе (ЦНС) эта сигнализация играет решающую роль в патогенах аутоиммунных неврологических заболеваний, таких как рассеянный склероз (РС). Рассеянный склероз является хроническим иммуноопосредованным расстройством, характеризующимся патологической демиелинизацией и воспалительной реакцией, вызывающей неврологическую дисфункцию и когнитивные нарушения 2,3. После непрерывного рецидива и ремиттирования во время раннего заболевания большинство пациентов в конечном итоге прогрессируют до вторично-прогрессирующей стадии, что может привести к необратимому повреждению мозга и, как следствие, инвалидности4. Считается, что патологической отличительной чертой вторично-прогрессирующего течения являются демиелинизирующие бляшки, вызванные воспалительными поражениями5. Существующие методы лечения РС могут значительно снизить риск рецидива. Тем не менее, до сих пор нет эффективной терапии для долгосрочного демиелинизирующего повреждения, вызванного прогрессирующимMS 6. Таким образом, стабильно установленная и легко воспроизводимая модель требуется для изучения доклинических терапевтических средств, которые фокусируются на дегенерации белого вещества.

Демиелинизация и ремиелинизация являются двумя основными патологическими процессами при развитии рассеянного склероза. Демиелинизация - это потеря миелиновой оболочки вокруг аксонов, индуцированная микроглией с провоспалительными фенотипами7, и это приводит к медленной проводимости нервных импульсов и приводит к потере нейронов и неврологическим расстройствам. Ремиелинизация представляет собой эндогенную реакцию репарации, опосредованную олигодендроцитами, где расстройства могут привести к нейродегенерации и когнитивным нарушениям8. Воспалительная реакция имеет решающее значение для всего процесса, влияя как на степень повреждения миелина, так и на восстановление.

Таким образом, стабильная животная модель стойкой воспалительной демиелинизации имеет значение для дальнейшего изучения терапевтических стратегий для РС. Из-за сложности РС были установлены различные типы моделей животных для имитации демиелинизирующих поражений in vivo, включая экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE), токсико-демиелинизирующие модели, купризон (CPZ) и лизофосфатидилхолин (LPC)9 . LPC является эндогенным лизофосфолипидом, связанным с воспалением, и он может вызывать быстрое повреждение с токсичностью липидов миелина, что приводит к очаговой демиелинизации. На основе предыдущих отчетов и исследований10,11 приведен подробный протокол двухточечной инъекции с некоторыми модификациями. Как правило, классическая одноточечная модель инъекции LPC производит только местную демиелинизацию в месте инъекции и часто сопровождается спонтанной ремиелинизацией12,13. Тем не менее, двухточечная инъекционная модель LPC может продемонстрировать, что LPC может непосредственно индуцировать демиелинизацию в мозолистом теле мыши и вызывать более длительную демиелинизацию с небольшой регенерацией миелина.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом института по уходу за животными Медицинского колледжа Тунцзи, Университет науки и технологии Хуачжун, Китай. Для настоящего исследования использовались взрослые самцы и самки мышей C57BL/6 (дикий тип, WT; 20-25 г; 8-10 недель). Мыши были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов). Мышей размещали в специальном животном учреждении без патогенов (SPF) с водой и пищей, поставляемой ad libitum. Их выдерживали в чередующемся 12-часовом периоде светлого и темного цикла в стандартных условиях температуры 22 °С и относительной влажности воздуха 55%-60%.

1. Приготовление раствора LPC

  1. Растворить 25 мг порошка LPC (см. Таблицу материалов) с 250 мкл смешанного раствора хлороформа и метанола (1:1), чтобы получить 10% раствор LPC и перенести его в центрифужную трубку объемом 500 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если LPC не полностью растворен, поместите трубку центрифуги в ультразвуковой очиститель и ультразвук на частоте 40 кГц в течение ~ 1 ч для получения однородного раствора.
  2. Разделить раствор на 3 мкл/пробирку и хранить при температуре −80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор может храниться ~2 года.
  3. Перед операцией раствор разбавляют (стадия 1.2.) 27 мкл 0,9% раствора NaCl, и держат раствор на водяной бане постоянной температуры при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте раствор непосредственно перед началом инъекции.

2. Хирургическая подготовка

  1. Используйте иглу 32 г, 2 дюйма для подключения к шприцу объемом 5 мкл (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что микролитровый шприц беспрепятственный. Выводят 5 мкл раствора LPC для приготовления инъекций.
  2. Обезболивают мышь в индукционной камере, подключенной к испарителю изофлурану 3% изофлурану, смешанному со 100% кислородом со скоростью около 0,3 л/мин.
  3. Подтвердите глубину анестезии отсутствием рефлекса защемления пальцев ног при плавном дыхании.
  4. Побрить головку мыши между ушами с помощью электробритвы. Наносите смазывающие глазные капли, чтобы предотвратить сухость роговицы во время процедуры.
  5. Затем поместите мышь в стереотаксическую рамку (см. Таблицу материалов) спинной стороной вверх и закрепите голову носовым конусом и зубным зажимом. Поддерживайте анестезию с 1,2% -1,6% изофлурана через нос.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация изофлурана может быть скорректирована в соответствии с респираторным статусом мышей.

3. Хирургическая процедура

ПРИМЕЧАНИЕ: Животные помещаются на грелку во время всех процедур.

  1. Прикрепите мышь к стереотаксическому аппарату с помощью двусторонних ушных вкладышей. Убедитесь, что ушные вкладыши ровные, а голова горизонтальная и устойчивая.
  2. Дезинфицируйте кожу на голове, протирая несколько раз йодофором с последующим спиртом круговыми движениями. Затем используйте скальпель, чтобы разрезать небольшой разрез около 1,5 см вдоль средней линии кожи головы, чтобы обнажить череп.
  3. Протрите череп ватным тампоном, смоченным в 1% перекиси водорода, пока не обнажаются брегма, лямбда и задний родничок. Поместите шприц на стереотаксический аппарат.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перекись водорода с осторожностью и избегайте прикосновения к окружающим тканям.
  4. Обеспечьте горизонтальное расположение головы животного (как спереди, так и сзади, а также влево и вправо).
    1. Отрегулируйте ручку оси Z стереотаксической рамки так, чтобы кончик иглы и череп просто соприкасались без изгиба, затем измерьте координату оси Z. Проверьте координаты Z брегмы и заднего родничка.
    2. Отрегулируйте ушную перекладину так, чтобы разница между Z-координатами брегмы и заднего родничка составляла не более 0,02 мм. Затем следуйте тому же методу, чтобы измерить Z-координаты соответствующих позиций на левой и правой сторонах средней линии. Отрегулируйте амбушюру, чтобы левая и правая были на одном уровне.
  5. Найдите мозолистое тело. Задайте для источника XYZ значение bregma.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первый участок инъекции находится на расстоянии 1,0 мм сбоку от брегмы, глубиной 2,4 мм и передней частью 1,1 мм. Второе место инъекции составляет 1,0 мм сбоку от брегмы, глубиной 2,1 мм и передней частью 0,6 мм. Например, координата брегмы (0,0,0). Измерьте координату Z соответствующего местоположения, обозначенного как (-1, 1.1, X) и (-1, 0,6, Y). Можно определить координату первого места инъекции мозолистого тела (-1, 1,1, −[X + 2,4]), а второго места инъекции — (-1, 0,6, −[Y + 2,1]).
  6. Как только место инъекции определено, сделайте отметку стерильным маркером на черепе и запишите координаты.
  7. Аккуратно просверлите отмеченный участок с помощью сверла черепа (см. Таблицу материалов). Позаботьтесь о том, чтобы избежать кровотечения.
  8. Медленно переместите иглу к заданным координатам и начните инъекцию. Чтобы индуцировать демиелинизацию мозолистого тела, вводят 2 мкл раствора LPC (стадия 1.) в каждое место инъекции (стадия 3.5.) со скоростью 0,4 мкл/мин.
  9. После инъекции держите иглу в каждом месте в течение дополнительных 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что интервал двух инъекций составляет не более 20 мин.
  10. Зашить кожу швом 4-0 и подождать, пока животное проснется в течение 10 минут. Вводите анальгетики после операции в соответствии с институциональными правилами ухода за животными.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое время для эвтаназии может быть определено в соответствии с целью эксперимента.

4. Извлечение проб для фокальной демиелинизации

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию об этом шаге см. в ранее опубликованном докладе14.

  1. Растворить нейтральный красный краситель (см. Таблицу материалов) в 1% растворе в фосфат-буферном физиологическом растворе (PBS).
  2. за несколько часов до жертвоприношения мышей (подробности см. в предыдущей ссылке10) вводят 500 мкл 1% нейтрального красного красителя в PBS путем внутрибрюшинной инъекции для каждой мыши.
  3. Выполняют сердечную перфузию12 с 30 мл 0,1% PBS предварительно охлажденной при 4 °C.
  4. Нарежьте мозг на 1 мм с помощью мозговой формы (см. Таблицу материалов).
  5. Визуализируйте поражение, окрашенное нейтральным красным цветом под микроскопом, и диссоциируйте поражение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите как можно больше окружающих нормальных тканей для повышения точности последующего анализа. Ткань поражения может быть исследована с помощью ОТ-ПЦР, электронной микроскопии и анализа вестерн-блоттинга.

5. Гистологическое окрашивание и иммунофлуоресценция

  1. Для гистологического окрашивания и иммунофлуоресценции12, после перфузии сердца (стадия 4.3.), удаляют мозг10, фиксируют в 4% PFA на ночь (при 4 °C) и полностью обезвоживают в 30% сахарозы.
  2. Нарежьте на 20 мм корональные срезы мозга с помощью замороженного слайсера10 при постоянной температуре (−20 °C).
  3. Используйте ломтики для окрашивания Luxol fast blue (LFB), иммунофлуоресценции и вестерн-блоттинга10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Двухточечная инъекция LPC привела к более длительной демиелинизации
LPC в основном приводит к быстрому повреждению с токсичностью миелина и расщеплению целостности аксона15. День инъекции считался днем 0. Мышей держали в течение 10-28 дней (10 dpi и 28 dpi). Быстрое синее ок?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

РС, хроническое демиелинизирующее заболевание ЦНС, является одной из наиболее распространенных причин неврологической дисфункции у молодых людей20 лет. Клинически примерно 60%-80% пациентов с РС испытывают цикл рецидивов и ремиссий до развития вторично-прогрессирующего РС

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (гранты: 82071380, 81873743).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolkSigma-AldrichL4129-25MG
32 gauge NeedleHAMILTON7762-05
10 μl syringeHAMILTON80014
high speed skull drillstrong,koreastrong204
drillHager & Meisinger, Germany REF 500 104 001 001 005
Matrx Animal Aneathesia VentilatorMIDMARKVMR
Portable Stereotaxic Instrument for MouseReward68507
Micro syringeRewardKDS LEGATO 130
Isoflurane VETEASY
ParaformaldehydeServicebioG1101
Phosphate bufferBOSTERPYG0021
LuxoL fast bLueServicebioG1030-100ML
SutureFUSUNPHARMA20152021225
Brain moldReward68707
Electron microscope fixativeServicebioG1102-100ML
Neutral red (C.I. 50040), for microscopy CertistainSigma-Aldrich1.01376
Anti-Myelin Basic Protein Antibody Millipore#AB5864
Anti-GST-P pAbMBL#311
Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15)Thermo Fisher Scientific14-5698-95
Beta Actin Monoclonal AntibodyProteintech66009-1-Ig 
Myelin Basic Protein Polyclonal AntibodyProteintech10458-1-AP
OLIG2 Polyclonal AntibodyProteintech13999-1-AP
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)YEASEN34206ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) YEASEN34412ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) YEASEN34212ES60
HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)abclonalAS014
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) abclonalAS003
Adult C57BL/6 male and female miceHunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd

Ссылки

  1. Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864(2021).
  2. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  3. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  4. Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).
  5. Filippi, M., et al. Multiple sclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43(2018).
  6. Villoslada, P., Steinman, L. New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).
  7. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936(2018).
  8. Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: From biology to therapy. Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).
  9. Gentile, A., et al. Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2197(2019).
  10. Chen, M., et al. Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333(2020).
  11. Luo, Q., et al. A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination. Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).
  12. Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).
  13. Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis. Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).
  14. Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
  15. Plemel, J. R., et al. Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy. Glia. 66 (2), 327-347 (2018).
  16. Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
  17. Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).
  18. Kassis, H., et al. Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).
  19. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
  20. Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).
  21. Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
  22. Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).
  23. Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128, Pt 11 2705-2712 (2005).
  24. Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality). Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
  25. Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum. Journal of Neuroimmunology. 334, 576995(2019).
  26. Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. The cuprizone model for demyelination. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).
  27. Zhan, J., et al. The cuprizone model: Dos and do nots. Cells. 9 (4), 843(2020).
  28. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).
  29. Merkler, D., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).
  30. Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены