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  • Résumé
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  • Protocole
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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le présent protocole décrit une injection en deux points de lysophosphatidylcholine via un cadre stéréotaxique pour générer un modèle de démyélinisation stable et reproductible chez la souris.

Résumé

La signalisation des lysophospholipides médiée par les récepteurs contribue à la physiopathologie de diverses maladies neurologiques, en particulier la sclérose en plaques (SEP). La lysophosphatidylcholine (LPC) est un lysophospholipide endogène associé à l’inflammation, et il pourrait induire des dommages rapides avec une toxicité pour les lipides de myéline, conduisant à la démyélinisation focale. Ici, un protocole détaillé est présenté pour l’injection stéréotaxique de LPC en deux points qui pourrait directement provoquer une démyélinisation sévère et reproduire la lésion expérimentale de démyélinisation rapidement et de manière stable chez la souris par une intervention chirurgicale. Ainsi, ce modèle est très pertinent pour les maladies de démyélinisation, en particulier la SEP, et il peut contribuer à l’avancement connexe de la recherche cliniquement pertinente. En outre, l’immunofluorescence et les méthodes de coloration bleue rapide Luxol ont été utilisées pour décrire l’évolution temporelle de la démyélinisation dans le corps calleux de souris injectées avec LPC. En outre, la méthode comportementale a été utilisée pour évaluer la fonction cognitive des souris après modélisation. Dans l’ensemble, l’injection en deux points de lysophosphatidylcholine via un cadre stéréotaxique est une méthode stable et reproductible pour générer un modèle de démyélinisation chez la souris pour une étude plus approfondie.

Introduction

La signalisation des lysophospholipides médiée par les récepteurs implique divers processus physiologiques de presque tous les systèmes d’organes1. Dans le système nerveux central (SNC), cette signalisation joue un rôle essentiel dans les pathogenies des maladies neurologiques auto-immunes telles que la sclérose en plaques (SEP). La sclérose en plaques est un trouble chronique à médiation immunitaire caractérisé par une démyélinisation pathologique et une réponse inflammatoire, provoquant un dysfonctionnement neurologique et des troubles cognitifs 2,3. Après une rechute et une rémission continues au début de la maladie, la plupart des patients finissent par passer au stade secondaire-progressif, ce qui pourrait causer des dommages irréversibles au cerveau et une invalidité résultante4. On pense que la caractéristique pathologique de l’évolution secondaire-progressive est les plaques démyélinisantes causées par des lésions inflammatoires5. Les traitements existants de la SP peuvent réduire considérablement le risque de rechute. Cependant, il n’existe toujours pas de traitement efficace pour les dommages démyélinisants à long terme causés par la SEPprogressive 6. Ainsi, un modèle stable et facilement reproductible est nécessaire pour étudier les thérapies précliniques qui se concentrent sur la dégénérescence de la substance blanche.

La démyélinisation et la remyélinisation sont deux processus pathologiques majeurs dans le développement de la sclérose en plaques. La démyélinisation est la perte de gaine de myéline autour des axones induite par la microglie avec des phénotypes pro-inflammatoires7, et elle conduit à une conduction lente de l’influx nerveux et entraîne la perte de neurones et de troubles neurologiques. La remyélinisation est une réponse de réparation endogène médiée par des oligodendrocytes, où les troubles pourraient entraîner une neurodégénérescence et des troubles cognitifs8. La réponse inflammatoire est cruciale pour l’ensemble du processus, affectant à la fois le degré de lésion de la myéline et la réparation.

Par conséquent, un modèle animal stable de démyélinisation inflammatoire persistante est utile pour explorer plus avant les stratégies thérapeutiques pour la SEP. En raison de la complexité de la SEP, divers types de modèles animaux ont été établis pour imiter les lésions démyélinisantes in vivo, y compris l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), les modèles toxiques-démyélinisants, la cuprizone (CPZ) et la lysophosphatidylcholine (LPC)9 . Le LPC est un lysophospholipide endogène associé à l’inflammation, et il pourrait induire des dommages rapides avec une toxicité pour les lipides de myéline, conduisant à la démyélinisation focale. Sur la base de rapports précédents et de recherches10,11, un protocole détaillé d’injection en deux points avec quelques modifications est fourni. Généralement, le modèle d’injection LPC classique en un point ne produit qu’une démyélinisation locale au site d’injection et s’accompagne souvent d’une remyélinisation spontanée12,13. Cependant, le modèle LPC à injection en deux points peut démontrer que le LPC peut directement induire une démyélinisation dans le corps calleux de la souris et provoquer une démyélinisation plus durable avec peu de régénération de la myéline.

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Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité de l’Institut des soins aux animaux du Tongji Medical College, Université des sciences et de la technologie de Huazhong, en Chine. Des souris mâles et femelles adultes C57BL/6 (type sauvage, WT; 20-25 g; 8-10 semaines) ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues à partir de sources commerciales (voir tableau des matériaux). Les souris ont été hébergées dans une installation spécifique exempte d’agents pathogènes (FPS) avec de l’eau et de la nourriture fournies ad libitum. Ils ont été maintenus dans une période alternée de 12 h de cycle clair et sombre dans les conditions standard de température de 22 °C et d’humidité relative de 55% à 60%.

1. Préparation de la solution LPC

  1. Dissoudre 25 mg de poudre de LPC (voir tableau des matériaux) avec 250 μL de chloroforme et de solution mélangée de méthanol (1:1) pour obtenir une solution de LPC à 10 % et la transférer dans un tube de centrifugeuse de 500 μL.
    REMARQUE: Si le LPC n’est pas complètement dissous, placez le tube de centrifugeuse dans un nettoyeur à ultrasons et ultrasonez à 40 kHz pendant environ 1 h pour obtenir une solution uniforme.
  2. Répartir la solution en 3 μL/tube et conserver à −80 °C.
    REMARQUE: La solution peut être stockée pendant environ 2 ans.
  3. Avant la chirurgie, diluer la solution (étape 1.2.) avec 27 μL de solution de NaCl à 0,9 % et conserver la solution dans un bain-marie à température constante à 37 °C.
    REMARQUE: Préparez la solution juste avant de commencer l’injection.

2. Préparation chirurgicale

  1. Utilisez une aiguille de 32 G, 2 pouces pour vous connecter à une seringue de 5 μL (voir tableau des matériaux). Assurez-vous que la seringue microlitre n’est pas obstruée. Prélever 5 μL de solution de LPC pour la préparation de l’injection.
  2. Anesthésier la souris dans une chambre d’induction reliée à un vaporisateur d’isoflurane avec 3% d’isoflurane mélangé à 100% d’oxygène à une vitesse d’environ 0,3 L / min.
  3. Confirmez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pincement des orteils pendant que la respiration est douce.
  4. Rasez la tête de la souris entre les oreilles à l’aide d’un rasoir électrique. Appliquez des gouttes oculaires lubrifiantes pour prévenir la sécheresse de la cornée pendant la procédure.
  5. Ensuite, positionnez la souris dans un cadre stéréotaxique (voir Tableau des matériaux) avec la face dorsale vers le haut et fixez la tête avec un cône de nez et une pince à dents. Maintenir l’anesthésie avec 1,2% -1,6% d’isoflurane par le nez.
    REMARQUE: La concentration d’isoflurane peut être ajustée en fonction de l’état respiratoire des souris.

3. Intervention chirurgicale

REMARQUE: Les animaux sont placés sur un coussin chauffant pendant toutes les procédures.

  1. Fixez la souris à l’appareil stéréotaxique avec des barres d’oreille bilatérales. Assurez-vous que les barres d’oreille sont de niveau et que la tête est horizontale et stable.
  2. Désinfectez la peau de la tête en essuyant plusieurs fois avec de l’iodophore suivi d’alcool en mouvement circulaire. Utilisez ensuite un scalpel pour couper une petite incision d’environ 1,5 cm le long de la ligne médiane du cuir chevelu pour exposer le crâne.
  3. Essuyez le crâne avec un coton-tige trempé dans du peroxyde d’hydrogène à 1% jusqu’à ce que la fontanelle bregma, lambda et postérieure soit exposée. Placez la seringue sur l’appareil stéréotaxique.
    REMARQUE: Utilisez le peroxyde d’hydrogène avec précaution et évitez de toucher les tissus environnants.
  4. Assurer le positionnement horizontal de la tête de l’animal (avant et arrière et gauche et droite).
    1. Ajustez le bouton de l’axe Z du cadre stéréotaxique de sorte que la pointe de l’aiguille et le crâne se touchent sans se plier, puis mesurez la coordonnée de l’axe Z. Vérifiez les coordonnées Z de bregma et de la fontanelle postérieure.
    2. Ajustez la barre auriculaire de sorte que la différence entre les coordonnées Z de bregma et de fontanelle postérieure ne dépasse pas 0,02 mm. Ensuite, suivez la même méthode pour mesurer les coordonnées Z des positions correspondantes sur les côtés gauche et droit de la ligne médiane. Ajustez la barre auriculaire pour vous assurer que la gauche et la droite sont au même niveau.
  5. Localisez le corps calleux. Définissez l’origine XYZ sur bregma.
    REMARQUE: Le premier site d’injection est de 1,0 mm latéral au bregma, de 2,4 mm de profondeur et de 1,1 mm antérieur. Le deuxième site d’injection est de 1,0 mm latéral au bregma, de 2,1 mm de profondeur et de 0,6 mm antérieur. Par exemple, la coordonnée du bregma est (0,0,0). Mesurez la coordonnée Z de l’emplacement correspondant marqué comme (-1, 1,1, X) et (-1, 0,6, Y). On peut déterminer que la première coordonnée du site d’injection du corps calleux est (-1, 1,1, −[X + 2,4]), et que le deuxième site d’injection est (-1, 0,6, −[Y + 2,1]).
  6. Une fois le site d’injection déterminé, faites une marque avec un marqueur stérile sur le crâne et enregistrez les coordonnées.
  7. Percez doucement le site marqué avec une perceuse à crâne (voir Tableau des matériaux). Prenez soin d’éviter tout saignement.
  8. Déplacez lentement l’aiguille aux coordonnées données et commencez l’injection. Pour induire la démyélinisation du corps calleux, injecter 2 μL de solution de LPC (étape 1.) à chaque site d’injection (étape 3.5.) à raison de 0,4 μL/min.
  9. Après l’injection, conservez l’aiguille dans chaque site pendant 10 minutes supplémentaires.
    REMARQUE: Assurez-vous que l’intervalle de deux injections ne dépasse pas 20 min.
  10. Suturez la peau avec une suture 4-0 et attendez que l’animal se réveille dans les 10 minutes. Administrer les analgésiques après l’opération conformément à la réglementation institutionnelle en matière de soins aux animaux.
    REMARQUE: Le temps recommandé pour l’euthanasie peut être déterminé en fonction du but de l’expérience.

4. Extraction d’échantillons pour la démyélinisation focale

REMARQUE: Pour plus de détails concernant cette étape, veuillez consulter le rapport14 publié précédemment.

  1. Dissoudre le colorant rouge neutre (voir tableau des matériaux) dans une solution à 1 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  2. quelques heures avant de sacrifier les souris (pour plus de détails, voir la référenceprécédente 10), injecter 500 μL de colorant rouge neutre à 1 % dans le PBS par injection intrapéritonéale pour chaque souris.
  3. Effectuer une perfusion cardiaque12 avec 30 mL de PBS à 0,1 % prérefroidi à 4 °C.
  4. Découpez le cerveau en 1 mm avec un moule cérébral (voir Tableau des matériaux).
  5. Visualisez la lésion colorée avec du rouge neutre au microscope et dissociez la lésion.
    REMARQUE: Enlevez autant de tissu normal environnant que possible pour améliorer la précision de l’analyse ultérieure. Le tissu lésionnel peut être examiné par RT-PCR, microscopie électronique et analyses par transfert western.

5. Coloration histologique et immunofluorescence

  1. Pour la coloration histologique et l’immunofluorescence12, après perfusion cardiaque (étape 4.3.), retirez le cerveau10, fixez 4% de PFA pendant la nuit (à 4 ° C) et déshydratez complètement dans 30% de saccharose.
  2. Couper en sections coronales du cerveau de 20 mm à l’aide d’une trancheusecongelée 10 à température constante (−20 °C).
  3. Utilisez les tranches pour la coloration Luxol fast blue (LFB), l’immunofluorescence et le western blot10.

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Résultats

L’injection en deux points du LPC a entraîné une démyélinisation plus durable
Le LPC entraîne principalement des dommages rapides avec toxicité pour la myéline et clivage de l’intégrité de l’axone15. Le jour de l’injection était considéré comme le jour 0. Les souris ont été gardées pendant une période de 10 à 28 jours (10 dpi et 28 dpi). La coloration Luxol fast blue (LFB)10 a été utilisée pour évaluer la zone de démyélinis...

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Discussion

La SEP, une maladie démyélinisante chronique du SNC, est l’une des causes les plus fréquentes de dysfonctionnement neurologique chez les jeunes adultesde 20 ans. Cliniquement, environ 60 % à 80 % des patients atteints de SEP connaissent le cycle de rechutes et de rémissions avant de développer une SEP progressive secondaire21,22, et cela conduit finalement à des troubles cumulatifs du mouvement et des déficits cognitifs au fil du...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Subventions: 82071380, 81873743).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolkSigma-AldrichL4129-25MG
32 gauge NeedleHAMILTON7762-05
10 μl syringeHAMILTON80014
high speed skull drillstrong,koreastrong204
drillHager & Meisinger, Germany REF 500 104 001 001 005
Matrx Animal Aneathesia VentilatorMIDMARKVMR
Portable Stereotaxic Instrument for MouseReward68507
Micro syringeRewardKDS LEGATO 130
Isoflurane VETEASY
ParaformaldehydeServicebioG1101
Phosphate bufferBOSTERPYG0021
LuxoL fast bLueServicebioG1030-100ML
SutureFUSUNPHARMA20152021225
Brain moldReward68707
Electron microscope fixativeServicebioG1102-100ML
Neutral red (C.I. 50040), for microscopy CertistainSigma-Aldrich1.01376
Anti-Myelin Basic Protein Antibody Millipore#AB5864
Anti-GST-P pAbMBL#311
Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15)Thermo Fisher Scientific14-5698-95
Beta Actin Monoclonal AntibodyProteintech66009-1-Ig 
Myelin Basic Protein Polyclonal AntibodyProteintech10458-1-AP
OLIG2 Polyclonal AntibodyProteintech13999-1-AP
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)YEASEN34206ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) YEASEN34412ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) YEASEN34212ES60
HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)abclonalAS014
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) abclonalAS003
Adult C57BL/6 male and female miceHunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd

Références

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