Un'iniezione a due punti stabilmente stabilita del modello di demielinizzazione focale indotta da lisofosfatidilcolina nei topi

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un'iniezione a due punti di lisofosfatidilcolina attraverso un frame stereotassico per generare un modello di demielinizzazione stabile e riproducibile nei topi.

Abstract

La segnalazione dei lisofosfolipidi mediata dal recettore contribuisce alla fisiopatologia di diverse malattie neurologiche, in particolare la sclerosi multipla (SM). La lisofosfatidilcolina (LPC) è un lisofosfolipide endogeno associato all'infiammazione e potrebbe indurre un rapido danno con tossicità ai lipidi mielinici, portando alla demielinizzazione focale. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per l'iniezione stereotassica di LPC a due punti che potrebbe causare direttamente una grave demielinizzazione e replicare la lesione da demielinizzazione sperimentale in modo rapido e stabile nei topi mediante procedura chirurgica. Pertanto, questo modello è molto rilevante per le malattie da demielinizzazione, in particolare la SM, e può contribuire al relativo avanzamento della ricerca clinicamente rilevante. Inoltre, l'immunofluorescenza e i metodi di colorazione blu veloce Luxol sono stati utilizzati per rappresentare il decorso temporale della demielinizzazione nel corpo calloso dei topi iniettati con LPC. Inoltre, il metodo comportamentale è stato utilizzato per valutare la funzione cognitiva dei topi dopo la modellazione. Nel complesso, l'iniezione a due punti di lisofosfatidilcolina attraverso un frame stereotassico è un metodo stabile e riproducibile per generare un modello di demielinizzazione nei topi per ulteriori studi.

Introduzione

La segnalazione dei lisofosfolipidi mediata dal recettore coinvolge diversi processi fisiologici di quasi tutti i sistemi di organi¹. Nel sistema nervoso centrale (SNC), questa segnalazione svolge un ruolo fondamentale nella patogenetà delle malattie neurologiche autoimmuni come la sclerosi multipla (SM). La sclerosi multipla è una malattia cronica immuno-mediata caratterizzata da demielinizzazione patologica e risposta infiammatoria, che causa disfunzione neurologica e deterioramento cognitivo ^2,3. Dopo continue recidive e remittenti durante la malattia precoce, la maggior parte dei pazienti alla fine progredisce allo stadio secondario-progressivo, che potrebbe causare danni irreversibili al cervello e conseguente disabilità⁴. Si ritiene che il segno patologico del decorso secondario-progressivo sia la demielinizzazione delle placche causate da lesioni infiammatorie⁵. I trattamenti esistenti per la SM possono ridurre significativamente il rischio di recidiva. Tuttavia, non esiste ancora una terapia efficace per il danno demielinizzante a lungo termine causato dalla SM⁶ progressiva. Pertanto, è necessario un modello stabilmente stabilito e facilmente riproducibile per studiare terapie precliniche che si concentrano sulla degenerazione della sostanza bianca.

La demielinizzazione e la rimielinizzazione sono due importanti processi patologici nello sviluppo della sclerosi multipla. La demielinizzazione è la perdita della guaina mielinica intorno agli assoni indotta da microglia con fenotipi pro-infiammatori⁷, e porta a una lenta conduzione degli impulsi nervosi e provoca la perdita di neuroni e disturbi neurologici. La rimielinizzazione è una risposta di riparazione endogena mediata da oligodendrociti, in cui i disturbi potrebbero portare a neurodegenerazione e deterioramento cognitivo⁸. La risposta infiammatoria è cruciale per l'intero processo, influenzando sia il grado di danno mielinico che la riparazione.

Pertanto, un modello animale stabile di demielinizzazione infiammatoria persistente è significativo per un'ulteriore esplorazione delle strategie terapeutiche per la SM. A causa della complessità della SM, sono stati stabiliti vari tipi di modelli animali per imitare le lesioni demielinizzanti in vivo, tra cui l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), i modelli tossico-demielinizzanti, il cuprizone (CPZ) e la lisofosfatidilcolina (LPC)⁹ . LPC è un lisofosfolipide endogeno associato all'infiammazione e potrebbe indurre un rapido danno con tossicità ai lipidi mielinici, portando alla demielinizzazione focale. Sulla base di precedenti rapporti e ricerche^10,11, viene fornito un protocollo dettagliato di iniezione a due punti con alcune modifiche. Generalmente, il classico modello di iniezione LPC a un punto produce solo demielinizzazione locale nel sito di iniezione ed è spesso accompagnato da rimielinizzazione spontanea^12,13. Tuttavia, il modello LPC a iniezione a due punti può dimostrare che l'LPC può indurre direttamente demielinizzazione nel corpo calloso del topo e causare demielinizzazione più duratura con poca rigenerazione della mielina.

Protocollo

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dall'Institute of Animal Care Committee del Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Cina. Per il presente studio sono stati utilizzati topi adulti C57BL/6 maschi e femmine (wild type, WT; 20-25 g; 8-10 settimane di età). I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali). I topi sono stati ospitati in una specifica struttura per animali privi di agenti patogeni (SPF) con acqua e cibo forniti ad libitum. Sono stati mantenuti in un periodo alternato di 12 ore di ciclo di luce e buio nelle condizioni standard di temperatura di 22 °C e umidità relativa del 55%-60%.

1. Preparazione della soluzione LPC

1. Sciogliere 25 mg di polvere di LPC (vedere Tabella dei materiali) con 250 μL di cloroformio e soluzione mista di metanolo (1:1) per ottenere una soluzione LPC al 10% e trasferirla in un tubo centrifugo da 500 μL.
   NOTA: Se l'LPC non è completamente disciolto, posizionare il tubo della centrifuga in un pulitore ad ultrasuoni e ultrasuoni a 40 kHz per ~ 1 ora per ottenere una soluzione uniforme.
2. Dividere la soluzione in 3 μL/tubo e conservare a -80 °C.
   NOTA: la soluzione può essere conservata per ~ 2 anni.
3. Prima dell'intervento chirurgico, diluire la soluzione (fase 1.2.) con 27 μL di soluzione di NaCl allo 0,9% e mantenere la soluzione a bagnomaria a temperatura costante a 37 °C.
   NOTA: Preparare la soluzione poco prima di iniziare l'iniezione.

2. Preparazione chirurgica

1. Utilizzare un ago da 32 G, 2 pollici per collegarlo a una siringa da 5 μL (vedere Tabella dei materiali). Assicurarsi che la siringa del microlitro non sia ostruita. Prelevare 5 μL di soluzione LPC per la preparazione dell'iniezione.
2. Anestetizzare il mouse in una camera di induzione collegata ad un vaporizzatore isoflurano con il 3% di isoflurano miscelato con ossigeno al 100% ad una velocità di circa 0,3 L/min.
3. Confermare la profondità dell'anestesia dalla mancanza del riflesso del pizzico della punta mentre la respirazione è liscia.
4. Rasare la testa del mouse tra le orecchie usando un rasoio elettrico. Applicare colliri lubrificanti per prevenire la secchezza corneale durante la procedura.
5. Quindi, posizionare il mouse in una cornice stereotassica (vedere Tabella dei materiali) con il lato dorsale verso l'alto e fissare la testa con un cono nasale e un morsetto dentale. Mantenere l'anestesia con 1,2% -1,6% di isoflurano attraverso il naso.
   NOTA: La concentrazione di isoflurano può essere regolata in base allo stato respiratorio dei topi.

3. Procedura chirurgica

NOTA: gli animali vengono posizionati su una piastra riscaldante durante tutte le procedure.

1. Fissare il mouse all'apparato stereotassico con barre auricolari bilaterali. Assicurarsi che le barre auricolari siano livellate e che la testa sia orizzontale e stabile.
2. Disinfettare la pelle della testa pulendo più volte con iodoforo seguito da alcool in movimento circolare. Quindi utilizzare un bisturi per tagliare una piccola incisione di circa 1,5 cm lungo la linea mediana del cuoio capelluto per esporre il cranio.
3. Pulire il cranio con un batuffolo di cotone immerso nell'1% di perossido di idrogeno fino a quando la bregma, la lambda e la fontanella posteriore sono esposte. Posizionare la siringa sull'apparecchio stereotassico.
   NOTA: Utilizzare il perossido di idrogeno con cura ed evitare di toccare i tessuti circostanti.
4. Garantire il posizionamento orizzontale della testa dell'animale (sia anteriore che posteriore e sinistra e destra).
   1. Regolare la manopola dell'asse Z del telaio stereotassico in modo che la punta dell'ago e il cranio tocchino senza piegarsi, quindi misurare la coordinata dell'asse Z. Controllare le coordinate Z di bregma e fontanella posteriore.
   2. Regolare la barra auricolare in modo che la differenza tra le coordinate Z di bregma e fontanella posteriore non sia superiore a 0,02 mm. Quindi, seguire lo stesso metodo per misurare le coordinate Z delle posizioni corrispondenti sui lati sinistro e destro della linea mediana. Regola la barra delle orecchie per assicurarti che la sinistra e la destra siano allo stesso livello.
5. Individuare il corpo calloso. Impostare l'origine XYZ su bregma.
   NOTA: il primo sito di iniezione è di 1,0 mm laterale al bregma, profondo 2,4 mm e anteriore di 1,1 mm. Il secondo sito di iniezione è laterale di 1,0 mm rispetto al bregma, profondo 2,1 mm e anteriore di 0,6 mm. Ad esempio, la coordinata del bregma è (0,0,0). Misurare la coordinata Z della posizione corrispondente contrassegnata come (-1, 1.1, X) e (-1, 0.6, Y). Si può determinare che la prima coordinata del sito di iniezione del corpo calloso è (-1, 1.1, −[X + 2.4]), e il secondo sito di iniezione è (-1, 0.6, −[Y + 2.1]).
6. Una volta determinato il sito di iniezione, fare un segno con un marcatore sterile sul cranio e registrare le coordinate.
7. Forare delicatamente il sito contrassegnato con un trapano a teschio (vedere Tabella dei materiali). Fare attenzione ad evitare qualsiasi sanguinamento.
8. Spostare lentamente l'ago alle coordinate indicate e iniziare l'iniezione. Per indurre la demielinizzazione del corpo calloso, iniettare 2 μL di soluzione di LPC (fase 1.) in ogni sito di iniezione (fase 3.5.) ad una velocità di 0,4 μL/min.
9. Dopo l'iniezione, tenere l'ago in ogni sito per altri 10 minuti.
   NOTA: Assicurarsi che l'intervallo di due iniezioni non sia superiore a 20 minuti.
10. Sutura la pelle con una sutura 4-0 e attendi che l'animale si svegli entro 10 minuti. Somministrare analgesici postoperatoriamente in conformità con le normative istituzionali sulla cura degli animali.
    NOTA: Il tempo raccomandato per l'eutanasia può essere determinato in base allo scopo dell'esperimento.

4. Estrazione del campione per la demielinizzazione focale

NOTA: per i dettagli relativi a questo passaggio, consultare il rapporto¹⁴ pubblicato in precedenza.

1. Sciogliere il colorante rosso neutro (vedere Tabella dei materiali) in una soluzione all'1% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
2. ore prima di sacrificare i topi (per i dettagli, vedere il riferimento precedente¹⁰), iniettare 500 μL di colorante rosso neutro all'1% in PBS mediante iniezione intraperitoneale per ciascun topo.
3. Eseguire la perfusione cardiaca¹² con 30 ml di PBS allo 0,1% preraffreddati a 4 °C.
4. Taglia il cervello in 1 mm con uno stampo cerebrale (vedi Tabella dei materiali).
5. Visualizzare la lesione macchiata di rosso neutro al microscopio e dissociare la lesione.
   NOTA: Rimuovere il più possibile il tessuto normale circostante per migliorare l'accuratezza dell'analisi successiva. Il tessuto della lesione può essere esaminato con RT-PCR, microscopia elettronica e analisi western blot.

5. Colorazione istologica e immunofluorescenza

1. Per la colorazione istologica e l'immunofluorescenza¹², dopo la perfusione cardiaca (fase 4.3.), rimuovere il cervello¹⁰, fissare in PFA al 4% durante la notte (a 4 °C) e disidratare completamente in saccarosio al 30%.
2. Tagliare in sezioni coronali del cervello di 20 mm utilizzando un'affettatrice^{congelata 10} a temperatura costante (-20 °C).
3. Utilizzare le fette per la colorazione Luxol fast blue (LFB), l'immunofluorescenza e il western blot¹⁰.

Risultati

L'iniezione a due punti dell'LPC ha determinato una demielinizzazione più duratura
LPC porta principalmente a danni rapidi con tossicità alla mielina e scissione dell'integrità dell'assone¹⁵. Il giorno dell'iniezione è stato considerato come giorno 0. I topi sono stati conservati per un periodo di 10-28 giorni (10 dpi e 28 dpi). La colorazione Luxol fast blue (LFB)¹⁰ è stata utilizzata per valutare l'area di demielinizzazione nei topi in questi punt...

Discussione

La SM, una malattia demielinizzante cronica del SNC, è una delle cause più comuni di disfunzione neurologica nei giovani adulti²⁰. Clinicamente, circa il 60%-80% dei pazienti con SM sperimenta il ciclo di recidive e remissioni prima di sviluppare una SM^21,22 secondaria-progressiva, e alla fine porta a disturbi cumulativi del movimento e deficit cognitivi nel tempo²³. Attualmente, nessun singolo modello sperimental...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk	Sigma-Aldrich	L4129-25MG
32 gauge Needle	HAMILTON	7762-05
10 μl syringe	HAMILTON	80014
high speed skull drill	strong,korea	strong204
drill	Hager & Meisinger, Germany	REF 500 104 001 001 005
Matrx Animal Aneathesia Ventilator	MIDMARK	VMR
Portable Stereotaxic Instrument for Mouse	Reward	68507
Micro syringe	Reward	KDS LEGATO 130
Isoflurane	VETEASY
Paraformaldehyde	Servicebio	G1101
Phosphate buffer	BOSTER	PYG0021
LuxoL fast bLue	Servicebio	G1030-100ML
Suture	FUSUNPHARMA	20152021225
Brain mold	Reward	68707
Electron microscope fixative	Servicebio	G1102-100ML
Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain	Sigma-Aldrich	1.01376
Anti-Myelin Basic Protein Antibody	Millipore	#AB5864
Anti-GST-P pAb	MBL	#311
Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15)	Thermo Fisher Scientific	14-5698-95
Beta Actin Monoclonal Antibody	Proteintech	66009-1-Ig
Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody	Proteintech	10458-1-AP
OLIG2 Polyclonal Antibody	Proteintech	13999-1-AP
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)	YEASEN	34206ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)	YEASEN	34412ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	YEASEN	34212ES60
HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	abclonal	AS014
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	abclonal	AS003
Adult C57BL/6 male and female mice	Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd